Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Summary

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

Abstract

A arritmia cardíaca induzida por drogas com risco de vida é frequentemente precedida por potenciais de ação cardíaca (PA) prolongados, comumente acompanhados por pequenas flutuações do potencial de membrana proarrítmica. A forma e o curso temporal da fração repolarizante da PA podem ser fundamentais para a presença ou ausência de arritmia.

As matrizes de microeletrodos (MEA) permitem fácil acesso aos efeitos de compostos cardiotóxicos através de potenciais de campo extracelular (FP). Embora seja uma ferramenta poderosa e bem estabelecida em pesquisa e farmacologia de segurança cardíaca, a forma de onda FP não permite inferir a forma original da PA devido ao princípio de registro extracelular e à filtragem intrínseca de corrente alternada (CA) resultante.

Um novo dispositivo, descrito aqui, pode abrir repetidamente a membrana de cardiomiócitos cultivados em cima dos eletrodos MEA em vários pontos de tempo de cultivo, usando um feixe de laser de nanossegundos altamente focado. A poração do laser resulta na transformação do sinal eletrofisiológico de FP para APs intracelulares (AP induzida por laser, liAP) e permite o registro de deflexões de tensão transcelular. Esse acesso intracelular permite uma melhor descrição da forma da PA e uma classificação melhor e mais sensível dos potenciais proarrítmicos do que os registros regulares de MEA. Este sistema é uma extensão revolucionária dos métodos eletrofisiológicos existentes, permitindo uma avaliação precisa do efeito cardiotóxico com todas as vantagens das gravações baseadas em MEA (experimentos fáceis, agudos e crônicos, análise de propagação de sinal, etc.).

Introduction

A contribuição elétrica de um batimento cardíaco resulta de uma interação complexa e precisamente cronometrada de muitos canais e transportadores cardíacos, bem como da propagação precisamente sintonizada de sinais elétricos através do miocárdio¹. A alteração desses mecanismos estreitamente coordenados (por exemplo, o uso de drogas) pode resultar em consequências graves para a função do coração (ou seja, arritmia com risco de vida)^2,3. As arritmias são definidas como batimentos cardíacos irregulares que alteram o ritmo normal do coração, o que pode ter consequências fatais. Eles podem ser causados tanto pelo início prejudicado de uma onda de excitação cardíaca quanto pela propagação anormal da excitação cardíaca⁴, o que, por sua vez, resulta em uma disfunção do mecanismo de bombeamento do coração.

Muitos candidatos a fármacos altamente potentes devem ser excluídos de investigações futuras durante a fase inicial de desenvolvimento de fármacos devido ao seu potencial (pró-) arrítmico ^2,3. Eles modulam os principais canais cardíacos (por exemplo, o canal genético humano relacionado ao éter-a-go-go-go [hERG]) que são responsáveis pela formação e terminação do potencial de ação cardíaca normal, bem como pela subsequente propagação do sinal⁵.

As empresas farmacêuticas usam rotineiramente medições de patch-clamp ou matrizes de microeletrodos (MEA) para investigar potenciais efeitos cardiotóxicos fora do alvo induzidos por candidatos a medicamentos. Os registros patch-clamp permitem decifrar o impacto de substâncias nos canais iônicos cardíacos e analisar o potencial de ação cardíaca transcelular com alta resolução espaço-temporal ^6,7. No entanto, as desvantagens desta técnica incluem baixo rendimento com patch-clamp manual e aplicabilidade limitada de automação devido à dependência deste método de células em suspensão. Além disso, os efeitos crônicos não podem ser investigados devido à invasividade do método. Finalmente, normalmente apenas células únicas são estudadas simultaneamente, em vez de todo o sincício cardíaco, tornando impossível abordar informações sobre a propagação do sinal.

Corantes sensíveis à voltagem são valiosos para investigar de forma não invasiva potenciais de ação cardíaca e arritmias induzidas por drogas⁸. Eles permitem a investigação da atividade de célula única e do sincício. As desvantagens deste método são os efeitos citotóxicos dos corantes em si ou do produto de reação durante a iluminação. São utilizados para experimentos agudos e dificilmente aplicáveis para estudos de longo prazo 9,10,11. As proteínas sensíveis à voltagem como alternativas têm avançado significativamente nos últimos dois anos em termos de usabilidade e sensibilidade, mas requerem modificação genética das células de interesse e carecem de alta resolução temporal em comparação com as técnicas eletrofisiológicas¹².

