लेजर पोरेशन और माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) का संयोजन खेती किए गए प्राथमिक और स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की कार्रवाई क्षमता जैसी रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। तरंग आकृति मानक रिकॉर्डिंग की तुलना में परीक्षण यौगिकों की कार्रवाई के तरीके में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। यह भविष्य में कार्डियो सुरक्षा अनुसंधान को और अनुकूलित करने के लिए पैच-क्लैंप और एमईए रीडआउट को जोड़ता है।
जीवन-धमकाने वाली दवा-प्रेरित कार्डियक एरिथमिया अक्सर लंबे समय तक कार्डियक एक्शन पोटेंशिअल (एपी) से पहले होता है, आमतौर पर छोटे प्रोरैडमिक झिल्ली संभावित उतार-चढ़ाव के साथ। एपी के रिपोलराइजिंग अंश का आकार और समय पाठ्यक्रम अतालता की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए निर्णायक हो सकता है।
माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) बाह्य क्षेत्र क्षमता (एफपी) के माध्यम से कार्डियोटॉक्सिक यौगिक प्रभावों तक आसान पहुंच की अनुमति देता है। यद्यपि अनुसंधान और हृदय सुरक्षा फार्माकोलॉजी में एक शक्तिशाली और अच्छी तरह से स्थापित उपकरण, एफपी वेवफॉर्म बाह्य रिकॉर्डिंग सिद्धांत और परिणामस्वरूप आंतरिक प्रत्यावर्ती धारा (एसी) फ़िल्टरिंग के कारण मूल एपी आकार का अनुमान लगाने की अनुमति नहीं देता है।
यहां वर्णित एक नया उपकरण, अत्यधिक केंद्रित नैनोसेकंड लेजर बीम का उपयोग करके कई खेती के समय बिंदुओं पर एमईए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर उगाए गए कार्डियोमायोसाइट्स की झिल्ली को बार-बार खोल सकता है। लेजर पोरेशन के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल को एफपी से इंट्रासेल्युलर-जैसे एपी (लेजर-प्रेरित एपी, लीएपी) में बदल दिया जाता है और ट्रांससेलुलर वोल्टेज विक्षेपण की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यह इंट्रासेल्युलर एक्सेस नियमित एमईए रिकॉर्डिंग की तुलना में एपी आकार और प्रोरैडमिक क्षमता के बेहतर और अधिक संवेदनशील वर्गीकरण की अनुमति देता है। यह प्रणाली मौजूदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों के लिए एक क्रांतिकारी विस्तार है, जो एमईए-आधारित रिकॉर्डिंग (आसान, तीव्र और पुराने प्रयोगों, सिग्नल प्रसार विश्लेषण, आदि) के सभी फायदों के साथ कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देती है।
दिल की धड़कन का विद्युत योगदान कई कार्डियक चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के एक जटिल और सटीक समय पर परस्पर क्रिया के साथ-साथ मायोकार्डियम1 के माध्यम से विद्युत संकेतों के सटीक प्रसार से उत्पन्न होता है। इन बारीकी से समन्वित तंत्रों (जैसे, दवाओं का उपयोग करना) के परिवर्तन से हृदय के कार्य (यानी, जीवन-धमकाने वाली अतालता) के लिए गंभीर परिणाम हो सकते हैं। अतालता को अनियमित दिल की धड़कन के रूप में परिभाषित किया जाता है जो हृदय की सामान्य लय को बदल देता है, जिसके जीवन के लिए खतरा हो सकता है। वे या तो कार्डियक उत्तेजना की एक लहर की बिगड़ा हुई शुरुआत या कार्डियक उत्तेजना4 के असामान्य प्रसार के कारण हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप हृदय के पंपिंग तंत्र की शिथिलता होती है।
कई अत्यधिक शक्तिशाली दवा उम्मीदवारों को उनके (प्रो-) लयबद्ध क्षमता 2,3 के कारण प्रारंभिक दवा विकास चरण के दौरान आगे की जांच से बाहर रखा जाना चाहिए। वे प्रमुख कार्डियक चैनलों (जैसे, मानव ईथर-ए-गो-गो-संबंधित जीन चैनल [एचईआरजी]) को संशोधित करते हैं जो सामान्य कार्डियक एक्शन संभावित गठन और समाप्ति के साथ-साथ बाद के सिग्नल प्रसारके लिए जिम्मेदार होते हैं।
