Bestimmung der Temperaturpräferenz von Moskitos und anderen Ektothermen

Organismen können nur innerhalb ihres thermischen Toleranzbereichs leben und sich vermehren. Da die Umgebungstemperatur aufgrund von Jahreszeitenänderungen und globaler Erwärmung variiert, müssen sich Arten anpassen und entsprechend reagieren, um ihr Überleben zu sichern. Dazu gehören Ektothermen, bei denen die Körpertemperatur im Gleichgewicht mit der Umgebung ist¹. Daher hat jedes Insekt seinen eigenen optimalen Umgebungstemperaturbereich, den sie innerhalb^{von 2} halten möchten.

Die Temperatur ist einer der wichtigen Faktoren, die verwendet werden, um die Verteilung und Reichweite von Insekten ^{vorherzusagen 3,4,5}, die Beobachtung von Erreger-Insekten-Beziehungen ^6,7 und die Wirkung externer Faktoren auf die Fitness von Ektothermen wie ihre Lebensdauer, Fruchtbarkeit und Fressrate ^8,9.

Frühere Studien haben die bevorzugte Temperatur von Ektothermen mit unterschiedlichen Aufbauten untersucht. Am gebräuchlichsten ist die Verwendung eines großen Aluminiumblocks entweder mit einem gekühlten oder beheizten Wasserbad 10, einem Eisbad und einem programmierbaren Heizelement 11, kalten und heißen Platten^12,13, Wärmereglerplatten ^14,15 oder einem Wärmepack und einem Eisbeutel ¹⁶ an beiden Enden, um einen Temperaturgradienten zu erzeugen. Darüber hinaus haben andere Studien auch einen Temperaturgradienteninkubator verwendet, um das Wachstum ausgewählter Bakterien^{zu untersuchen 17} und einen Aluminiumstab auf einer thermoelektrischen Vorrichtung (an den Enden beheizt und gekühlt) montiert, um die thermische Präferenz von Drosophila melanogaster^18,19 zu beobachten.

Die hier vorgeschlagene alternative Methodik hat jedoch erhebliche Vorteile für bestimmte Insektenanwendungen. Erstens erfordern andere Lösungen eine komplette Konstruktion von Grund auf mit Grundmaterialien, einschließlich Aluminiumblechen, dem Bau von Acrylkammern für die Insekten und oft einem Kamera-Setup und spezieller Software; Dies kann teuer und zeitaufwendig in der Einrichtung sein. Zweitens beruhen viele alternative Geräte auf einem Temperaturgradienten auf einer Oberfläche (im Gegensatz zur Lufttemperatur). Folglich ist die Kammer, in der die Insekten untersucht werden, oft sehr eng (z. B. 24 cm lange Steigungen mit nur 2 cm Breite und 1 cm Tiefe¹⁶), was natürliche Verhaltensweisen wie das Fliegen verhindern kann, die für die normale Mobilität von Insekten unerlässlich sind und daher für die Auswahl einer bevorzugten Temperatur unerlässlich sind. Einige Studien messen die Lufttemperatur; Die Bewertung der Wahl beinhaltet jedoch immer noch die Zählung der Anzahl der Moskitos, die auf den Peltier-Elementen landen, im Gegensatz zu Insekten, die frei in den Käfigen fliegen²⁰.

In dieser Studie beschreiben wir einen einfacheren Aufbau, der minimal modifizierte Standardausrüstung verwendet und Insekten ausreichend Platz bietet, um relativ ungehindert in einem Standard-Pflegekäfig zu fliegen und zu navigieren. Anstatt sich auf einen Gradienten zu verlassen, verwendet das Protokoll zwei relativ große Abschnitte mit konstanter Innentemperatur, die ein natürliches Roaming der Insekten bei ihrer bevorzugten Temperatur und eine einfache binäre Bewertung ermöglichen. Daher bieten die hier beschriebenen Geräte und Protokolle eine kostengünstige und einfache Möglichkeit, die Temperaturpräferenz der Moskitos in einer weniger hinderlichen und realistischeren Umgebung zu untersuchen.

Das Protokoll beinhaltet die Vorbereitung der Insekten vor dem Experiment, gefolgt vom Aufbau der Zweikammerapparatur. Weitere Schritte umfassen das Platzieren von Insekten in der Apparatur, um die Wahl der Temperatur und die Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen. Zur Veranschaulichung der Methode wählten wir hier die optimale (Standardaufzucht-) Temperatur der Insekten, 27 °C für Aedes aegypti, 25 °C für Drosophila melanogaster und eine höhere Abwehrtemperatur für beide Insektenarten, 30 °C bzw. 28 °C. Insekten erhalten 30 Minuten Zeit, um eine bevorzugte Kammer auszuwählen. Diese Zeit erwies sich als ausreichend, und eine längere Dauer änderte nichts an den Ergebnissen; Dies kann jedoch je nach Spezies / Temperatur / anderen Variablen nach Bedarf erweitert werden.

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für BSL 1 oder 2 geschrieben; Führen Sie für BSL 3-Arbeiten das gesamte Protokoll in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse 3 (Handschuhfach) durch.