Informações da mais recente iniciativa CiPA¹³ afirmam que os MEAs são amplamente utilizados em exames de segurança cardíaca como uma abordagem eletrofisiológica alternativa, pois representam uma ferramenta poderosa e bem estabelecida para investigar a função cardíaca e a farmacologia de segurança. Os cardiomiócitos são cultivados como um sincício diretamente em cima dos chips, e os potenciais de campo extracelular (PFs) são registrados de forma não invasiva através de microeletrodos integrados ao substrato. Este princípio de gravação permite a realização de rastreios de maior rendimento ao longo de vários dias, o que os torna adequados para pesquisas farmacêuticas sobre efeitos crônicos. A forma de onda FP resultante é uma derivada da AP intracelular¹⁴. Parâmetros como a taxa de batida, a amplitude da parte inicial do PF e a duração do FP são facilmente acessíveis¹⁵. Outros critérios essenciais, como a diferenciação entre prolongamento e triangulação do PF (um importante marcador de proarritmia^16,17) são inacessíveis devido ao efeito filtrante da CA da técnica. Além disso, a detecção de outros pequenos eventos proarrítmicos, como pós-despolarizações precoces e tardias (EAD e DAD, respectivamente) são muitas vezes facilmente negligenciados devido à sua pequena amplitude.

Aqui descrevemos um método para obter acesso ao potencial de membrana intracelular através da abertura da membrana dos cardiomiócitos. O dispositivo IntraCell (doravante denominado dispositivo de gravação intracelular) permite repetidas aberturas de membrana de cardiomiócitos cultivadas em cima dos eletrodos MEA utilizando um feixe de laser de nanossegundos altamente focado através de um fenômeno físico específico (ressonância plasmônica de superfície)¹⁸. Como resultado, a gravação transita de um FP regular para um AP intracelular (AP induzido por laser, liAP). O protocolo mostra como isso permite obter acesso a aspectos cinéticos da forma de onda que não podem ser facilmente capturados pela análise de PFs. Este método representa uma ponte entre o patch-clamp intracelular tradicional e as gravações de MEA. A tecnologia é, portanto, uma poderosa extensão dos atuais métodos de avaliação de segurança cardíaca.

Protocol

1. Preparação de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas

NOTA: Os cardiomiócitos^{iCell 2} (referidos como cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas [iPSCs]) foram preparados de acordo com o protocolo fornecido pelo fornecedor. O protocolo será resumido brevemente na seção a seguir.

1. Descongelar o meio de descongelamento e de manutenção a 4 °C durante 24 horas antes da utilização.
2. Preparar o revestimento de fibronectina dissolvendo fibronectina estéril em água estéril a uma concentração de 1 mg/mL. Congele esse estoque em alíquotas (por exemplo, 25 μL por alíquota). Diluir a solução-mãe alíquota 1:20 em solução salina balanceada de Dulbecco (dPBS) estéril.
3. Revestir os campos dos eletrodos dos MEAs previamente autoclavados sob o exaustor de fluxo laminar, em termos de gotículas em condições estéreis com fibronectina usando uma pipeta de 10 μL. Para isso, solte 5 μL da solução de revestimento de fibronectina nos campos do eletrodo e observe a formação de uma gotícula no topo da área do eletrodo. Certifique-se de não tocar nos eletrodos sensíveis.
   NOTA: Para manter as condições estéreis, transfira o chip MEA para uma placa de Petri estéril antes de removê-lo do exaustor de fluxo laminar.
4. Incubar os MEAs revestidos durante 1 h a 37 °C numa incubadora de preferência.
5. Descongelar o criovial contendo os cardiomiócitos em banho-maria a aproximadamente 37 °C durante 2 minutos até que reste apenas um pouco de cristal de gelo. Transfira a solução celular suavemente para um tubo de 50 ml.
6. Adicionar 1 ml de meio de chapeamento ao criovial vazio. Transfira a solução gota a gota durante um período de tempo de 90 s para o tubo de 50 mL para reduzir o choque osmótico. Adicione suavemente mais 8 mL de meio de chapeamento no tubo.
7. Misture cuidadosamente a suspensão celular utilizando uma pipeta de 10 ml. Calcule o número total de células viáveis usando citometria de fluorescência automatizada. O número deve estar próximo do número na ficha técnica fornecida pelo fabricante.
8. Gire a solução celular para baixo por 3 min a 200 x g à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante por aspiração usando uma pipeta de vidro presa a um sistema de bombeamento. Ajuste o número de células entre 6.000 e 15.000 células viáveis/μL.
   NOTA: O número de células geralmente está no intervalo fornecido acima, mas pode variar dependendo do respectivo fornecedor.
9. Remova a solução de revestimento que foi aplicada na etapa 1.3 da área do eletrodo MEA usando uma pipeta de 10 μL diretamente antes da semeadura da célula. Semeia as células imediatamente após a remoção para evitar a secagem do revestimento. Para isso, semeie as células gota a gota a 4 μL para MEAs de 6 poços e MEAs de 1 poço nos campos de eletrodos da mesma maneira que feito com o revestimento.
10. Permitir que as células adiram por 1 h na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ antes de encher os poços com o meio de revestimento estéril aquecido a aproximadamente 37 °C a 200 μL para MEA de 6 poços e 1 mL para MEA de poço único sob o exaustor de fluxo laminar.
11. Realizar uma troca completa do meio 48 h após o revestimento sob o exaustor de fluxo laminar. Para isso, remova o meio de revestimento por aspiração usando uma pipeta de vidro presa a um sistema de bombeamento. Em seguida, adicione 200 μL de meio de manutenção estéril aquecido a 37 °C aos poços.
12. Realize mudanças completas de mídia a cada dois dias.
13. Comece a medir as células 5-8 dias após o descongelamento. Realize uma mudança completa de meio 2 h antes de iniciar os experimentos.

