Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

Summary

Die hochauflösende Mikroskopie kann einen detaillierten Einblick in die Organisation von Komponenten innerhalb des synaptonemalen Komplexes bei der Meiose geben. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Auflösung einzelner Proteine des Synaptonemalkomplexes Caenorhabditis elegans .

Abstract

Während der Meiose müssen homologe Chromosomen einander erkennen und aneinander haften, um ihre korrekte Segregation zu ermöglichen. Eines der Schlüsselereignisse, das die Interaktion homologer Chromosomen sichert, ist der Aufbau des synaptonemalen Komplexes (SC) in der meiotischen Prophase I. Obwohl es wenig Sequenzhomologie zwischen Proteinkomponenten innerhalb des SC zwischen verschiedenen Spezies gibt, wurde die allgemeine Struktur des SC während der Evolution weitgehend konserviert. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen erscheint das SC als dreigliedrige, leiterartige Struktur, die aus lateralen Elementen oder Achsen, transversalen Filamenten und einem zentralen Element besteht.

Die genaue Identifizierung der Lokalisation einzelner Komponenten innerhalb des Komplexes durch Elektronenmikroskopie zur Bestimmung der molekularen Struktur des SC bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen erlaubt es, einzelne Proteinkomponenten innerhalb des Komplexes zu identifizieren. Da das SC jedoch nur ~100 nm breit ist, kann seine Substruktur nicht durch beugungsbegrenzte konventionelle Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden. Daher erfordert die Bestimmung der molekularen Architektur des SC hochauflösende Lichtmikroskopietechniken wie strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), Stimulated-Emission Depletion (STED) Mikroskopie oder Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (SMLM).

Um die Struktur und Wechselwirkungen einzelner Komponenten innerhalb des SC zu erhalten, ist es wichtig, den Komplex in einer Umgebung zu beobachten, die seiner natürlichen Umgebung in den Keimzellen nahe kommt. Daher demonstrieren wir ein immunhistochemisches und bildgebendes Protokoll, das die Untersuchung der Substruktur des SC in intaktem, extrudiertem Caenorhabditis elegans-Keimbahngewebe mit SMLM- und STED-Mikroskopie ermöglicht. Die direkte Fixierung des Gewebes am Deckglas reduziert die Bewegung der Proben während der Bildgebung und minimiert Aberrationen in der Probe, um die hohe Auflösung zu erreichen, die erforderlich ist, um die Substruktur des SC in seinem biologischen Kontext zu visualisieren.

Introduction

Die Reduzierung der Anzahl der Chromosomen um die Hälfte während der Meiose ist der Schlüssel zur Erzeugung gesunder Nachkommen in sich sexuell fortpflanzenden Organismen. Um diese Reduktion der Chromosomenzahl zu erreichen, müssen sich homologe Chromosomen während der Meiose I paaren und trennen. Um die genaue Segregation homologer Chromosomen zu gewährleisten, durchlaufen Keimzellen eine verlängerte Prophase I, in der homologe Chromosomen paaren, synapsieren und rekombinieren, um physikalische Verbindungen zwischen Homologen^{zu erzeugen 1}. Das SC hat sich als die zentrale Struktur herausgestellt, die für die Regulierung der korrekten Progression durch meiotische Prophase² entscheidend ist.

Das SC ist ein Komplex, dessen allgemeine Struktur evolutionär erhalten ist, obwohl es wenig Homologie zwischen seinen Proteinkomponenten gibt. Das SC wurde erstmals in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als eine dreiteilige, leiterartige Struktur identifiziert, die aus zwei lateralen Elementen oder Achsen, einem zentralen Bereich, der von transversalen Filamenten gebildet wird, und einem zentralen Element ^3,4 besteht. Die Bestimmung der Organisation einzelner Komponenten innerhalb des Komplexes ist der Schlüssel zum besseren Verständnis der Rolle des SC während der meiotischen Prophase.

Der Modellorganismus C. elegans ist ideal geeignet, um die Struktur und Funktion des SC zu untersuchen, da seine Keimbahnen eine große Anzahl meiotischer Kerne mit vollständig zusammengesetzten SCs⁵ enthalten. Genetische und biochemische Studien haben gezeigt, dass die Chromosomenachsen von drei verschiedenen Cohesin-Komplexen^6,7 und vier HORMA-Domänenproteinen namens HTP-1/2/3 und HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans gebildet werden. In der zentralen Region des SC wurden bisher sechs Proteine identifiziert, die Coiled-Coil-Domänen enthalten 12,13,14,15,16,17. Um den Abstand zwischen den beiden Achsen zu überbrücken, dimerisieren SYP-1, -5 und -6 kopf-an-kopf (Abbildung 1), während drei weitere Proteine ihre Interaktion im zentralen Element^16,17,18,19 stabilisieren.

Ein detaillierter Einblick in die Organisation dieser Proteine ist unerlässlich, um die vielen Funktionen des SC während der Meiose zu verstehen. Da die Breite des zentralen Bereichs des SC nur ~100 nm beträgt, kann seine Substruktur nicht durch beugungsbegrenzte Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden. Die Visualisierung von Komponenten innerhalb einer Struktur dieser Größe ist jedoch durch hochauflösende Mikroskopie leicht möglich. Tatsächlich haben sich die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), die Expansionsmikroskopie 20, die Stimulated-Emission Depletion (STED)-Mikroskopie²¹ und die Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (SMLM)^22,23 als wesentliche Werkzeuge zur Untersuchung der molekularen Architektur des SC über die Spezies 16,24,25,26,27,28,29 erwiesen^{. 30}.

Um die Auflösungsgrenze zu überwinden, setzt die STED-Mikroskopie darauf, den beugungsbegrenzten Punkt des Emissionslichts mit einem donutförmigen Strahl des STED-Lasers zu überlagern, der theoretisch die Punktspreizfunktion auf molekulare Dimensionen^31,32 einschränkt. Die Auflösung, die durch STED in biologischen Proben praktisch erreichbar ist, bleibt jedoch im Bereich von einigen zehn Nanometern in xy³³.

