Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.
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Methodenartikel
Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mutationen im mitochondrialen Genom (mtDNA) werden mit mütterlich vererbten genetischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Das Interesse an mtDNA-Polymorphismen hat jedoch in den letzten Jahren zugenommen, da in jüngster Zeit die Fähigkeit entwickelt wurde, Modelle durch mtDNA-Mutagenese zu erstellen, und eine neue Erkenntnis des Zusammenhangs zwischen mitochondrialen genetischen Aberrationen und häufigen altersbedingten Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Demenz entwickelt wurde. Die Pyrosequenzierung ist eine Sequenzierungstechnik durch Synthese, die im gesamten mitochondrialen Bereich für routinemäßige Genotypisierungsexperimente weit verbreitet ist. Ihre relative Erschwinglichkeit im Vergleich zu massiven parallelen Sequenzierungsmethoden und die einfache Implementierung machen sie zu einer unschätzbaren Technik auf dem Gebiet der mitochondrialen Genetik, die eine schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie mit erhöhter Flexibilität ermöglicht. Trotz der Praktikabilität dieser Methode erfordert ihre Implementierung als Mittel zur mtDNA-Genotypisierung die Einhaltung bestimmter Richtlinien, insbesondere um bestimmte Verzerrungen biologischen oder technischen Ursprungs zu vermeiden. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte und Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung und Implementierung von Pyrosequenzierungsassays für die Verwendung im Zusammenhang mit der Heteroplasmiemessung.
Einleitung
Das mitochondriale Genom liegt in Form von kleinen (16,5 kb) kreisförmigen Molekülen (mtDNA) vor, die im innersten Kompartiment der Mitochondrien vorhanden sind, die als Matrix bezeichnet werden und für 13 Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette sowie die tRNAs und rRNAs kodieren, die für ihre Translation in situ durch das mitochondriale Ribosom1 erforderlich sind. Dieses Genom repräsentiert etwa 1% aller Proteine, die für die Funktion der Mitochondrien notwendig sind, der Rest wird von der Kern-DNA (nDNA) kodiert. Es wird allgemein angenommen, dass Mitochondrien aus einem endosymbiotischen Fusionsereignis zwischen einem alpha-....
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Protokoll
Für die Verwendung der humanen 3243A>G-Cybridzellen und der in dieser Studie verwendeten immortalisierten m.5024C>T-MEFs wurde eine Einwilligungserklärung erteilt. Eine ethische Genehmigung war in diesem Fall nicht erforderlich, da die Patientenzellen nicht an der Universität Cambridge entnommen wurden. Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann jedoch eine ethische Genehmigung erfordern. Es wird dringend empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben-DNA für die Pyrosequenzierung die Best Practices für die PCR-Einrichtung zu befolgen. Eine häufige Amplifikation mit identischen Primern kann zu einer Amplikonkontamination führen und die anschließende Genotypisierung ver....
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Ergebnisse
In diesem Abschnitt werden ein Beispiel für die Optimierung eines Pyrosequenzierungsassays für eine humanpathogene mtDNA-Mutation sowie Sequenzierungsdaten aus der Genotypisierung von heteroplasmatischen (m.5024C>T) embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vorgestellt, die mit mitochondrialen Zinkfingernukleasen (mtZFNs) behandelt wurden. Die Optimierung des Assays für menschliche Zellen und der Vergleich zweier verschiedener Assays zeigt, wie der genaueste ausgewählt werden kann, während die Genotypisierung genetisch.......
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Diskussion
Ein kritischer Aspekt für den Erfolg des Protokolls ist die Vermeidung von Kontaminationen, insbesondere bei der Verwendung geringer Mengen an Ausgangsmaterial. Es wird empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben nach Möglichkeit eine UV-Haube und gefilterte Pipettenspitzen zu verwenden sowie die Bereiche vor und nach der Verstärkung getrennt zu halten. Blindproben und Proben bekannter Heteroplasmie (z. B. Wildtyp-DNA) sollten immer als Benchmarks verwendet werden, um technische oder biologische Verzerrungen zu überprüfen.......
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Offenlegungen
M.M. ist Mitbegründer, Anteilseigner und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. und P.A.N. bieten Beratungsdienstleistungen für Pretzel Therapeutics, Inc. an.
Danksagungen
Wir danken Silvia Marchet und Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Mailand) für die Vorbereitung und Bereitstellung der m.3243A>G Cybrid-Zellen, die als anschauliche Beispiele für dieses Protokoll verwendet werden. Wir möchten uns auch bei den Mitgliedern der Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) für nützliche Diskussionen im Laufe dieser Forschung bedanken. Diese Arbeit wurde durch eine Grundfinanzierung des Medical Research Council UK (MC_UU_00015.4. und MC_UU_00028.3.) unterstützt. P.A.N. und P.S.-P. werden zusätzlich von der Lily Foundation bzw. der Champ Foundation unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KOD Hot Start DNA-Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay-Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber-Streifen | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagenzien (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Kartuschen-Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Scheiben | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetische Beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Softwarelizenz (1) | QIAGEN | 9024325 |
Referenzen
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature
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Nachdrucke und Genehmigungen