2. Gravações MEA

NOTA: O dispositivo usado para transformar o sinal FP em liAP consiste em um microscópio vertical e um laser de 1064 nm.

1. Coloque o sistema MEA em cima do dispositivo com o suporte do chip MEA centralizado sobre o orifício da objetiva. Posicione o MEA configurado de modo que a objetiva esteja diretamente sob o orifício do sistema MEA para permitir que o laser se concentre nos eletrodos.
2. Transfira o chip MEA com as células cultivadas da incubadora para a configuração MEA 15 minutos antes do registro, permitindo que as células se recuperem da perturbação mecânica.
3. Limpe cuidadosamente as almofadas e pinos de contato usando isopropanol e um cotonete para diminuir os níveis de ruído. Coloque o MEA cuidadosamente na configuração do MEA. Posicione o chip MEA com o logotipo na parte inferior do lado superior esquerdo (MEA de 6 poços) ou com o eletrodo de referência à esquerda (MEA de poço único).
4. Ajuste o aquecimento integrado ao sistema MEA para 38 °C. Coloque uma pequena câmara em cima do chip MEA para perfundir constantemente as células com carbogênio umidificado (5% CO 2 e 95% O₂) para recriar as condições da incubadora e evitar a evaporação.
5. Feche a tampa do dispositivo. O interruptor de segurança integrado só permite que o laser seja ativado se a tampa estiver fechada sobre o chip MEA. Defina o filtro do sistema MEA usando o programa de configuração MEA para 0,1 Hz ou menos high-pass e 3.500 Hz low-pass.
6. Use o software MC_Rack (software de gravação) ou qualquer software alternativo para gravação. Ajuste a faixa de entrada de acordo com suas necessidades, garantindo que o sinal não satura o amplificador e a taxa de amostragem (por exemplo, 20 kHz). Use a função de exibição de longo prazo do software para verificar a gravação.

3. Poração celular induzida por laser

1. Depois de inserir o chip MEA na configuração MEA e configurar o software, inicialize a mecânica a laser usando o software FB Alps (software de inicialização).
2. Primeiro, clique no botão Inicialização . No final da inicialização, o ponto laser virtual estará no poço D para um MEA de 6 poços e no canto inferior esquerdo para um MEA de poço único, respectivamente.
3. Mova o ponto laser virtual com Ctrl + clique do mouse no meio do eletrodo D5 e ajuste o foco. Ajuste o foco com Ctrl + rolagem com a roda do mouse.
4. Pressione o botão Set P1 ( Definir P1). O ponto laser virtual se moverá automaticamente para o poço F. Repita o processo com o eletrodo F5 e selecione Definir P2.
5. Após este procedimento, o ponto laser se moverá para o poço B. Repita o mesmo processo com o eletrodo B5 e pressione Set P3 no software. O sistema agora está alinhado.
6. Ajuste a potência do laser e o tempo de processo de acordo com as necessidades de suas células. Aqui, foram utilizados 40% de potência e 25% de tempo de processo.
7. Para ativar o laser, clique no botão Laser Off , que aparecerá como laser ligado. Mude para o software de gravação, escolha um nome de arquivo e clique no botão Gravação Vermelha seguido pelo botão Reproduzir na parte superior da janela para gravar a medição.
8. Registre uma linha de base de 60 s antes de abrir as células com o laser. Volte para o software de inicialização.
9. Desative os eletrodos a serem excluídos pelo laser no mapa virtual do lado direito usando Ctrl + clique do mouse. Selecione os eletrodos de interesse ativando-os na representação da matriz no lado direito da janela do software.
10. Para iniciar o laser, use Alt + clique do mouse e selecione o eletrodo central deste poço. Isso inicia o laser para abrir automaticamente as células em cada eletrodo deste poço. Repita para cada poço. O laser abrirá automaticamente todos os eletrodos previamente ativados do poço selecionado.