Noch höhere Auflösungen in biologischen Proben können mit SMLM-Techniken erzielt werden. SMLM nutzt die blinkenden Eigenschaften spezifischer Fluorophore, um Objekte auf der Subbeugungsebene aufzulösen, indem räumlich überlappende Fluorophore zeitlich getrennt werden. Die Probe wird dann wiederholt abgebildet, um verschiedene Untergruppen von Fluorophoren zu erfassen. Die Position der Fluorophore innerhalb der Probe wird dann bestimmt, indem die Punktspreizfunktion (PSF) an die erhaltenen Signale über alle Bilder angepasst wird, die Strukturen bis zu 15 nm^23,34 auflösen können.

Zusammengenommen kodieren die lokalisierten Bilder die Positionen aller Fluorophore. Die Auflösung von SMLM wird durch die Markierungsdichte und die Blinkeigenschaften des Fluorophors bestimmt. Nach dem Nyquist-Shannon-Kriterium ist es unmöglich, Objekte zuverlässig aufzulösen, die weniger als das Doppelte des durchschnittlichen Label-zu-Label-Abstands haben. Daher wird eine hohe Markierungsdichte für hochauflösende Bildgebung benötigt. Für das SC in C. elegans kann eine hohe Markierungsdichte erreicht werden, indem Epitopmarkierungen verwendet werden, die an bestimmten Stellen endogener Proteine mittels Genom-Editierung angebracht sind. Die Epitop-Tags können dann mit spezifischen monoklonalen Antikörpern mit hohen Affinitäten in hoher Dichte angefärbt werden^19,30. Gleichzeitig muss der Einschaltzyklus einzelner Fluorophore kurz genug sein, um sicherzustellen, dass räumlich überlappende Fluorophore nicht gleichzeitig eingefangen werden³⁵.

Aufgrund dieser beiden Anforderungen erfordert die Auflösung der Struktur großer makromolekularer Komplexe wie dem SC die Abbildung einer ausreichend großen Anzahl von Bildern und kann daher mehrere Stunden dauern. Der Fallstrick langer Abbildungszeiten besteht darin, dass Proben aufgrund von Bewegung des Tisches oder kleinen Strömen innerhalb des Probenpuffers dazu neigen, zu driften. Schon kleine Bewegungen in der Größenordnung von 10 nm sind bei der nm-Auflösung schädlich und müssen korrigiert werden. Die üblicherweise verwendeten Driftkorrekturmethoden sind jedoch nicht robust genug, um Bilder von zwei Kanälen, die nacheinander abgebildet wurden, genau zu überlagern³⁶. Dies ist problematisch, da biologische Fragestellungen oft eine präzise Detektion und Lokalisierung mehrerer Ziele innerhalb derselben Probe erfordern. Um diese Probleme zu umgehen, wurden Methoden wie die ratiometrische Bildgebung entwickelt. Die ratiometrische Bildgebung ermöglicht die gleichzeitige Abbildung mehrerer Fluorophore mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren, mit einer anschließenden Zuordnung jedes detektierten Signals zu seinem jeweiligen Fluorophor basierend auf dem Verhältnis der Intensitäten in spektral unterschiedlichen Kanälen^37,38.

Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der Organisation makromolekularer Komplexe wie des SC dreidimensionale (3D) Informationen. Um eine Superauflösung in drei Dimensionen (3D-SMLM) zu erreichen, wird eine zylindrische Linse in den optischen Pfad des emittierten Lichts eingebaut, die die Form des PSF eines Fluorophors in Abhängigkeit von seiner Entfernung von der Fokusebene verzerrt. Daher kann die genaue Position eines Fluorophors in der z-Ebene extrapoliert werden, indem die Form seines Emissionssignals^35,39 analysiert wird. Die Kombination dieser Fortschritte in SMLM ermöglicht die Abbildung der 3D-Organisation makromolekularer Komplexe, einschließlich des SC.

Protocol

1. Herstellung von Lösungen und Deckgläsern

ANMERKUNG: Siehe Tabelle der Materialien für Details zu allen Materialien und Reagenzien und Tabelle 1 für die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen.

1. Poly-L-lysinbeschichtete Deckgläser
   1. Bereiten Sie 0,01% (w/v) Poly-L-Lysin her (siehe Tabelle 1).
   2. Waschen Sie ein Präzisionsdeckglas (24 mm Durchmesser; 0,17 ± 0,005 mm, Nr. 1,5) in Ethanol für 10-30 min. Spülen Sie das Deckglas mit ddH₂O, um Ethanol zu entfernen, und lassen Sie das Deckglas bei Raumtemperatur trocknen.
   3. Plasmareinigen Sie das Deckglas mit einem Plasmareiniger.
      HINWEIS: Die Plasmareinigung erhöht die Hydrophilie des Deckglases und erleichtert die folgenden Schritte. Wenn kein Plasmareiniger verfügbar ist, kann dieser Schritt übersprungen werden, obwohl dies eine Anpassung des Volumens und/oder der Konzentration der Poly-L-Lysinlösung erfordern kann. Diese Änderung wurde nicht getestet.
   4. Geben Sie einen Tropfen (120 μL) 0,01% (w/v) Poly-L-Lysin auf das Deckglas. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Nach der Inkubation das Deckglas in_ddH2Oabspülen und bei Raumtemperatur trocknen. Bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
2. F(ab')2-Fragmente konjugiert mit fluoreszierenden organischen Farbstoffen
   1. In der folgenden Reihenfolge in ein PCR-Röhrchen geben: 10 μL 0,6-0,7 mg/ml F(ab')2-Fragment in PBS, 1 μL 0,1 M_NaHCO3 (pH 8,3) und 1 μL 1 mM Succinimidyl (NHS)-Ester reaktives Fluorophor in DMSO (molares Verhältnis von F(ab')2:Farbstoff ist ~1:17). Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
   2. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Trennen Sie das F(ab')2-Fragment vom verbleibenden freien Reaktivfarbstoff mit einer Entsalzungskolonne (7K MWCO) nach Herstellerangaben. Verwenden Sie 1x PBS für die Äquilibrierung der Säule und Elution des beschrifteten F(ab')2-Fragments.
   4. Lagern Sie das beschriftete F(ab')2-Fragment bis zu 3 Monate bei 4 °C.
      HINWEIS: Lagerzeiten von mehr als 3 Monaten wurden nicht getestet.