दवा कंपनियां नियमित रूप से दवा उम्मीदवारों द्वारा प्रेरित संभावित कार्डियोटॉक्सिक ऑफ-टारगेट प्रभावों की जांच के लिए पैच-क्लैंप माप या माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) का उपयोग करती हैं। पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग कार्डियक आयन चैनलों पर पदार्थों के प्रभाव को समझने और उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प 6,7 के साथ ट्रांससेलुलर कार्डियक एक्शन क्षमता का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। हालांकि, इस तकनीक के नुकसान में मैन्युअल पैच-क्लैंप के साथ कम थ्रूपुट और निलंबन में कोशिकाओं पर इस विधि की निर्भरता के कारण स्वचालन की सीमित प्रयोज्यता शामिल है। इसके अलावा, विधि की आक्रामकता के कारण पुराने प्रभावों की जांच नहीं की जा सकती है। अंत में, आम तौर पर पूरे कार्डियक सिंकिटियम के बजाय केवल एकल कोशिकाओं का एक साथ अध्ययन किया जाता है, जिससे सिग्नल प्रसार के बारे में जानकारी को संबोधित करना असंभव हो जाता है।
वोल्टेज-संवेदनशील रंजक हृदय क्रिया क्षमता और दवा-प्रेरित अतालता8 की जांच के लिए मूल्यवान हैं। वे एकल-कोशिका और सिंकिटियम गतिविधि दोनों की जांच की अनुमति देते हैं। इस विधि की कमियां रोशनी के दौरान या तो रंगों या प्रतिक्रिया उत्पाद के साइटोटोक्सिक प्रभाव हैं। उनका उपयोग तीव्र प्रयोगों के लिए किया जाता है और दीर्घकालिक अध्ययन 9,10,11 के लिए मुश्किल से लागू होते हैं। विकल्प के रूप में वोल्टेज-संवेदनशील प्रोटीन ने प्रयोज्यता और संवेदनशीलता के मामले में पिछले कुछ वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति की है, लेकिन रुचि की कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता होती है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकलतकनीकों की तुलना में उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन की कमी होती है।
सबसे हालिया सीआईपीए पहल13 से जानकारी में कहा गया है कि एमईए का व्यापक रूप से एक वैकल्पिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण के रूप में कार्डियक सुरक्षा स्क्रीनिंग में उपयोग किया जाता है क्योंकि वे कार्डियक फ़ंक्शन और सुरक्षा फार्माकोलॉजी की जांच के लिए एक शक्तिशाली और अच्छी तरह से स्थापित उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्डियोमायोसाइट्स को चिप्स के शीर्ष पर सीधे एक सिंकिटियम के रूप में खेती की जाती है, और बाह्य क्षेत्र क्षमता (एफपी) को सब्सट्रेट-एकीकृत माइक्रोइलेक्ट्रोड के माध्यम से गैर-आक्रामक रूप से दर्ज किया जाता है। यह रिकॉर्डिंग सिद्धांत कई दिनों में बढ़ी हुई थ्रूपुट स्क्रीनिंग आयोजित करने की अनुमति देता है, जो उन्हें पुराने प्रभावों पर दवा अनुसंधान के लिए उपयुक्त बनाता है। परिणामस्वरूप एफपी तरंग इंट्रासेल्युलर एपी14 का व्युत्पन्न है। बीट दर, एफपी के प्रारंभिक भाग के आयाम और एफपी अवधि जैसे पैरामीटर आसानी से सुलभ हैं। अन्य आवश्यक मानदंड जैसे कि एफपी की लंबाई और त्रिकोणीय के बीच भेदभाव (प्रोएरिथमिया16,17 का एक महत्वपूर्ण मार्कर) तकनीक के एसी फ़िल्टरिंग प्रभाव के कारण दुर्गम हैं। इसके अलावा, अन्य छोटी प्रोरैडमिक घटनाओं का पता लगाना जैसे कि प्रारंभिक और विलंबित आफ्टरडिपोलराइजेशन (ईएडी और डीएडी, क्रमशः) अक्सर उनके छोटे आयाम के कारण आसानी से अनदेखा किया जाता है।
यहां हम कार्डियोमायोसाइट्स की झिल्ली को खोलकर इंट्रासेल्युलर झिल्ली क्षमता तक पहुंच प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इंट्रासेल डिवाइस (इसके बाद इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग डिवाइस के रूप में संदर्भित) एक विशिष्ट भौतिक घटना (सतह प्लास्मोन अनुनाद) 18 के माध्यम से अत्यधिक केंद्रित नैनोसेकंड लेजर बीम का उपयोग करके एमईए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर उगाए गए कार्डियोमायोसाइट्स के बार-बार झिल्ली खोलने की अनुमति देता है। नतीजतन, रिकॉर्डिंग एक नियमित एफपी से इंट्रासेल्युलर जैसे एपी (लेजर-प्रेरित एपी, लीएपी) में बदल जाती है। प्रोटोकॉल दिखाता है कि यह तरंग के गतिज पहलुओं तक पहुंच प्राप्त करने की अनुमति देता है जिसे आसानी से एफपी का विश्लेषण करके कैप्चर नहीं किया जा सकता है। यह विधि पारंपरिक इंट्रासेल्युलर पैच-क्लैंप और एमईए रिकॉर्डिंग के बीच एक पुल का प्रतिनिधित्व करती है। इसलिए प्रौद्योगिकी वर्तमान हृदय सुरक्षा मूल्यांकन विधियों का एक शक्तिशाली विस्तार है।