4. Manuseamento e aplicação de medicamentos

1. Prepare todas as substâncias a serem usadas para testes de drogas recentemente no dia das medições. Certifique-se de que a concentração final de aplicação seja 10 vezes maior no meio para fazer uma diluição de 1:10 nos poços.
2. Dissolva a nifedipina, E4031 e dofetilida primeiro em DMSO em concentração de mM e, em seguida, em meio a 10x da concentração desejada. Nunca exceda uma concentração final de DMSO de 0,1% no poço.
3. Registre a atividade de linha de base por 60 s. Inicie a poração induzida por laser, conforme descrito na etapa 3 do protocolo, resultando em uma transformação do FP em forma de liAP.
4. Aplique todos os medicamentos como concentração única por poço. Remova 20 μL de meio por poço para MEAs de 6 poços e 100 μL para MEAs de poço único, respectivamente. Adicione 20 μL ou 100 μL, dependendo do tipo de MEA, da solução-mãe da droga a ser medida no poço e cuidadosamente pipete para cima e para baixo 2-3 vezes. Realizar pelo menos três repetições de cada droga e concentração para alcançar relevância estatística.
5. Deixe os compostos lavarem por 300 s. Durante esse tempo, a forma liAP pode se transformar novamente em forma de FP. Novamente, induza a poração induzida por laser e registre possíveis efeitos induzidos por compostos no liAP por mais 60 s.

5. Exportação de dados

1. Selecione os eletrodos relevantes reproduzindo a gravação no software de gravação. Use MC_DataTool para converter arquivos MC_Rack em arquivos ASCII .txt.
2. Clique em Arquivo > Abrir MCD > Selecione um arquivo MC_Rack. Clique no botão txt (texto azul).
3. Selecione um eletrodo. O eletrodo selecionado será mostrado na lista do lado direito.
4. Clique em Procurar para selecionar a pasta e alterar o nome do novo arquivo .txt. Clique em Salvar.
5. Desmarque o eletrodo exportado e selecione o próximo eletrodo a ser exportado. Repita o procedimento para todos os eletrodos de interesse.

6. Tratamento de dados e análise estatística

1. Importe rastreamentos binários convertidos em R¹⁹. Visualize/analise os dados usando scripts personalizados contendo os seguintes pacotes: dplyr, tidyr e ggplot2^20,21,22.

Representative Results

Discussion

Este método inovador demonstra uma nova forma de investigar in vitro a modulação farmacológica do potencial de ação cardíaca durante a aplicação de compostos de ferramentas farmacológicas cardioativas.

As gravações clássicas de MEA permitem gravações de FP, que são a derivada da PA cardíaca¹⁴. Esse registro indireto envolve o curso temporal da despolarização e, assim, elimina características essenciais do AP. Além disso, embora a mudança de tensão transcelular de um AP atinja tipicamente valores de aproximadamente 100 mV, a amplitude geral do FP permanece comparativamente baixa, com amplitudes de pico entre vários 100 μV e baixos valores de mV de um dígito. Devido ao princípio de registro, a fase de repolarização é pequena; em muitos casos, é meramente detectável e muitas vezes de forma pouco clara, dificultando a definição do final do PF. A abertura da membrana celular nos permite obter acesso à voltagem intracelular, descobrindo assim o curso temporal da PA cardíaca. Existem várias vantagens deste método de gravação em comparação com as gravações FP. Em primeiro lugar, a amplitude do sinal é mais proeminente, proporcionando uma relação sinal-ruído superior. Em segundo lugar, a forma de onda resulta em uma melhor detecção da repolarização. Em terceiro lugar, a forma da fase de repolarização contribui com insights sobre o modo de ação do composto de teste, fornecido pela inclinação do relaxamento do sinal. E, por fim, esse método oferece uma sensibilidade aprimorada para detectar efeitos adversos críticos de medicamentos, demonstrada pelo exemplo de registro exibido na Figura 6 para a ocorrência de EADs no liAP, mas não no FP.