2. Sezieren und Fixieren

ANMERKUNG: Die Dissektions- und Fixierungsverfahren werden von den zuvor empfohlenen Verfahren^16,40 modifiziert^, um optimale Proben für die hochauflösende Mikroskopie zu erhalten.

1. Dissektion
   1. Picken Sie altersgerechte C. elegans-Würmer (für diese Studie bei 20 °C gezüchtet) in einen 30 μL Tropfen EBTT (1x Eipuffer⁴¹ mit 0,2% nichtionischem Reinigungsmittel, Tabelle 1) auf einem Deckglas (22 mm x 22 mm, Nr. 1). Legen Sie den Abdeckschein auf einen Glasobjektträger, um die Handhabung zu erleichtern. Mit 30 μL EBTT waschen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Entfernen Sie 30 μL der Lösung, um einen 30 μL Tropfen auf dem Deckglas zu verbleiben.
      HINWEIS: Alle Lösungen, in denen Würmer pipettiert werden, müssen kleine Mengen nichtionisches Reinigungsmittel zugesetzt werden, um zu verhindern, dass die Würmer an den Kunststoffspitzen haften.
   2. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Köpfe und/oder Schwänze der Würmer abzuschneiden, um die Gonade zu extrudieren (Abbildung 2A).
2. Fixierung
   1. 30 μL Fixierlösung (Tabelle 1) in den Tropfen der sezierten Würmer pipettieren und zum Mischen auf und ab pipen.
      HINWEIS: Ein paar Male nach oben und unten können helfen, mehr Gonaden freizusetzen.
   2. Nach Zugabe der Fixierlösung genau 1 min fixieren.
   3. Stoppen Sie die Fixierung, indem Sie die Würmer in ein mit TBST gefülltes PCR-Röhrchen überführen (Tabelle 1). Übertragen Sie die Würmer in so wenig Volumen wie möglich (~15 μL).
   4. Drehen Sie das PCR-Röhrchen auf einer Mini-Tischzentrifuge (2.000 × g, 10 s) herunter. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn 2x mit je 200 μL TBST.
   5. Mit 200 μL PBST (Tabelle 1) für 5-10 min waschen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.2.5 für bis zu vier Proben, während die zerlegten Proben auf Eis gehalten werden.
      HINWEIS: Wenn Sie mehr als vier Proben verarbeiten, fahren Sie mit den Schritten 2.2.6 bis 2.2.7 nach jeweils vier Proben fort, um sicherzustellen, dass die Probenfixierung über alle Proben hinweg konsistent bleibt.
   6. Die zerlegten Proben werden auf einer Mini-Tischzentrifuge (2.000 × g, 10 s) gedreht, das PBST entfernt und 50-100 μL kaltes Methanol (-20 °C) hinzugefügt.
      ACHTUNG: Methanol ist giftig. Tragen Sie Schutzausrüstung und vermeiden Sie das Einatmen.
   7. Mischen Sie durch Pipettieren auf und ab und lassen Sie die Proben für 30-60 s in Methanol. Waschen Sie die Proben 2x in 200 μL PBST.
      HINWEIS: Wenn Sie mehr als vier Proben verarbeiten, fahren Sie mit der Zerlegung der verbleibenden Proben fort (Schritte 2.1.1 bis 2.2.7).
   8. Waschen Sie die Proben ein drittes Mal mit 200 μL PBST.

3. Antikörperinkubationen

1. Blockierend
   1. Blockieren Sie die Proben in 1x Blockierlösung (Tabelle 1) für 45-60 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit kann von 30 min bei Raumtemperatur bis zu mehreren Tagen bei 4 °C reichen (Tests wurden bis zu 3 Tage durchgeführt).
2. Primäre Antikörperlösung
   1. Verdünnen Sie Anti-HTP-3 (Chicken⁴²) und Anti-HA (Maus) Antikörper (oder die Antikörper Ihrer Wahl) zu den Arbeitslösungen (1:250 für SMLM und 1:1.000 für STED-Mikroskopieproben) in 1x Blockierungslösung.
      HINWEIS: Antikörper, die zur Markierung von SMLM-Proben verwendet werden, sind konzentrierter als für STED-Proben, da für die SMLM-Mikroskopie eine höhere Markierungsdichte empfohlen wird.
   2. Drehen Sie die Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge (2.000 × g, 10 s), entfernen Sie den Blockierpuffer und fügen Sie 30-50 μL der primären Antikörperlösung hinzu. Über Nacht bei 4 °C (bevorzugt) oder 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Nach der Inkubation 3 x 5-15 min mit PBST waschen.
3. Arbeitslösung von F(ab')2-Fragmenten, die an Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sind
   1. Die markierten F(ab')2-Fragmente (Schritt 1.2.4) werden zu den Arbeitslösungen (1:100 für SMLM und 1:1.000 für STED-Mikroskopieproben) in 1x Blockierlösung verdünnt.
      HINWEIS: Für beide Super-Resolution-Techniken wurden zuvor berichtete Fluorophorpaare verwendet, nämlich AlexaFluor647/CF680 für SMLM und AlexaFluor594/Abberior STAR635P für STED. AlexaFluor647 und STAR645P wurden verwendet, um Anti-Maus (Fab')2-Fragmente zu markieren, um den C-Terminus von SYP-5 anzugreifen, und CF680/AlexaFluor594-markierte Anti-Hühnerfragmente (Fab')2, um HTP-3 anzugreifen.
   2. Drehen Sie die Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge (2.000 × g, 10 s), entfernen Sie das PBST und fügen Sie 30-50 μL sekundäre Antikörperlösung hinzu. Inkubieren Sie für 30 min bis 2 h bei Raumtemperatur (bevorzugt) oder über Nacht bei 4 °C. 3 x 5-15 min mit PBST waschen.