यह अभिनव विधि कार्डियोएक्टिव फार्माकोलॉजिकल टूल यौगिकों के आवेदन के दौरान कार्डियक एक्शन क्षमता के फार्माकोलॉजिकल मॉड्यूलेशन की जांच करने का एक नया तरीका प्रदर्शित करती है।
शास्त्रीय एमईए रिकॉर्डिंग एफपी रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है, जो कार्डियक एपी14 का व्युत्पन्न है। यह अप्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग डी- और रिपोलराइजेशन के समय पाठ्यक्रम को जोड़ती है और इस तरह एपी की आवश्यक विशेषताओं को समाप्त करती है। इसके अलावा, हालांकि एपी का ट्रांससेलुलर वोल्टेज परिवर्तन आमतौर पर लगभग 100 एमवी के मूल्यों तक पहुंचता है, समग्र एफपी आयाम तुलनात्मक रूप से कम रहता है, जिसमें कई 100 μV और कम एकल-अंकीय mV मानों के बीच चरम आयाम होते हैं। रिकॉर्डिंग सिद्धांत के कारण, पुनर्ध्रुवण चरण छोटा है; कई मामलों में, यह केवल पता लगाने योग्य है और अक्सर अस्पष्ट आकार का होता है, जिससे एफपी के अंत को परिभाषित करना मुश्किल हो जाता है। कोशिका झिल्ली का उद्घाटन हमें इंट्रासेल्युलर वोल्टेज तक पहुंच प्राप्त करने की अनुमति देता है, जिससे कार्डियक एपी के समय पाठ्यक्रम को उजागर किया जा सकता है। एफपी रिकॉर्डिंग की तुलना में इस रिकॉर्डिंग विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, सिग्नल आयाम अधिक प्रमुख है, जो एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है। दूसरे, तरंग के परिणामस्वरूप पुनर्ध्रुवण का बेहतर पता चलता है। तीसरा, पुनर्ध्रुवण चरण का आकार परीक्षण यौगिक की कार्रवाई के तरीके में अंतर्दृष्टि का योगदान देता है, जो सिग्नल विश्राम की तीव्रता द्वारा प्रदान किया जाता है। और अंत में, यह विधि महत्वपूर्ण प्रतिकूल दवा प्रभावों का पता लगाने के लिए एक बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है, जो लीएपी में ईएडी की घटना के लिए चित्रा 6 में प्रदर्शित रिकॉर्डिंग उदाहरण द्वारा प्रदर्शित होती है, लेकिन एफपी में नहीं।
अब तक, इंट्रासेल्युलर एपी तक पहुंच प्राप्त करने के दो तरीके हैं। पहला एकइलेक्ट्रोपोरेशन 26,27 द्वारा प्राप्त किया जाता है। यहां, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू छोटी और मजबूत वोल्टेज दालें कोशिका झिल्ली28 को खोल सकती हैं। दूसरी संभावना लेजर पल्स के माध्यम से झिल्ली खोलना है, जो सतह प्लास्मोन अनुनाद नामक एक भौतिक घटना का उपयोग करता है, जैसा कि यहां दिखाया गया है। इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में फायदों में से एक लगातार उद्घाटन की बढ़ती संभावना है। अत्यधिक केंद्रित लेजर स्पॉट (1-3 μm) के कारण यह प्रभाव बहुत स्थानीय रूप से रुचि के इलेक्ट्रोड तक सीमित है। दिलचस्प बात यह है कि लीएपी की शुरुआत ने खेती किए गए सिंकिटियम के सिग्नल प्रसार को नहीं बदला। यह इंगित करता है कि, हालांकि कोशिका अखंडता क्षतिग्रस्त है, कार्डियोमायोसाइट्स झिल्ली में छेद के माध्यम से विध्रुवण नहीं करते हैं।
इस विधि की सीमाएँ हैं। इलेक्ट्रोपोरेशन की तरह, झिल्ली खोलना, ज्यादातर मामलों में, पूरे प्रयोगात्मक पाठ्यक्रम में नहीं रहता है। विशिष्ट सेल प्रकार के ब्याज के स्थिर उद्घाटन के लिए आवश्यक लेजर पल्स की न्यूनतम शक्ति और अवधि सेटिंग्स को प्रयोगों से पहले स्वतंत्र रूप से परिभाषित करने की आवश्यकता है। हमने पाया (नहीं दिखाया गया) कि पैरामीटर विभिन्न सेल प्रकारों (हमारे मामले में, कई एचआईपीएस-व्युत्पन्न और प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स) के बीच काफी भिन्न होते हैं। यह यौगिक परीक्षण प्रयोग के दौरान कोशिकाओं पर अनावश्यक तनाव से बचाता है और इसके परिणामस्वरूप अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा होता है। कोशिकाओं और इलेक्ट्रोड पर स्पष्ट ध्यान देने के लिए जेड-अक्ष को समायोजित करना महत्वपूर्ण महत्व का है। एक अकेंद्रित कैमरा चित्र एक उप-मानक स्तर पर स्थित एक लेजर स्पॉट में पैदा होता है, जिसके परिणामस्वरूप संभवतः कोशिका झिल्ली