Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Summary

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Abstract

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEV) können aus allen Zelltypen freigesetzt werden und Proteine, DNA und RNA tragen. Signalmoleküle dienen als Indikatoren für den physiologischen und pathologischen Zustand einer Zelle. Es gibt jedoch keine Standardmethode für die sEV-Isolierung, die nachgeschaltete Biomarker-Identifizierungs- und Arzneimittelinterventionsstudien verhindert. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Reinigung von 50-200 nm sEV durch einen Durchflusszellensortierer zur Verfügung. Zu diesem Zweck wurden eine 50-μm-Düse und ein Mantelflüssigkeitsdruck von 80 psi gewählt, um eine gute Sortierrate und einen stabilen Seitenstrom zu erzielen. Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße wurden verwendet, um Populationen von 100-, 200- und 300-nm-Partikeln zu lokalisieren. Durch eine zusätzliche Optimierung der Auslöseschwelle für Spannung, Verstärkung und Vorwärtsstreuung (FSC) konnte das sEV-Signal vom Hintergrundrauschen getrennt werden. Diese Optimierungen bieten einen Bereich kritischer Sortiereinstellungen, der es ermöglicht, eine repräsentative Population von sEV nur mit FSC vs. Side Scatter (SSC) zu erhalten. Die auf Durchflusszytometrie basierende Isolationsmethode ermöglicht nicht nur eine Hochdurchsatzanalyse, sondern auch eine synchrone Klassifizierung oder Proteomanalyse von sEV basierend auf der Biomarkerexpression, was zahlreiche nachgelagerte Forschungsanwendungen eröffnet.

Introduction

Eine Zelle setzt extrazelluläre Vesikel (EVs) unterschiedlicher Größe frei, die zu Signalmolekülen und Membraneinschlüssen führen, die für die interzelluläre Kommunikation wichtig sind¹. EVs unterschiedlicher Größe spielen auch unterschiedliche biologische Rollen, wobei 50-200 nm sEV in der Lage sind, RNA, DNA und Proteine präzise an die richtige extrazelluläre Stelle zu verteilen. Die sEV hilft auch bei der Bestimmung ihrer Sekretionsmechanismen, die nicht nur die Regulierung normaler physiologischer Prozesse wie Immunüberwachung, Stammzellerhaltung, Blutgerinnung und Gewebereparatur umfassen, sondern auch die Pathologie, die verschiedenen Kra....

Protocol

1. Zellkultur

1. Bereiten Sie ein Nährmedium aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vor, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Die menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelle PANC-1 wird in einem 75^cm2 Kulturkolben mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml kultiviert. Inkubation der Kultur bei 37 °C mit 5% CO₂.
2. Subkultur der Zellen, wenn die Zelldichte unter mikroskopischer Beobachtung 75%-80% erreicht. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie es 2x mit 3-5 ml Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4) ab.
3. Verwerfen Sie die Lösung, fügen Sie 1-2 ml Trypsin-EDTA-Lösung ....

Results

Das Flussdiagramm für das experimentelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei diesem Verfahren wurden Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße als Referenzstandards für die Partikelgrößenverteilung verwendet. Unter der spezifischen instrumentellen Parameterbedingung konnte das Partikelsignal mit Hilfe der logarithmischen Form klar vom Hintergrundrauschen im FSC- vs. SSC-Diagramm unterschieden werden. Gating-Strategien sind in Abbildung 2 dargestellt. R4,.......

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung und Aufreinigung von sEV mit der spezifizierten Partikelgröße von 50-200 nm unter Verwendung eines Durchflusszellensortierers, der von NTA validiert wurde. Die Methode löste das Engpassproblem, sEV mit einheitlicher Partikelgröße und hoher Reinheit zu erhalten, und verhinderte Interferenzen durch nicht verwandte biologische Moleküle, die in großformatige EVs^{eingewickelt sind 22}. Schnelle Hochdurchsatzanalysen sind mit der Durchflus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	344058
Kulturkolben	Corning
Dulbecco" s modifiziertes Eagle-Medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fötales Rinderserum	SUER	SUER050QY
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Humane Pankreaskrebszelle, PANC-1	NA	NA	PANC-1-Zellen wurden von Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University gespendet
Laser-Partikelgröße und Zetapotenzial Analysator	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung	Gibco	C20012500BT
Polystyrol fluoreszierende Mikrosphären	Beckman Coulter	6602336
Transmissionselektronenmikroskopie	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA-Lösung	Gibco	1713949
Ultra Regenbogen-Fluoreszenzpartikel	Beckman Coulter	B28479
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultrazentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW32TI