4. Befestigungsmuster auf einem Deckglas

1. Postfixierung
   HINWEIS: Verarbeiten Sie Proben einzeln durch die Schritte 4.1.1-4.2.1.
   1. Schleudern Sie die gefärbten Proben herunter und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 50 μL PBST^0,2 hinzu und übertragen Sie die gefärbten Würmer auf ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas Nr. 1.
      HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt frisches PBST 0,2 mit^0,2 % nichtionischem Reinigungsmittel (Tabelle 1), um zu verhindern, dass die Würmer am Deckglas haften.
   2. 5,7-6,3 μL postfixative Lösung werden auf ein Poly-L-Lysin-Deckglas pipetiert.
      HINWEIS: Poly-L-Lysin-Deckgläser, die bei 4 °C gelagert werden, sollten zuerst auf Raumtemperatur gebracht werden.
   3. Die sezierten Würmer werden im gleichen Volumen (5,7-6,3 μL) abgepipert und in den Fixiertropfen auf dem Poly-L-Lysin-Deckglas überführt (Abbildung 2B).
      HINWEIS: In diesem und dem folgenden Schritt ist es sehr wichtig, das sezierte Gewebe in der Mitte des Poly-L-Lysin-beschichteten Deckglases zu behalten. Dies ist besonders wichtig, wenn die Proben in einem benutzerdefinierten Halter montiert werden, um in das hier verwendete speziell angefertigte SMLM-Mikroskop zu passen (siehe Schritt 5.1, Abbildung 2B).
   4. Die Probe wird mit einem kleinen Deckglas (12 mm Durchmesser, Abbildung 2B) abgedeckt. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Stück Filterpapier (Abbildung 2B). Für 3-5 min in einer dunklen Kammer fixieren.
2. "Freeze-Cracking"
   1. Die Proben werden eingefroren, indem Sie sie auf einen Aluminiumblock in Trockeneis legen (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Der Aluminiumblock muss im Trockeneis gut gekühlt werden, bevor die Proben darauf gelegt werden. Fahren Sie mit der Nachfixierung der verbleibenden Proben fort (Schritte 4.1.1 bis 4.2.1). Die Probe muss sich vor dem nächsten Schritt mindestens 20 min oder bis zu 1 Stunde auf Trockeneis befinden (4.2.2).
   2. Entfernen Sie das kleinere Deckglas mit einem Rasierer (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Fahren Sie für STED mit Schritt 5.2.1 fort. Fahren Sie für SMLM mit Schritt 4.2.3 fort.
   3. Tauchen Sie das Deckglas für ca. 10 s in ein 50-ml-konisches Röhrchen mit eiskaltem PBS (bevorzugt) oder -20 °C Methanol.
      HINWEIS: Die Temperatur ist ein sehr wichtiger Faktor für diesen Schritt. Verwenden Sie daher PBS, das frisch aufgetaut oder in einem Eis- / Ethanolbad aufbewahrt wird.
   4. Legen Sie das Deckglas in eine Vertiefung einer mit PBST-Puffer gefüllten Platte mit sechs Vertiefungen. Entfernen Sie das PBST aus den Vertiefungen und fügen Sie frisches PBS hinzu. Lassen Sie die Proben 5 min in PBS.
      HINWEIS: Pipeten Sie das PBS auf die Seite des Bohrlochs, um eine Beschädigung und Ablösung der Proben zu vermeiden.
   5. Mit frischem PBS waschen und die Proben bis zur Bildgebung bei 4 °C belassen.
      HINWEIS: Die Proben sind bis zu 2 Wochen stabil, aber die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Proben innerhalb von 2 Tagen abgebildet werden.
   6. Beurteilen Sie vor der Bildgebung die Qualität der Probenmontage unter einem Stereomikroskop.
      HINWEIS: Erfolgreich montierte Keimbahnen sind stabil befestigt, ohne erkennbare Bewegung relativ zum Deckglas. Schlecht befestigte Keimbahnen flattern in der Pufferlösung.

