Kombinationen av laserporation och mikroelektrodmatriser (MEA) möjliggör åtgärdspotentialliknande inspelningar av odlade primära och stamcellsderiverade kardiomyocyter. Vågformsformen ger överlägsen inblick i testföreningarnas verkningssätt än standardinspelningar. Den länkar patch-clamp och MEA-avläsning för att ytterligare optimera hjärtsäkerhetsforskning i framtiden.
Livshotande läkemedelsinducerad hjärtarytmi föregås ofta av långvariga hjärtåtgärdspotentialer (AP), vanligtvis åtföljd av små proarytmiska membranpotentialfluktuationer. Formen och tidsförloppet för den repolariserande fraktionen av AP kan vara avgörande för närvaron eller frånvaron av arytmi.
Mikroelektrodmatriser (MEA) ger enkel åtkomst till kardiotoxiska föreningseffekter via extracellulära fältpotentialer (FP). Även om det är ett kraftfullt och väletablerat verktyg inom forskning och hjärtsäkerhetsfarmakologi, tillåter FP-vågformen inte att härleda den ursprungliga AP-formen på grund av den extracellulära inspelningsprincipen och den resulterande inneboende växelströmsfiltreringen (AC).
En ny anordning, som beskrivs här, kan repetitivt öppna membranet av kardiomyocyter som odlas ovanpå MEA-elektroderna vid flera odlingstidpunkter med hjälp av en mycket fokuserad nanosekundlaserstråle. Laserporationen resulterar i att den elektrofysiologiska signalen omvandlas från FP till intracellulära-liknande AP (laserinducerad AP, liAP) och möjliggör inspelning av transcellulära spänningsavböjningar. Denna intracellulära åtkomst möjliggör en bättre beskrivning av AP-formen och en bättre och känsligare klassificering av proarytmiska potentialer än vanliga MEA-inspelningar. Detta system är en revolutionerande förlängning av de befintliga elektrofysiologiska metoderna, vilket möjliggör noggrann utvärdering av kardiotoxisk effekt med alla fördelar med MEA-baserade inspelningar (enkla, akuta och kroniska experiment, signalutbredningsanalys etc.).
Det elektriska bidraget från ett hjärtslag härrör från ett komplext och exakt tidsbestämt samspel mellan många hjärtkanaler och transportörer, liksom den exakt inställda utbredningen av elektriska signaler genom myokardiet1. Förändring av dessa nära samordnade mekanismer (t.ex. användning av läkemedel) kan leda till allvarliga konsekvenser för hjärtats funktion (dvs. livshotande arytmi)2,3. Arytmier definieras som oregelbundna hjärtslag som förändrar hjärtans normala rytm, vilket kan få livshotande konsekvenser. De kan orsakas antingen av nedsatt initiering av en våg av hjärtexcitation eller av onormal förökning av hjärtexcitation4, vilket i sin tur resulterar i en dysfunktion i hjärtats pumpmekanism.
Många mycket potenta läkemedelskandidater måste uteslutas från ytterligare undersökningar under den tidiga läkemedelsutvecklingsfasen på grund av deras (pro-) arytmiska potential 2,3. De modulerar viktiga hjärtkanaler (t.ex. den mänskliga eter-a-go-go-relaterade genkanalen [hERG]) som är ansvariga för normal hjärtåtgärdspotentialbildning och avslutning samt efterföljande signalutbredning5.
Läkemedelsföretag använder rutinmässigt patch-clamp-mätningar eller mikroelektrodmatriser (MEA) för att undersöka potentiella kardiotoxiska off-target-effekter inducerade av läkemedelskandidater. Patch-clamp-inspelningar gör det möjligt att dechiffrera effekterna av ämnen på hjärtjonkanaler och att analysera den transcellulära hjärtåtgärdspotentialen med hög spatio-temporal upplösning 6,7. Nackdelarna med denna teknik innefattar emellertid låg genomströmning med manuell patch-klämma och begränsad tillämplighet av automatisering på grund av beroendet av denna metod på celler i suspension. Dessutom kan kroniska effekter inte undersökas på grund av metodens invasivitet. Slutligen studeras vanligtvis bara enstaka celler samtidigt snarare än hela hjärtsynkynet, vilket gör det omöjligt att ta itu med information om signalutbredning.
