Kombinasjonen av laserporering og mikroelektrodearrayer (MEA) tillater handlingspotensiallignende opptak av dyrkede primære og stamcelleavledede kardiomyocytter. Bølgeformformen gir overlegen innsikt i testforbindelsenes virkemåte enn standardopptak. Den kobler patch-clamp og MEA-avlesning for å optimalisere kardiosikkerhetsforskningen ytterligere i fremtiden.
Livstruende legemiddelindusert hjertearytmi innledes ofte av langvarige hjertevirkningspotensialer (AP), ofte ledsaget av små proarytmiske membranpotensialfluktuasjoner. Formen og tidsforløpet til den repolariserende fraksjonen av AP kan være avgjørende for tilstedeværelse eller fravær av arytmi.
Mikroelektrodearrayer (MEA) gir enkel tilgang til kardiotoksiske forbindelseseffekter via ekstracellulære feltpotensialer (FP). Selv om det er et kraftig og veletablert verktøy innen forskning og hjertesikkerhetsfarmakologi, tillater ikke FP-bølgeformen å utlede den opprinnelige AP-formen på grunn av det ekstracellulære opptaksprinsippet og den resulterende intrinsiske vekselstrømfiltreringen (AC).
En ny enhet, beskrevet her, kan gjentatte ganger åpne membranen til kardiomyocytter dyrket på toppen av MEA-elektrodene ved flere dyrkingstidspunkter, ved hjelp av en svært fokusert nanosekund laserstråle. Laserporasjonen resulterer i å transformere det elektrofysiologiske signalet fra FP til intracellulære lignende AP-er (laserindusert AP, liAP) og muliggjør registrering av transcellulære spenningsavbøyninger. Denne intracellulære tilgangen gir en bedre beskrivelse av AP-formen og en bedre og mer sensitiv klassifisering av proarytmiske potensialer enn vanlige MEA-opptak. Dette systemet er en revolusjonerende utvidelse av de eksisterende elektrofysiologiske metodene, og tillater nøyaktig evaluering av kardiotoksisk effekt med alle fordeler med MEA-baserte opptak (enkle, akutte og kroniske eksperimenter, signalutbredelsesanalyse, etc.).
Det elektriske bidraget til et hjerteslag skyldes et komplekst og nøyaktig tidsbestemt samspill mellom mange hjertekanaler og transportører, samt nøyaktig innstilt forplantning av elektriske signaler gjennom myokardiet1. Endring av disse tett koordinerte mekanismene (f.eks. bruk av legemidler) kan føre til alvorlige konsekvenser for hjertefunksjonen (dvs. livstruende arytmi)2,3. Arytmier er definert som uregelmessige hjerteslag som endrer normal rytme i hjertet, noe som kan ha livstruende konsekvenser. De kan være forårsaket enten av nedsatt initiering av en bølge av hjerteeksitasjon eller ved unormal forplantning av hjerteeksitasjon4, noe som igjen resulterer i en dysfunksjon av hjertets pumpemekanisme.
Mange svært potente legemiddelkandidater må utelukkes fra videre undersøkelser i den tidlige legemiddelutviklingsfasen på grunn av deres (pro-) arytmiske potensial 2,3. De modulerer viktige hjertekanaler (f.eks. den humane eter-en-go-go-relaterte genkanalen [hERG]) som er ansvarlige for normal dannelse og avslutning av hjertevirkningspotensial, samt påfølgende signalutbredelse5.
Farmasøytiske selskaper bruker rutinemessig patch-clamp-målinger eller mikroelektrodearrayer (MEA) for å undersøke potensielle kardiotoksiske off-target-effekter indusert av legemiddelkandidater. Patch-klemmeopptak gjør det mulig å dechiffrere virkningen av stoffer på hjerteionkanaler og å analysere det transcellulære hjertehandlingspotensialet med høy spatio-temporal oppløsning 6,7. Ulemper ved denne teknikken inkluderer imidlertid lav gjennomstrømning med manuell patch-klemme og begrenset anvendelighet av automatisering på grunn av avhengigheten av denne metoden på celler i suspensjon. Videre kan kroniske effekter ikke undersøkes på grunn av metodens invasivitet. Til slutt studeres vanligvis bare enkeltceller samtidig i stedet for hele hjertesyncytiumet, noe som gjør det umulig å adressere informasjon om signalutbredelse.