5. Bildgebung

1. Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie
   HINWEIS: Die Bilder wurden im EMBL Imaging Centre mit einem speziell angefertigten Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskop aufgenommen, das um einen kundenspezifischen Körper herum konstruiert wurde, wie bereits berichtet.^38,43, mit den einzigartigen Merkmalen, die in der Tabelle der Materialien; Siehe https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
   1. Erfassung der 3D-Perlenkalibrierung
      1. Bereiten Sie ein Präzisionsdeckglas (24 mm Durchmesser; 0,17 ± 0,005 mm, Nr. 1,5) mit anhaftenden 100 nm fluoreszierenden Perlen vor, wie zuvor^{beschrieben 38,44}.
      2. Legen Sie die Kalibrierprobe aus Schritt 5.1.1.1 auf einen Probenhalter.
      3. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das saubere 100x/1,5-Ölobjektiv und montieren Sie die Kalibrierprobe auf dem Mikroskop.
      4. Geben Sie in MicroManager 2^{45,46 15-20} Positionen in der Kalibrierprobe an.
      5. Richten Sie im EMU-Plug-in-Fenster⁴⁷ die Erfassung eines Z-Stack-Bildes für jede der Positionen aus Schritt 5.1.1.5 ein.
         HINWEIS: Hier liefert eine zylindrische Verbindungslinse den für die 3D-Bildgebung erforderlichen Astigmatismus, und für jede Position wurden 201 z-Scheiben im Bereich zwischen -1 μm und 1 μm mit einem Inkrement von 10 nm erfasst. Eine 2 kW/cm² 640 nm Laserbeleuchtung wurde für 25 ms für jeden z-Slice verwendet.
      6. Erfassen Sie die Z-Stack-Bilder der 100-nm-Fluoreszenzperlen über einen identischen optischen Pfad, der zur Aufnahme von Probenbildern in Schritt 5.1.11 verwendet wird.
      7. Generieren Sie mithilfe der hochauflösenden Mikroskopie-Analyseplattform (SMAP⁴⁸) ein cspline-Modell der experimentellen Punktspreizfunktion (PSF), das zur Anpassung der 3D-SMLM-Daten in Schritt 5.1.13 verwendet wird.
   2. Bereiten Sie den Probenhalter vor. Für den hier verwendeten speziell angefertigten Halter, der einen Magnetring zur Erstellung der Bildkammer verwendet (Abbildung 2B), umwickeln Sie den Magnetring mit Parafilm.
      HINWEIS: Alternativ kann ein Objektträger mit einem konkaven Vertiefungshohlraum verwendet werden, um Proben für Mikroskope mit Objektträgerhaltern zu montieren.
   3. Bereiten Sie 1 ml Bildgebungspuffer⁴⁴ vor (Tabelle 1).
   4. Nehmen Sie ein Deckglas aus Schritt 4.2.6 und legen Sie es in die maßgeschneiderte Halterung. Befestigen Sie das Deckglas in der Halterung mit dem mit Parafilm umwickelten Magnetring (Schritt 5.1.2).
   5. Pipeten Sie vorsichtig den Bildpuffer (Schritt 5.1.3) in der Kammer, die durch den Magnetring auf der Oberseite der Probe erzeugt wird (Abbildung 2B). Verschließen Sie die Kammer mit einem Stück Parafilm.
   6. Um die Probe zu montieren, fügen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das saubere 100x/1,5-Ölobjektiv hinzu. Ohne Luft in das Tauchöl einzuführen, legen Sie den Probenhalter mit der montierten Probe (Schritt 5.1.5) vorsichtig auf den Mikroskoptisch.
      HINWEIS: Bevor Sie die Probe auf das Mikroskop legen, reinigen Sie den Boden des Deckglases mit Gewebe und 70% Ethanol.
   7. Bewegen Sie die Piezostufe unter Verwendung des EMU-Plug-in-Fensters 47 in MicroManager 2^45,46, bis das Signal des Fokussperrlasers an der Quadranten-Fotodiode (QPD) erkannt wird.
      HINWEIS: Um einen festen Fokus über die Abbildungszeit aufrechtzuerhalten, wird die Fokusverriegelung durch vollständige interne Reflexion eines nahinfrarot-fasergekoppelten Lasers vom Deckglas und anschließende höhenempfindliche Detektion auf einer Quadranten-Fotodiode (QPD) erreicht. Das QPD-Signal ermöglichte die Regelung des Objektiv-Piezoanschlusses mit geschlossenem Regelkreis.
   8. Nehmen Sie ein Back-Focal Plane-Bild mit einem 640-nm-Anregungslaser bei geringer Leistung (d. h. 1-5%) auf, um das Fehlen von Luftblasen im Immersionsöl zu bestätigen.
      HINWEIS: Entfernen Sie die Probe von der Bühne, wenn eine Luftblase erkannt wird. Reinigen Sie die Unterseite des Deckglases und das Objektiv, und wiederholen Sie die Schritte 5.1.6-5.1.8. Fahren Sie andernfalls fort, den Fokus in der EMU-Software⁴⁷ zu sperren.
   9. Lokalisieren Sie das Gonadengewebe mit der Hellfeldbeleuchtung. Konzentrieren Sie sich mit einer 640-nm-Beleuchtung mit geringer Intensität auf den Abschnitt des Gewebes, der viele SC-Dehnungen enthält.
      HINWEIS: Konzentrieren Sie sich nicht auf Strukturen, die mehr als 2 μm vom Deckglas entfernt sind. Verwenden Sie keine höhere Laserleistung, um die Probe zu lokalisieren, da dies einige Fluorophore vorzeitig in einen blinkenden Zustand versetzen kann. Hier wurde 1 kW/^cm2 im Steigbetrieb mit einem auf 1.000 eingestellten Impuls verwendet.
   10. Belichten Sie die Probe mit 640 nm Beleuchtung bei hoher Bestrahlungsstärke (27 kW/cm²) für ~30 s, bis eine angemessene Blinkrate erreicht ist (ergänzendes Video 1).
   11. Erfassen Sie 200.000 Bilder mit einer Belichtungszeit von 20 ms mit dem multidimensionalen Erfassungswerkzeug in MicroManager 2^45,46.
   12. In der Zwischenzeit richten Sie die UV-Aktivierung mit der Aktivierungsoption des EMU-Plugins^38,47 ein^, um die gewünschte Blinkrate beizubehalten.
       HINWEIS: Verwenden Sie den UV-Laser bei einer Bestrahlungsstärke von 3 kW/cm² im Anstiegsmodus mit einer maximalen Pulslänge von 10.000.
   13. Führen Sie eine SMLM-Bildrekonstruktion und -nachbearbeitung durch.
       HINWEIS: Informationen zur Rekonstruktion von Bildern aus SMLM-Rohdaten finden Sie unter Veröffentlichte Methoden. Die hier dargestellten Daten wurden mit der Software SMAP^48,49 verarbeitet. Superaufgelöste Bildrekonstruktion, Kanalzuweisung, Driftkorrektur und Filterung von Lokalisierungen mit schlechter Lokalisierungspräzision und einem Maximum-Likelihood-Filter wurden in der SMAP^48-Software durchgeführt.
2. Stimulierte Emissionsverarmungsmikroskopie
   HINWEIS: Die Bilder wurden auf dem integrierten mikroskopischen STED-System aufgenommen, das mit einem Weißlichtlaser, einem gepulsten 775-nm-STED-Laser und dem FALCON F-Luorescence Lifetime IM-Alterungsmodul (Table of Materials) im EMBL Imaging Centre (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre) ausgestattet ist.
   1. Legen Sie einen 20 μL Tropfen Montagemedium (Table of Materials) auf einen Objektträger. Nehmen Sie ein Deckglas aus Schritt 4.2.2 und legen Sie die Probe vorsichtig auf den Objektträger, der dem Montagemedium zugewandt ist (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Einführen von Lufteinschlüssen innerhalb des Montagemediums.
   2. Lassen Sie das Montagemedium über Nacht aushärten.
      HINWEIS: Nehmen Sie die Proben am folgenden Tag auf oder bewahren Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C auf.
   3. Um die Probe zu montieren, wird ein Tropfen Tauchöl auf das Deckglas der Probe aus Schritt 5.2.2 gegeben. Legen Sie die Probe vorsichtig mit einem 100x/1,40 Ölobjektiv auf den Mikroskoptisch.
   4. Fokussieren Sie sich auf die Probe und lokalisieren Sie das Keimbahngewebe mit Hilfe der Hellfeldbeleuchtung.
   5. Geben Sie mithilfe der Mikroskopsoftware den interessierenden Bereich an, für den das TauSTED-Bild aufgenommen wird.
   6. Wählen Sie die Anregungslaser und ihre geeignete Leistung aus, um die in der Probe verwendeten Fluorophore anzuregen.
      HINWEIS: Hier wurde der 580-nm-Laser mit 4% Leistung verwendet, um AlexaFluor 594-konjugierte F(ab')2-sekundäre Antikörperfragmente und 635 nm mit 3% Leistung abzubilden, um STAR 635P-konjugierte F(ab')2-Fragmente abzubilden.
   7. Wählen Sie mit der Mikroskopsoftware eine geeignete STED-Erschöpfungslaserleistung aus und richten Sie die Bilderkennung ein.
      HINWEIS: Hier wurde die 775 nm STED-Depletionslaserleistung auf 40% eingestellt. Der Detektor wurde im Zählmodus mit einem Verstärkungswert von 10 für die Photonendetektion, mit einer Abtastrate von 100 Hz und einer Pixelgröße von 17 nm verwendet. Die vierzeilige Akkumulation wurde für die Erfassung von TauSTED verwendet.