Spänningskänsliga färgämnen är värdefulla för att icke-invasivt undersöka hjärtåtgärdspotentialer och läkemedelsinducerade arytmier8. De tillåter undersökning av både encells- och syncytiumaktivitet. Nackdelar med denna metod är cytotoxiska effekter av antingen färgämnena i sig eller av reaktionsprodukten under belysning. De används för akuta experiment och är knappast tillämpliga för långtidsstudier 9,10,11. Spänningskänsliga proteiner som alternativ har gjort betydande framsteg under de senaste åren när det gäller användbarhet och känslighet men kräver genetisk modifiering av cellerna av intresse och saknar hög tidsupplösning jämfört med elektrofysiologiska tekniker12.
Information från det senaste CiPA-initiativet13 säger att MEA används i stor utsträckning vid hjärtsäkerhetsundersökningar som ett alternativt elektrofysiologiskt tillvägagångssätt eftersom de representerar ett kraftfullt och väletablerat verktyg för att undersöka hjärtfunktion och säkerhetsfarmakologi. Kardiomyocyter odlas som ett syncytium direkt ovanpå chipsen, och extracellulära fältpotentialer (FP) registreras icke-invasivt via substratintegrerade mikroelektroder. Denna inspelningsprincip gör det möjligt att genomföra screening med ökad genomströmning under flera dagar, vilket gör dem lämpliga för farmaceutisk forskning om kroniska effekter. Den resulterande FP-vågformen är ett derivat av den intracellulära AP14. Parametrar som takthastighet, amplituden för den första delen av FP och FP-varaktighet är lättillgängliga15. Andra väsentliga kriterier såsom differentieringen mellan förlängning och triangulering av ramprogrammet (en viktig markör för proarytmi16,17) är otillgängliga på grund av teknikens AC-filtreringseffekt. Dessutom är detektion av andra små proarytmiska händelser som tidiga och fördröjda efterdepolariseringar (EAD respektive DAD) ofta lätt förbisedda på grund av deras lilla amplitud.
Här beskriver vi en metod för att få tillgång till den intracellulära membranpotentialen genom att öppna membranet av kardiomyocyter. IntraCell-enheten (nedan kallad intracellulär inspelningsenhet) möjliggör upprepade membranöppningar av kardiomyocyter odlade ovanpå MEA-elektroderna med hjälp av en mycket fokuserad nanosekundlaserstråle via ett specifikt fysikaliskt fenomen (ytplasmonresonans)18. Som ett resultat övergår inspelningen från en vanlig FP till en intracellulärliknande AP (laserinducerad AP, liAP). Protokollet visar hur detta gör det möjligt att få tillgång till kinetiska aspekter av vågformen som inte lätt kan fångas genom att analysera FP: er. Denna metod representerar en bro mellan traditionella intracellulära patch-clamp och MEA-inspelningar. Tekniken är därför en kraftfull förlängning av nuvarande metoder för hjärtsäkerhetsbedömning.
Denna innovativa metod visar ett nytt sätt att undersöka in vitro den farmakologiska moduleringen av hjärtåtgärdspotentialen under appliceringen av kardioaktiva farmakologiska verktygsföreningar.
Klassiska MEA-inspelningar tillåter FP-inspelningar, som är derivatet av hjärt-AP14. Denna indirekta registrering konvolverar tidsförloppet för de- och repolariseringen och eliminerar därmed väsentliga egenskaper hos AP. Dessutom, även om den transcellulära spänningsförändringen för en AP vanligtvis når värden på cirka 100 mV, förblir den totala FP-amplituden jämförelsevis låg, med toppamplituder mellan flera 100 μV och låga ensiffriga mV-värden. På grund av inspelningsprincipen är repolariseringsfasen liten; I många fall är den endast detekterbar och ofta av oklar form, vilket gör det svårt att definiera slutet på ramprogrammet. Öppningen av cellmembranet gör att vi kan få tillgång till den intracellulära spänningen och därigenom avslöja tidsförloppet för hjärt-AP. Det finns flera fördelar med denna inspelningsmetod jämfört med FP-inspelningar. För det första är signalamplituden mer framträdande, vilket ger ett överlägset signal-brusförhållande. För det andra resulterar vågformen i bättre detektion av repolariseringen. För det tredje bidrar formen på repolariseringsfasen med insikter om testföreningens verkningssätt, som tillhandahålls av brantheten i signalavslappningen. Och slutligen erbjuder denna metod en förbättrad känslighet för att upptäcka kritiska negativa läkemedelseffekter, vilket framgår av inspelningsexemplet som visas i figur 6 för förekomsten av EAD i liAP men inte i FP.