Spenningsfølsomme fargestoffer er verdifulle for ikke-invasiv undersøkelse av hjertehandlingspotensialer og legemiddelinduserte arytmier8. De tillater undersøkelse av både enkeltcelle- og syncytiumaktivitet. Ulemper ved denne metoden er cytotoksiske effekter av enten fargestoffene i seg selv eller av reaksjonsproduktet under belysning. De brukes til akutte eksperimenter og er neppe anvendelige for langtidsstudier 9,10,11. Spenningsfølsomme proteiner som alternativer har gjort betydelige fremskritt de siste par årene når det gjelder brukervennlighet og følsomhet, men krever genetisk modifisering av cellene av interesse og mangler høy tidsmessig oppløsning sammenlignet med elektrofysiologiske teknikker12.
Informasjon fra det nyeste CiPA-initiativet13 sier at MEAer er mye brukt i hjertesikkerhetsundersøkelser som en alternativ elektrofysiologisk tilnærming, da de representerer et kraftig og veletablert verktøy for å undersøke hjertefunksjon og sikkerhetsfarmakologi. Kardiomyocytter dyrkes som et syncytium direkte på toppen av brikkene, og ekstracellulære feltpotensialer (FPs) registreres ikke-invasivt via substratintegrerte mikroelektroder. Dette opptaksprinsippet gjør det mulig å gjennomføre økte gjennomstrømningsscreeninger over flere dager, noe som gjør dem egnet for farmasøytisk forskning på kroniske effekter. Den resulterende FP-bølgeformen er et derivat av den intracellulære AP14. Parametere som takthastighet, amplituden til den første delen av FP og FP-varigheten er lett tilgjengelige15. Andre viktige kriterier som differensiering mellom forlengelse og triangulering av FP (en viktig markør for proarytmi16,17) er utilgjengelige på grunn av teknikkens AC-filtreringseffekt. Videre er det ofte lett å oppdage andre små proarytmiske hendelser som tidlige og forsinkede etterdepolariseringer (henholdsvis EAD og DAD) på grunn av deres lille amplitude.
Her beskriver vi en metode for å få tilgang til det intracellulære membranpotensialet ved å åpne membranen til kardiomyocytter. IntraCell-enheten (heretter kalt intracellulær opptaksenhet) tillater gjentatte membranåpninger av kardiomyocytter dyrket på toppen av MEA-elektrodene ved hjelp av en svært fokusert nanosekund laserstråle via et spesifikt fysisk fenomen (overflateplasmonresonans)18. Som et resultat går opptaket fra en vanlig FP til en intracellulær AP (laserindusert AP, liAP). Protokollen viser hvordan dette gir tilgang til kinetiske aspekter ved bølgeformen som ikke lett kan fanges opp ved å analysere FPer. Denne metoden representerer en bro mellom tradisjonelle intracellulære patchklemmer og MEA-opptak. Teknologien er derfor en kraftig utvidelse av dagens metoder for vurdering av hjertesikkerhet.
Denne innovative metoden demonstrerer en ny måte å undersøke in vitro den farmakologiske moduleringen av hjertets virkningspotensial under anvendelse av kardioaktive farmakologiske verktøyforbindelser.
Klassiske MEA-opptak tillater FP-opptak, som er derivatet av hjerte-AP14. Denne indirekte registreringen forvrenger tidsforløpet for de- og repolariseringen og eliminerer dermed viktige egenskaper ved AP. Videre, selv om den transcellulære spenningsendringen til en AP vanligvis når verdier på omtrent 100 mV, forblir den totale FP-amplituden sammenlignbart lav, med toppamplituder mellom flere 100 μV og lave ensifrede mV-verdier. På grunn av opptaksprinsippet er repolariseringsfasen liten; i mange tilfeller er det bare påviselig og ofte av uklar form, noe som gjør det vanskelig å definere slutten av FP. Åpningen av cellemembranen gjør at vi kan få tilgang til den intracellulære spenningen, og dermed avdekke tidsforløpet til hjerte-AP. Det er flere fordeler med denne opptaksmetoden sammenlignet med FP-opptak. For det første er signalamplituden mer fremtredende, noe som gir et overlegent signal-til-støy-forhold. For det andre resulterer bølgeformen i bedre påvisning av repolariseringen. For det tredje bidrar formen på repolariseringsfasen innsikt i virkemåten til testforbindelsen, gitt av brattheten til signalavslappingen. Og til slutt gir denne metoden en forbedret følsomhet for å oppdage kritiske bivirkninger, demonstrert av opptakseksemplet vist i figur 6 for forekomsten av EADer i liAP, men ikke i FP.