Results

Um das SC innerhalb des C. elegans-Keimbahngewebes durch SMLM abzubilden, haben wir 2-Farben-ratiometrisches 3D-SMLM verwendet, um HTP-3, eine Komponente der Chromosomenachsen, und den C-Terminus des transversalen Filaments SYP-5 endogen mit einem Hämagglutinin (HA) -Tag zu lokalisieren. Die Lage beider Proteine innerhalb des SC von C. elegans wurde zuvor durch andere Studien bestimmt^16,30.

Um Lichtstreuung und optische Aberrationen in dicken biologischen Proben zu minimieren, haben wir den untersten z-Schnitt der meiotischen Kerne abgebildet, die die SCs enthalten (Abbildung 3, gelbe Linien). Für jedes aufgenommene Bild wurde die Piezo-Stufenposition der Abbildungsebene relativ zur Piezo-Stufenposition markiert, wenn das Objektiv auf das Deckglas fokussiert wurde. Dies ermöglichte die Berechnung des Piezoabstands vom Deckglas. Erfolgreich montierte Proben werden stabil in der Nähe des Deckglases befestigt und behalten die Gonadenform (d.h. das Gewebe wird während des Postfixationsschritts nicht zwischen den beiden Deckgläsern zerquetscht). Die Qualität der Probenmontage kann leicht unter einem Stereomikroskop beurteilt werden, da gut befestigte Gonaden in Lösung keine Bewegung zeigen (Schritt 4.2.6). Aufgrund der Stochastizität des Montageprozesses wird das Gonadengewebe jedoch nicht unbedingt vollständig flach auf dem Deckglas ausgelegt. Daher kann die untere Ebene der Kerne, die SCs enthalten, in unterschiedlichen Abständen relativ zum Deckglas innerhalb derselben Gonade gefunden werden.

Um zu veranschaulichen, wie sich die Auflösung in Abhängigkeit von der Befestigung des Gewebes am Deckglas ändert, haben wir Bilder in verschiedenen Piezoabständen zum Deckglas aufgenommen. Um die Qualität eines einzelnen Bildes zu beurteilen, wurden die Fourierringkorrelationskurven (FRC)^50,51 berechnet und die Auflösung wurde mit dem FRCResolution-Plugin innerhalb der SMAP-Software⁴⁸ bestimmt. Zwei repräsentative Kerne, die aus zwei separaten 3D-SMLM-Bildern extrahiert wurden, die in unterschiedlichen Abständen zum Deckglas aufgenommen wurden, sind in Abbildung 4 dargestellt. Bei SCs, die sich in der Nähe des Deckglases befinden, sind die Chromosomenachsen und der C-Terminus von SYP-5::HA in allen drei Dimensionen gut aufgelöst (Abbildung 4A, 0,8 μm vom Deckglas). Um zwei Strukturen aufzulösen, die durch einen bestimmten Abstand getrennt sind, muss die erreichte FRC-Auflösung in der Regel kleiner als die Hälfte dieses Abstands in der axialen Auflösung sein.