Até agora, existem duas maneiras de obter acesso à PA intracelular. A primeira é obtida por eletroporação^26,27. Aqui, pulsos de tensão curtos e fortes aplicados através dos eletrodos de gravação podem abrir a membrana celular²⁸. A segunda possibilidade é a abertura da membrana através de um pulso de laser, fazendo uso de um fenômeno físico denominado ressonância plasmônica de superfície, como demonstrado aqui. Uma das vantagens em comparação com a eletroporação é o aumento da probabilidade de aberturas consecutivas. Devido ao ponto laser altamente focado (1-3 μm), este efeito é muito limitado localmente ao eletrodo de interesse. Curiosamente, o início do liAP não alterou a propagação do sinal do sincício cultivado. Isso indica que, embora a integridade celular esteja danificada, os cardiomiócitos não parecem se despolarizar através do orifício na membrana.

Existem limitações para este método. Como com a eletroporação, a abertura da membrana, na maioria dos casos, não dura durante todo o curso experimental. As configurações mínimas de potência e duração do pulso de laser necessárias para a abertura estável do tipo específico de célula de interesse precisam ser definidas independentemente antes dos experimentos. Descobrimos (não mostrado) que os parâmetros variam drasticamente entre diferentes tipos de células (no nosso caso, vários cardiomiócitos primários e derivados de hiPS). Isso evita o estresse desnecessário sobre as células durante o experimento de teste composto e resulta em dados mais confiáveis e reprodutíveis. É de importância crítica ajustar o eixo z para fornecer um foco claro nas células e nos eletrodos. Uma imagem de câmera desfocada produz em um ponto de laser localizado em um nível abaixo do ideal, potencialmente resultando na incapacidade de abrir a membrana celular. Mesmo com os parâmetros mais bem ajustados, o efeito liAP é transitório e a amplitude diminui ao longo do tempo. Além disso, o acesso ao espaço intracelular das células varia entre as induções de liAP, tanto dentro de aberturas consecutivas no mesmo eletrodo quanto entre eletrodos. Isso resulta em alta variabilidade da amplitude do liAP. A razão ainda não é totalmente compreendida. Possíveis explicações incluem problemas mecânicos, como uma deriva do foco do laser ou localização subcelular diferente da abertura da membrana. Isso torna a análise dos efeitos de amplitude dos compostos de teste complicada neste momento. Além disso, o registro da atividade elétrica por um sistema MEA requer filtragem passa-alta para compensar a inevitável deriva da linha de base. Embora no sistema aqui utilizado, essa filtragem tenha sido ajustada para 0,1 Hz (a menor configuração de filtro disponível para este sistema), os efeitos de filtragem durante a fase de platô ainda eram visíveis, resultando em uma tendência lenta da deflexão de voltagem em direção à linha de base durante a fase de platô da PA cardíaca. Isso é especialmente problemático com APs subjacentes extensivamente longos, como os cardiomiócitos iCell² derivados de iPSC usados aqui, que já geram AP >700 ms sob condições de controle. O uso de sistemas com menor filtragem pode conservar melhor a forma do AP e permitir um acesso ainda melhor ao curso temporal da fase de repolarização.

Materials

1 well MEA chip	Multi Channel Systems MCS GmbH	890301
6 well MEA chip	Multi Channel Systems MCS GmbH	7600069
DMSO	Merck KGaA	20-139<br/> Sigma-Aldrich	solvent for drugs
Dofetilide	ALOMONE LABS<br/> ISRAEL HEADQUARTERS	D-100	Drug-Measurement
dPBS	Fisher Scientific GmbH	12037539	Coating
E4031	ALOMONE LABS<br/> ISRAEL HEADQUARTERS	E-500	Drug-Measurement
Falcon	Fisher Scientific GmbH	10788561
FB Alps version 0.5.005	Foresee Biosystems
Fibronectin	Merck KGaA	11051407001	Coating
iCell cardiomyocytes	FUJIFILM Cellular<br/> Dynamics, Inc. (FCDI)	C1016
IntraCell	Foresee Biosystems
Isopropanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	CN09.1	For cleaning of MEA contact pads
Maintenance Medium	FUJIFILM Cellular<br/> Dynamics, Inc. (FCDI)	#M1003	For cell-culture
MC_Data Tool	Multi Channel Systems MCS GmbH		Data export
MC_Rack	Multi Channel Systems MCS GmbH		MEA recording
MEA 2100 – 2×60 – system	Multi Channel Systems MCS GmbH	890485	For MEA-recordings
Nifedipine	Merck KGaA	N7634<br/> Sigma-Aldrich	Drug-Measurement
Plating Medium	FUJIFILM Cellular<br/> Dynamics, Inc. (FCDI)	M1001	For cell-culture
Tergazyme	VWR International, LLC	1304-1	cleaning of MEAs