Hier wird ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem entwickelt, um eine synthetische Membran mit einer definierten Krümmung bereitzustellen, die die Charakterisierung von Proteinen mit Krümmungssensorik in vitro ermöglicht.
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Methodenartikel
Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Membrankrümmung spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen essentiellen Prozessen von Zellen, wie Zellmigration, Zellteilung und Vesikeltransport. Es wird nicht nur passiv durch zelluläre Aktivitäten erzeugt, sondern reguliert auch aktiv Proteininteraktionen und ist an vielen intrazellulären Signalen beteiligt. Daher ist es von großem Wert, die Rolle der Membrankrümmung bei der Regulierung der Verteilung und Dynamik von Proteinen und Lipiden zu untersuchen. In jüngster Zeit wurden viele Techniken entwickelt, um die Beziehung zwischen der gekrümmten Membran und dem Protein in vitro zu untersuchen. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken bietet die neu entwickelte nanobar-gestützte Lipiddoppelschicht (SLB) sowohl einen hohen Durchsatz als auch eine bessere Genauigkeit bei der Erzeugung von Membrankrümmungen, indem sie eine kontinuierliche Lipiddoppelschicht auf strukturierten Arrays von Nanobarren mit einer vordefinierten Membrankrümmung und lokaler flacher Kontrolle bildet. Sowohl die Lipidfluidität als auch die Proteinempfindlichkeit gegenüber gekrümmten Membranen können mittels fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung quantitativ charakterisiert werden. Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Bildung eines SLB auf hergestellten Glasoberflächen mit Nanobar-Arrays und zur Charakterisierung krümmungsempfindlicher Proteine auf solchen SLB vorgestellt. Darüber hinaus werden Protokolle für die Wiederverwendung von Nanochips und die Bildverarbeitung behandelt. Über den Nanobar-SLB hinaus ist dieses Protokoll leicht auf alle Arten von nanostrukturierten Glaschips für Krümmungsstudien anwendbar.
Einleitung
Die Membrankrümmung ist ein kritischer physikalischer Parameter einer Zelle, der bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Morphogenese, Zellteilung und Zellmigration auftritt1. Es ist heute allgemein anerkannt, dass die Membrankrümmung über ein einfaches Ergebnis zellulärer Ereignisse hinausgeht; Stattdessen hat es sich als wirksamer Regulator von Proteininteraktionen und intrazellulären Signalen herausgestellt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass mehrere Proteine, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sind, bevorzugt an die gekrümmte Membran binden, was zur Bildung eines Hotspots für Endozytose2....
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Protokoll
1. Reinigung des Nanochips
- Legen Sie den Nanochip mit der gemusterten Seite nach oben in ein 10-ml-Becherglas.
HINWEIS: Dieser Quarz-Nanochip wurde mittels Elektronenstrahllithographie hergestellt, wie zuvorbeschrieben 21. Die Geometrie und Anordnung der Nanostruktur auf dem Chip kann kundenspezifisch gestaltet werden. Die Größen der hier verwendeten Gradienten-Nanobarren betragen 2000 nm Länge, 600 nm Höhe und 100 bis 1000 nm Breite (100 nm Step-Set). - Geben Sie vorsichtig 1 ml 98% Schwefelsäure in das Becherglas und stellen Sie sicher, dass die Säure die Vorder- und Rückseite des Chips vollständ....
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Ergebnisse
Das Nanobar-Design wird für die Untersuchung positiver Krümmungssensorproteine empfohlen, die an jedem Ende einen Halbkreis mit einer Krümmung enthalten, die durch die Nanobarbreite definiert ist, und eine flache / Nullkrümmungskontrolle lokal in der Mitte (Abbildung 2A, B). Die erfolgreiche Bildung des SLB auf Nanobarren führt zu gleichmäßig verteilten Lipidmarkersignalen über die gesamte Nanobar-Oberfläche, wie in Abbildung 2C gezeigt. Signale.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Nanobar-SLB-System bietet eine einzigartige Kombination der Vorteile in mehreren bestehenden in vitro Assays. Es zeigt effizient die bevorzugte Bindung von Proteinen an stark gekrümmte Membranen als Liposomenfloatations- oder Sedimentationsassay, benötigt jedoch viel weniger Proben und bietet eine genauer definierte Krümmung auf einzelnen Nanobars 8,29. Es bietet auch eine breite Palette von präzise kontrollierten Krümmungen für den.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären kein konkurrierendes finanzielles Interesse an diesem Werk.
Danksagungen
Wir danken dem Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) und dem Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) an der Nanyang Technological University (NTU) für die Unterstützung der Nanostrukturherstellung und der REM-Bildgebung, der Protein Production Platform (PPP) an der School of Biological Sciences NTU für die Proteinreinigung und der School of Chemical and Biomedical Engineering NTU für das konfokale Mikroskop. Diese Arbeit wird finanziert durch das singapurische Bildungsministerium (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 und MOE-T2EP30220-0009), das Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), unterstützt durch MOE-Mittel im Rahmen des Research Ce....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Wasserfreies Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminiumfolie | Diamant | RN0879999FU | |
| Bernsteinfläschchen | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Gehirn PS: L-α-phosphatidylserin (Gehirn, Schwein) (Natriumsalz) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| 10 mL Becherglas | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Becherglas | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Becherglas | Schott-Duran | SCOT211065408 | Der zweite Behälter |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Wattestäbchen | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (Nickelsalz) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Ei PC: L-α-phosphatidylcholin (Ei, Huhn) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| F-BAR | Protein Production Plattform, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapur | Proteine und Peptid | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plattform, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapur | Proteine und | |
| Peptid GFP | Plattform für die Proteinproduktion, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapur | Proteine und Peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapur | Proteine und | |
| Peptide GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Wasserstoffperoxid, 30 % (ACS-zertifiziert) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR aus menschlichem FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Konfokalmikroskopie | Zeiss | LSM 800 mit Airyscan | 100x (N.A.1.4) Ölobjektiv. |
| Methanol | Fisher wissenschaftlicher | 10010240 | |
| Mini-Extraktor | Avanti Polar Lipide, Inc. | 610000-1EA | |
| 1,5 mL Mikroröhrchen | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Hydrophile Nukleporenmembran, 0,1 μ m | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) Vernetzer | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasmareiniger | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quarz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Schwefelsäure | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | ||
| Pinzette | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultraschallreiniger | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vakuum-Exsikkator | NUCERITE | 5312 | |
| Wasserbad | Julabo | TW8 |
Referenzen
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Che....
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Nachdrucke und Genehmigungen