Um die gleichen Strukturen seitlich zu trennen, müssen noch kleinere FRC-Auflösungswerte erreicht werden. Tatsächlich beträgt die FRC-Auflösung in Proben, die sich in unmittelbarer Nähe des Deckglases befinden, 38 nm für den AlexaFluor 647-Kanal und 34 nm für den CF680-Kanal und damit deutlich unter dem erwarteten Abstand von 84 nm zwischen den C-Termini von SYP-5¹⁶. Diese Entschließung löst daher leicht die Organisation des SC nicht nur in frontaler, sondern auch in lateraler Sicht (Abbildung 4B i,ii). Im Gegensatz dazu verschlechtert sich die Auflösung in SCs, die sich in einem Abstand von 5 μm vom Deckglas befinden, aufgrund von Lichtstreuung und sphärischen Aberrationen (Abbildung 4B). Die FRC-Auflösungen in diesem Abstand sinken auf 47 nm (AlexaFluor 647) und 41 nm (CF680), was die C-Termini von SYP-5 nicht vollständig auflösen kann. Da die optischen Aberrationen die laterale Auflösung stärker beeinträchtigen als die axiale Auflösung, werden HTP-3- und SYP-5-Bänder im Querschnitt der Seitenansicht in Proben, die sich in einem Abstand von 5 μm vom Deckglas befinden, nicht mehr eindeutig aufgelöst (Abbildung 4B ii). Der Vergleich der FRC-Auflösung von Bildern, die in verschiedenen Piezoabständen vom Deckglas aufgenommen wurden, ergab, dass das abgebildete Gewebe nicht weiter als 2 μm vom Deckglas entfernt sein sollte (Abbildung 5). Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung der korrekten Ausführung des Postfixationsschritts, bei dem das Gewebe erfolgreich mit der Poly-L-Lysin-Beschichtung des Deckglases vernetzt werden muss.