1. Insektenzubereitung

1. Bereiten Sie zwei leere Moskitokäfige (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) mit 12 cm Hülsenöffnungen vor (Abbildung 1). Bevor Sie mit den Experimenten fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Moskitokäfige keine Löcher oder andere Schäden aufweisen.
2. Mit einem mechanischen Aspirator (einem einfachen Sauger mit einer Sammelkammer) werden 30 Insekten (z. B. Aedes aegypti-Mücken ; hier wurden Weibchen 3-5 Tage nach dem Auflaufen verwendet) in einen separaten Käfig gebracht, um die Handhabung und Entsorgung nach dem Experiment zu erleichtern.
   HINWEIS: Insgesamt 30 Insekten pro Experiment werden empfohlen, da es einfach zu handhaben und zu zählen ist, ohne dass ein hohes Risiko besteht, dass Moskitos entweichen. Die Anzahl der verwendeten Insekten kann an das Ziel des Experiments angepasst werden.

2. Aufbau von Zweikammerapparaturen

1. Stellen Sie die Inkubatoren gemäß den Anweisungen des Inkubatorherstellers auf die gewünschten Temperaturen ein.
2. Lassen Sie die Inkubatoren aufheizen und stabilisieren Sie sich bei den spezifischen Temperaturen, die <30 min für Temperaturen im Bereich von 25-30 ° C betragen. Überprüfen Sie die Lufttemperatur im Inkubator mit einem Temperaturfühler, um sicherzustellen, dass der Inkubator auf die vorgesehene Temperatur eingestellt ist.
3. Stellen Sie einen leeren Moskitokäfig in jeden Inkubator (Abbildung 2A).
4. Führen Sie die Hülsen des Käfigs durch das vordere Loch des Inkubators. Bereiten Sie eine zu öffnende Abdeckung (Klappe) mit Klebeband vor und legen Sie sie über das Loch im Acrylrohr (Abbildung 2B).
5. Führen Sie das Acrylrohr in die Hülse eines Käfigs oben auf dem Inkubatorloch ein. Der Durchmesser des Rohres ist größer als das Loch in der Vorderseite der Inkubatoren, so dass es das Loch vollständig bedeckt.
6. Ziehen Sie das Netz der Hülse um den Schlauch mit einem Gummiband oder einem wiederverwendbaren Kabelbinder fest (Abbildung 2C). Stellen Sie sicher, dass das Acrylrohr nicht locker ist und zwischen den Inkubatoren baumelt; Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie an den Käfighülsen, um überschüssiges Material zwischen dem Käfig und dem Gummiband zu entfernen.
7. Stellen Sie beide Inkubatoren einander gegenüber und wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit der Hülse des anderen Inkubators. Beide Käfige sind nun durch das Acrylrohr sicher verbunden (Abbildung 2D).

3. Mückeneinfügung

1. Öffnen Sie die Klebebandklappe zum Einführen von Moskitos. Legen Sie einen Trichter in das Loch. Entleeren Sie die Insekten in den Trichter, der in die Acrylröhre gelegt wurde.
   HINWEIS: Falls gewünscht/erforderlich: Verwenden Sie bei Moskitos einen CO₂ -Stift, um alle Moskitos auszuschalten, bevor Sie sie in den Trichter²¹ legen; für Drosophila, verwenden Sie Eis, um Insekten niederzuschlagen²².
2. Entfernen Sie den Trichter und decken Sie das Loch im Rohr mit der Klebebandklappe ab. Lassen Sie für Insekten für 30 Minuten, um die bevorzugte Kammer auszuwählen.
   HINWEIS: Wenn CO₂ oder Eis verwendet wurde, klopfen Sie leicht auf die Rohrbrücke, um die Insekten nach ein paar Minuten zu wecken.

4. Mückenzählung

1. Nach 30 Minuten visuell beobachten und aufschreiben, wie viele Insekten in der Brücke (der Acrylröhre) gefunden wurden.
2. Klopfen / blasen Sie die Insekten in der Brücke zu beiden Seiten des Inkubators. Rekord, um später von der Gesamtzahl der Insekten abzuziehen.
   HINWEIS: Schlagen Sie alle 30 Insekten im Gerät aus, indem Sie CO 2 in die Brücke freisetzen (verwenden Sie CO₂ für alle Insekten, da Eis Insekten in den Käfigen nicht umwirft). Beachten Sie auch die Anzahl der Insekten in der Brücke, die zu beiden Seiten des Inkubators fliegen.
3. Kneifen und schließen Sie die Hülsen aus dem Acrylrohr auf beiden Seiten, befestigen Sie sie schnell mit einem Knoten, um die Käfige zu schließen, und stellen Sie sicher, dass das Gummiband noch intakt ist, um zu verhindern, dass Insekten entweichen.
4. Entfernen Sie die Käfige aus dem Inkubator und zählen Sie die Insekten in jedem Käfig visuell (ziehen Sie bei Bedarf die Anzahl der Insekten von der Brücke ab).
5. Wiederholen Sie Schritt 4.4 mit dem anderen Käfig. Stellen Sie sicher, dass die Zahlen aus den beiden Inkubatoren und der Brücke 30 ergeben (oder die Anzahl der verwendeten Insekten, falls abweichend).
6. Wenn die Zahlen nicht zur Gesamtzahl der in Schritt 1.2 verwendeten Insekten addieren, suchen Sie nach den verbleibenden Insekten in der Käfighülse.