Så langt er det to måter å få tilgang til den intracellulære AP. Den første oppnås ved elektroporering26,27. Her kan korte og sterke spenningspulser påført via opptakselektrodene åpne cellemembranen28. Den andre muligheten er membranåpningen via en laserpuls, ved hjelp av et fysisk fenomen kalt overflateplasmonresonans, som vist her. En av fordelene sammenlignet med elektroporering er den økte sannsynligheten for påfølgende åpninger. På grunn av det svært fokuserte laserpunktet (1-3 μm) er denne effekten svært lokalt begrenset til elektroden av interesse. Interessant nok endret initieringen av liAP ikke signalutbredelsen av det kultiverte syncytiumet. Dette indikerer at selv om celleintegriteten er skadet, ser kardiomyocytter ikke ut til å depolarisere via hullet i membranen.
Det er begrensninger for denne metoden. Som ved elektroporering varer membranåpningen i de fleste tilfeller ikke over hele forsøkskurset. De minimale effekt- og varighetsinnstillingene til laserpulsen som kreves for stabil åpning av den spesifikke celletypen av interesse, må defineres uavhengig før forsøkene. Vi fant (ikke vist) at parametrene varierer drastisk mellom ulike celletyper (i vårt tilfelle flere hiPS-avledede og primære kardiomyocytter). Dette unngår unødvendig stress på cellene under det sammensatte testeksperimentet og resulterer i mer pålitelige og reproduserbare data. Det er av avgjørende betydning å justere z-aksen for å gi et klart fokus på cellene og elektrodene. Et ufokusert kamerabilde gir i et laserpunkt plassert på et suboptimalt nivå, noe som potensielt resulterer i manglende evne til å åpne cellemembranen. Selv med best justerte parametere er liAP-effekten forbigående, og amplituden reduseres over tid. Videre varierer tilgangen til det intracellulære rommet til cellene mellom liAP-induksjoner, både innenfor påfølgende åpninger ved samme elektrode og mellom elektroder. Dette resulterer i høy variabilitet av liAP-amplituden. Årsaken er ennå ikke fullt ut forstått. Mulige forklaringer inkluderer mekaniske problemer som en drift av laserfokuset eller annen subcellulær lokalisering av membranåpningen. Dette gjør analysen av amplitudeeffekter av testforbindelser komplisert på dette tidspunktet. Registrering av elektrisk aktivitet av et MEA-system krever også høypassfiltrering for å kompensere for uunngåelig grunnlinjedrift. Selv om denne filtreringen i systemet som ble brukt her, ble satt til 0,1 Hz (den laveste filterinnstillingen som er tilgjengelig for dette systemet), var filtreringseffekter under platåfasen fortsatt synlige, noe som resulterte i en langsom trend av spenningsavbøyningen mot grunnlinjen under platåfasen av hjertets AP. Dette er spesielt problematisk med omfattende lange underliggende AP-er som de iPSC-avledede iCell-kardiomyocytter2 som brukes her, som allerede genererer AP >700 ms under kontrollforhold. Bruk av systemer med lavere filtrering kan bedre bevare formen på AP og gi enda bedre tilgang til tidsforløpet for repolariseringsfasen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Foresee Biosystems for utlån av IntraCell-systemet under studiene. De vil også takke Hae In Chang for teknisk assistanse. Dette arbeidet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020s forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale nr. 964518 (ToxFree), fra EUs Horizon Europe European Innovation Council Programme, prosjekt SiMulTox (tilskuddsavtale nr. 101057769), og fra utenriksdepartementet Baden-Württemberg for økonomi, arbeid og turisme.
1 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890301 | |
6 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 7600069 | |
DMSO | Merck KGaA | 20-139 Sigma-Aldrich |
solvent for drugs |
Dofetilide | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
D-100 | Drug-Measurement |
dPBS | Fisher Scientific GmbH | 12037539 | Coating |
E4031 | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
E-500 | Drug-Measurement |
Falcon | Fisher Scientific GmbH | 10788561 | |
FB Alps version 0.5.005 | Foresee Biosystems | ||
Fibronectin | Merck KGaA | 11051407001 | Coating |
iCell cardiomyocytes | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
C1016 | |
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
Isopropanol | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN09.1 | For cleaning of MEA contact pads |
Maintenance Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
#M1003 | For cell-culture |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems MCS GmbH | Data export | |
MC_Rack | Multi Channel Systems MCS GmbH | MEA recording | |
MEA 2100 – 2×60 – system | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890485 | For MEA-recordings |
Nifedipine | Merck KGaA | N7634 Sigma-Aldrich |
Drug-Measurement |
Plating Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
M1001 | For cell-culture |
Tergazyme | VWR International, LLC | 1304-1 | cleaning of MEAs |