Hittills finns det två sätt att få tillgång till intracellulär AP. Den första uppnås genom elektroporering26,27. Här kan korta och starka spänningspulser som appliceras via inspelningselektroderna öppna cellmembranet28. Den andra möjligheten är membranöppningen via en laserpuls, med hjälp av ett fysiskt fenomen som kallas ytplasmonresonans, vilket visas här. En av fördelarna jämfört med elektroporering är den ökade sannolikheten för på varandra följande öppningar. På grund av den mycket fokuserade laserfläcken (1-3 μm) är denna effekt mycket lokalt begränsad till elektroden av intresse. Intressant nog förändrade initieringen av liAP inte signalutbredningen av det odlade syncytiumet. Detta indikerar att även om cellintegriteten är skadad verkar kardiomyocyterna inte depolarisera via hålet i membranet.
Det finns begränsningar för denna metod. Precis som med elektroporering håller membranöppningen i de flesta fall inte över hela experimentförloppet. De minimala effekt- och varaktighetsinställningarna för laserpulsen som krävs för stabil öppning av den specifika celltypen av intresse måste definieras oberoende före experimenten. Vi fann (inte visat) att parametrarna drastiskt varierar mellan olika celltyper (i vårt fall flera hiPS-härledda och primära kardiomyocyter). Detta undviker onödig stress på cellerna under det sammansatta testexperimentet och resulterar i mer tillförlitliga och reproducerbara data. Det är av avgörande betydelse att justera z-axeln för att ge ett tydligt fokus på cellerna och elektroderna. En ofokuserad kamerabild ger efter i en laserfläck som ligger på en suboptimal nivå, vilket kan resultera i oförmåga att öppna cellmembranet. Även med bäst justerade parametrar är liAP-effekten övergående och amplituden minskar med tiden. Dessutom varierar tillgången till cellernas intracellulära utrymme mellan liAP-induktioner, både inom på varandra följande öppningar vid samma elektrod och mellan elektroder. Detta resulterar i hög variabilitet av liAP-amplituden. Anledningen är ännu inte helt klarlagd. Möjliga förklaringar inkluderar mekaniska problem som en drift av laserfokus eller olika subcellulär lokalisering av membranöppningen. Detta gör analysen av amplitudeffekter av testföreningar komplicerad vid denna tidpunkt. Registrering av elektrisk aktivitet av ett MEA-system kräver också högpassfiltrering för att kompensera för oundviklig baslinjeavdrift. Även om denna filtrering i det system som används här var inställd på 0,1 Hz (den lägsta filterinställningen som är tillgänglig för detta system), var filtreringseffekter under platåfasen fortfarande synliga, vilket resulterade i en långsam trend av spänningsavböjningen mot baslinjen under platåfasen av hjärt-AP. Detta är särskilt problematiskt med omfattande långa underliggande AP: er som iPSC-härledda iCell-kardiomyocyter2 som används här, som redan genererar AP > 700 ms under kontrollförhållanden. Användningen av system med lägre filtrering kan bättre bevara AP: s form och ge ännu bättre tillgång till tidsförloppet för repolariseringsfasen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Foresee Biosystems för utlåningen av IntraCell-systemet under studierna. De vill också tacka Hae In Chang för tekniskt stöd. Detta arbete har fått finansiering från Europeiska unionens Horizon 2020: s forsknings- och innovationsprogram enligt bidragsavtalet nr 964518 (ToxFree), från EU: s Horizon Europe European Innovation Council Programme, projekt SiMulTox (bidragsavtal nr 101057769) och från statsministeriet i Baden-Wuerttemberg för ekonomiska frågor, arbete och turism.
1 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890301 | |
6 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 7600069 | |
DMSO | Merck KGaA | 20-139 Sigma-Aldrich |
solvent for drugs |
Dofetilide | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
D-100 | Drug-Measurement |
dPBS | Fisher Scientific GmbH | 12037539 | Coating |
E4031 | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
E-500 | Drug-Measurement |
Falcon | Fisher Scientific GmbH | 10788561 | |
FB Alps version 0.5.005 | Foresee Biosystems | ||
Fibronectin | Merck KGaA | 11051407001 | Coating |
iCell cardiomyocytes | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
C1016 | |
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
Isopropanol | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN09.1 | For cleaning of MEA contact pads |
Maintenance Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
#M1003 | For cell-culture |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems MCS GmbH | Data export | |
MC_Rack | Multi Channel Systems MCS GmbH | MEA recording | |
MEA 2100 – 2×60 – system | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890485 | For MEA-recordings |
Nifedipine | Merck KGaA | N7634 Sigma-Aldrich |
Drug-Measurement |
Plating Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
M1001 | For cell-culture |
Tergazyme | VWR International, LLC | 1304-1 | cleaning of MEAs |