को खोलने में असमर्थता होती है। यहां तक कि सबसे अच्छे समायोजित मापदंडों के साथ, लीएपी प्रभाव क्षणिक है, और आयाम समय के साथ कम हो जाता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर स्पेस तक पहुंच लीएपी प्रेरण के बीच भिन्न होती है, दोनों एक ही इलेक्ट्रोड पर लगातार उद्घाटन के भीतर और इलेक्ट्रोड के बीच। इसके परिणामस्वरूप लीएपी आयाम की उच्च परिवर्तनशीलता होती है। कारण अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। संभावित स्पष्टीकरण में यांत्रिक मुद्दे शामिल हैं जैसे कि लेजर फोकस का बहाव या झिल्ली खोलने का विभिन्न उपकोशिकीय स्थानीयकरण। यह इस समय परीक्षण यौगिकों के आयाम प्रभावों के विश्लेषण को जटिल बनाता है। इसके अलावा, एमईए प्रणाली द्वारा विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए अपरिहार्य बेसलाइन बहाव की भरपाई के लिए उच्च पास फ़िल्टरिंग की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली में, इस फ़िल्टरिंग को 0.1 हर्ट्ज (इस प्रणाली के लिए उपलब्ध सबसे कम फ़िल्टर सेटिंग) पर सेट किया गया था, पठार चरण के दौरान फ़िल्टरिंग प्रभाव अभी भी दिखाई दे रहे थे, जिसके परिणामस्वरूप कार्डियक एपी के पठार चरण के दौरान बेसलाइन की ओर वोल्टेज विक्षेपण की धीमी प्रवृत्ति थी। यह विशेष रूप से आईपीएससी-व्युत्पन्न आईसेल कार्डियोमायोसाइट्स2 जैसे बड़े पैमाने पर लंबे अंतर्निहित एपी के साथ समस्याग्रस्त है, जो पहले से ही नियंत्रण स्थितियों के तहत एपी >700 एमएस उत्पन्न करते हैं। कम फ़िल्टरिंग वाले सिस्टम का उपयोग एपी के आकार को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकता है और पुनर्ध्रुवण चरण के समय पाठ्यक्रम तक बेहतर पहुंच की अनुमति दे सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक अध्ययन के दौरान इंट्रासेल सिस्टम को उधार देने के लिए फोरस बायोसिस्टम्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। वे तकनीकी सहायता के लिए हे इन चांग को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को अनुदान समझौते संख्या 964518 (टॉक्सफ्री), यूरोपीय संघ क्षितिज यूरोप यूरोपीय नवाचार परिषद कार्यक्रम, परियोजना सिमुलटॉक्स (अनुदान समझौता संख्या 101057769) और आर्थिक मामलों, श्रम और पर्यटन के लिए बाडेन-वुर्टेमबर्ग के राज्य मंत्रालय से अनुदान समझौते संख्या 964518 (टॉक्सफ्री) के तहत वित्त पोषण प्राप्त हुआ है।
1 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890301 | |
6 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 7600069 | |
DMSO | Merck KGaA | 20-139 Sigma-Aldrich |
solvent for drugs |
Dofetilide | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
D-100 | Drug-Measurement |
dPBS | Fisher Scientific GmbH | 12037539 | Coating |
E4031 | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
E-500 | Drug-Measurement |
Falcon | Fisher Scientific GmbH | 10788561 | |
FB Alps version 0.5.005 | Foresee Biosystems | ||
Fibronectin | Merck KGaA | 11051407001 | Coating |
iCell cardiomyocytes | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
C1016 | |
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
Isopropanol | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN09.1 | For cleaning of MEA contact pads |
Maintenance Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
#M1003 | For cell-culture |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems MCS GmbH | Data export | |
MC_Rack | Multi Channel Systems MCS GmbH | MEA recording | |
MEA 2100 – 2×60 – system | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890485 | For MEA-recordings |
Nifedipine | Merck KGaA | N7634 Sigma-Aldrich |
Drug-Measurement |
Plating Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
M1001 | For cell-culture |
Tergazyme | VWR International, LLC | 1304-1 | cleaning of MEAs |