5. Replikation

1. Achten Sie bei der Durchführung von Experimenten darauf, mögliche externe Verzerrungen wie Lichtrichtung, Umgebungsgerüche usw. zu berücksichtigen. Zum Beispiel durch Umkehrung der Käfige, Inkubatorausrichtung und Kombinationen zwischen Replikaten.

Um die Wirksamkeit und Wirksamkeit dieses Versuchsaufbaus zu testen, wurden 30 Mücken mit der gleichen Temperatur in beiden Inkubatoren in vier Replikaten getestet (Abbildung 3). Wenn beide Kammern auf die optimale Temperatur der Mücke von 27 °C eingestellt wurden, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kammerpräferenz (P = 0,342; Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtest). Wenn jedoch eine Kammer auf die attraktive optimale Temperatur von 27 °C und die andere Kammer auf eine suboptimale Temperatur von 30 °C eingestellt wurde, zeigten die Moskitos durchweg eine aktive Präferenz für ihr Optima (P = 0,029; Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test; Mittelwert von 78,2 % bzw. 21,8 % bei 27 °C bzw. 30 °C). Wir testeten auch mit Drosophila , um die Anwendbarkeit mit einem anderen Ektothermmodell zu bestimmen, und ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet.

Temperaturgleichmäßigkeit innerhalb der Käfige
Abbildung 4 zeigt die Temperaturgleichmäßigkeit der Zweikammerapparatur. Nach der Montage wurden die beiden Seiten auf 27 °C und 30 °C eingestellt und gemäß den hier gegebenen Anweisungen ausgeglichen. Alle Teile des Inkubators und der Brücke liegen innerhalb von 0,4 °C von der zentralen Temperatur, außer (konsequent) für eine Ecke. Beachten Sie, dass die vordere untere linke Ecke (von vorne gesehen) sowohl bei 27 °C als auch bei 30 °C ein konsistenter Hot Spot ist. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass sich die Elektronik der Inkubatorsteuerungen direkt unter diesem Abschnitt des Inkubators befindet, und nicht auf die durchgeführten Manipulationen. Daher ist es wahrscheinlich Inkubator-Modell-spezifisch. Dies zeigt, dass die Manipulation und Zugabe zum Inkubator einen minimalen Einfluss auf die Temperaturgleichmäßigkeit haben. Darüber hinaus lag die Brückentemperatur zwischen den beiden Kammern, so dass Insekten nicht mit einem Temperaturtrog konfrontiert werden, durch den sie fliegen müssten.

Abbildung 1: Beschreibung des Moskitokäfigs. Moskitokäfig (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) mit 12 cm Ärmelöffnungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bilder und Diagramm der Apparatur während des Aufbaus . (A) Leerer Insektenkäfig im Inkubator. (B) Acrylrohr mit einer zu öffnenden Abdeckung (Klappe) aus Klebeband. (C) Seitenansicht des Aufbaus mit schematischem Diagramm. Das Netz der Hülse wurde mit einem Gummiband um das Acrylrohr gespannt. Für diese Experimente wurden 3-5 Tage alte, verpaarte, weibliche Ae. aegypti Moskitos verwendet. (D) Vollständige Einrichtung. Zwei gegenüberliegende Inkubatoren sind durch ein Acrylrohr verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Temperaturpräferenz bei Insekten. Der Zweikammerapparat wurde gemäß den Anweisungen zusammengebaut. Insekten wurden gemäß dem Protokoll eingesetzt und 30 Minuten lang gelassen, um ihre bevorzugte Kammer (Temperatur) auszuwählen und dann zu zählen. Schwarze Punkte stellen einzelne Replikate dar, und Blau stellt den Mittelwert dar. (A) Beide Inkubatoren wurden auf die gleiche Temperatur (27 °C) eingestellt und die Temperaturpräferenz von Ae. aegypti wurde beobachtet. (B) Die Inkubatoren wurden auf unterschiedliche Temperaturen (27 °C vs. 30 °C) und die Temperaturpräferenz von Ae eingestellt. Aegypti wurde beobachtet. (C) Die Inkubatoren wurden auf unterschiedliche Temperaturen eingestellt (25 °C vs. 28 °C) und die Temperaturpräferenz von D. melanogaster wurde beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Temperaturgleichmäßigkeit innerhalb der Kammern und der Brücke. Wie beschrieben, wurden zwei Inkubatoren, zwei Käfige und die Brücke gemäß den Anweisungen montiert. Die Temperatur wurde auf beiden Inkubatoren auf 27 °C und in der Mitte auf 30 °C eingestellt. Eine Temperatursonde wurde verwendet, um die Temperatur in der Mitte des Käfigs, allen acht Ecken des Inkubators und innerhalb der Brücke zu messen. Die gemessenen Temperaturen sind hier dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.