Um die erreichbare Auflösung mit einer anderen Super-Resolution-Technik zu demonstrieren, haben wir auch SCs in festem intaktem Keimbahngewebe mit TauSTED-Mikroskopie abgebildet. Abbildung 6A zeigt TauSTED-Bilder mit der höchsten und niedrigsten Auflösung, die in dieser Studie erreicht wurde, geschätzt aus Linienprofilen des SC in Frontalansicht (Abbildung 6B). In beiden Kernen konnten wir die beiden Lokalisationsbanden von HTP-3 in den Chromosomenachsen und die C-Termini von SYP-5 in der zentralen Region auflösen, was zeigt, dass die in TauSTED mit diesem optimierten Protokoll erreichbare Auflösung unter 84 nm liegt. Unter optimalen Bedingungen (Abbildung 6A, oben) konnten wir die C-Termini in leicht geneigten Ansichten des SC auflösen, die nur 50 nm voneinander entfernt waren (Abbildung 6A, gelbes Rechteck und 6C).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Organisation des synaptonemalen Komplexes bei Caenorhabditis elegans. Der Cartoon zeigt eine vereinfachte Struktur des SC in C. elegans , die zwei homologe Chromosomen (grau) überbrückt. Die Struktur wird in Frontal-, Seiten- und Querschnittsansichten dargestellt. Chromosomenachsen werden als rote Balken dargestellt, während transversale Filamente in Cyan dargestellt werden. Transversale Filamentproteine (SYP-1, 5, 6 in C. elegans) sind im zentralen Bereich Kopf an Kopf (Cyan-Ball-Stick-Grafik) ausgerichtet, um den Abstand zwischen den beiden Achsen zu überbrücken. Die erwarteten Abstände zwischen den Achsen und den C-Termini von Querfilamenten werden angegeben. Abkürzung: SC = synaptonemaler Komplex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Illustration der in der Studie verwendeten Probenvorbereitung . (A) Junge Erwachsene C. elegans werden am Kopf oder Schwanz seziert (grüne, gestrichelte Linien) und wie im Protokoll beschrieben verarbeitet. (B) Einzelne Schritte des Verfahrens sind mit Grafiken gekennzeichnet, die mit grauen Pfeilen verbunden sind. Abkürzungen: STED = stimulated-emission depletion; SMLM = Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Lage des Gewebeschnitts, der durch Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie beobachtet werden kann. MIP einer sich drehenden Scheibe konfokales Bild einer ganzen Mount C. elegans Gonade. Das Gewebe wurde für HTP-3 und den C-Terminus von SYP-5 (SYP-5::HA) gefärbt, und das kombinierte Signal ist grau dargestellt. Einzelne konfokale Bilder wurden mit dem Grid / Collection Stitching Fiji Plugin⁵² zusammengefügt, um ein Bild der gesamten Gonade zu erstellen. Der Einschub zeigt eine xy-Ansicht der untersten z-Ebene, die die SCs enthält. Die Lokalisation dieser Ebene ist in orthogonalen Ansichten des Gewebeschnitts dargestellt, der durch ein Rechteck im MIP-Bild der Gonade (gelbe Linien) angezeigt wird. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: MIP = Maximum Intensity Projection; SCs = synaptonemale Komplexe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von HTP-3 und den C-Termini des SYP-5. (A,B) Links: SMLM-Bilder, die Pachytenkerne zeigen, die auf HTP-3 (rot) gefärbt sind, und den C-Terminus von SYP-5 (SYP-5::HA, Cyan) (Maßstabsbalken = 1 μm). Mitte: Vergrößerte Bilder von Regionen von Interesse, die in A und B angezeigt werden, mit entsprechenden Querschnittsansichten unter jedem Bild (i, ii; Maßstabsbalken = 100 nm). Die Abschnitte des SC in vergrößerten Bildern werden gedreht, um die Chromosomenachsen parallel zur y-Achse auszurichten. Rechts: Grafische Darstellung der Lokalisierung der interessierenden Proteine innerhalb des SC, die die Orientierung des SC in den vergrößerten Regionen darstellt, die in der Mitte der Abbildung angezeigt werden. Abkürzungen: SMLM = Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie; SC = synaptonemaler Komplex. Rohdaten zur Rekonstruktion von SMLM-Bildern sind über die BioStudies-Datenbank⁶⁰ verfügbar (Zugangs-ID: S-BIAD504). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Die Fourierring-Korrelationsauflösung von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiebildern hängt vom Abstand der abgebildeten z-Ebene von der Ebene des Deckglases ab. Farbige Linien zeigen FRC-Kurven von Bildern, die in unterschiedlichen Abständen (wie durch den Farbbalken dargestellt) vom Deckglas aufgenommen wurden. Der 1/7-Schwellenwert, der zur Bestimmung der FRC-Auflösung verwendet wird, wird durch eine schwarze horizontale Linie angezeigt. Einschübe zeigen die Abhängigkeit der FRC-Auflösung vom Piezoabstand vom Deckglas. Das Plotten erfolgte durch ein eigens geschriebenes R-Skript (Version 4.1.2, Supplementary File 1), in dem Originalkurven mit Funktionen aus dem Paket "ggplot2" geglättet wurden. Abkürzungen: FRC = Fourierringkorrelation; SMLM = Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie; SC = synaptonemaler Komplex. Daten für FRC-Kurven und SMLM-Daten sind über die BioStudies-Datenbank⁶⁰ verfügbar (Zugangs-ID: S-BIAD504). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Stimulierte Emissionsabbaumikroskopie, verstärkt durch Fluoreszenzlebensdauer-basierte Information (TauSTED), löst zwei Lokalisierungsbanden sowohl für HTP-3 als auch für den C-Terminus von SYP-5 auf. (A) Zwei repräsentative TauSTED-Bilder zeigen Pachytenkerne gefärbt für HTP-3 (rot) und den C-Terminus von SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) mit höherer (oben) und niedrigerer (unten) Strukturdefinition (Maßstabsbalken = 1 μm). Die Rechtecke markieren Bereiche mit den aufgelösten C-Termini von SYP-5 frontal (weiß) und einer leicht geneigten Ansicht (gelb) des SC. (B,C) Verteilung des HTP-3 (rot) und des C-Terminus des SYP-5 (cyan) Signals aufgelöst durch TauSTED. Linienprofile von Regionen von Interesse, die das SC in frontalen (B) oder leicht geneigten (C) Ansichten enthalten, werden als vollständige Linien mit Intensität auf den Maximalwert normalisiert. Linienprofile wurden mit Fiji ImageJ erstellt. Gestrichelte Linien in B zeigen die gemittelten Daten für jedes Protein. Die dicke Cyanlinie in C entspricht dem Linienprofil mit dem kürzesten aufgelösten Abstand zwischen den C-Termini von SYP-5. Um die Abstände zwischen den Antikörpern zu bestimmen, die auf bestimmte Proteine abzielen, wurden die Linienprofile (n = 9 (B), n = 7 (C)) mit einem eigens geschriebenen R-Skript (Version 4.1.2, Supplementary File 1) mit Doppelgaussien versehen. Der mittlere Abstand ± die Standardabweichung (B) und der Bereich mit fett hervorgehobenem Mindestwert (C) sind jeweils oben in jedem Diagramm angegeben. Abkürzungen: STED = stimulated emission depletion microscopy; SC = synaptonemaler Komplex. Angezeigte Bilder und Datenpunkte von gezeichneten Linienprofilen sind über die BioStudies-Datenbank⁶⁰ verfügbar (Zugangs-ID: S-BIAD504). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Puffer und Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie-Erfassung. Video zeigt Fluorophore, die mit einer angemessenen Rate blinken (50 Bilder werden gezeigt, Maßstabsbalken = 5 μm, 20 ms/Bild). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Datenanalyseskript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die leiterartige Organisation des SC, die für die korrekte Rekombination und Segregation homologer Chromosomen essentiell ist, wurde erstmals vor fast 70 Jahren in der Elektronenmikroskopie^{beobachtet 3,4}. Während die Gesamtorganisation des SC in der Elektronenmikroskopie leicht aufgelöst werden kann, erfordert die Lokalisierung einzelner Komponenten innerhalb dieses Komplexes einen gezielteren Ansatz. Mit seiner Breite von nur ~100 nm kann die Substruktur des SC nicht durch herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden. Die hochauflösende Mikroskopie ist jedoch zu einem wichtigen Treiber für neue Entdeckungen über die Struktur und Funktion des synaptonemalen Komplexes 16,19,24,25,26,27,28,29,30 geworden. Um diese Forschung zu erleichtern, haben wir ein Montageverfahren demonstriert, das es ermöglicht, die Architektur des SC im C. elegans-Gonadengewebe mit SMLM- und STED-Mikroskopie zu untersuchen.

Ein entscheidender Schritt zur Optimierung der Auflösung in der SMLM-Bildgebung ist die direkte Vernetzung des Keimbahngewebes mit einem Poly-L-Lysin-beschichteten Deckglas (Schritt 4). Die kovalente Anheftung des Gewebes an das Deckglas ist unerlässlich, um Bewegungen innerhalb der Probe zu reduzieren, die zu großen Drifts führen und die Bildgebung über lange Zeiträume für SMLM unmöglich machen würden. Darüber hinaus führt selbst eine suboptimale Bindung, die die Kerne, die SCs enthalten, in einiger Entfernung vom Deckglas belässt, zu einem signifikanten Abfall der erreichbaren Auflösung aufgrund sphärischer Aberrationen (Abbildung 4). Alternativ zu der hier verwendeten kovalenten Bindung kann gefärbtes Keimbahngewebe auch zwischen zwei versiegelten Deckgläsern in einem kleinen Tropfen Bildgebungspuffer^19,30 immobilisiert werden. Diese Immobilisierungsmethode reduziert jedoch das Volumen des Bildgebungspuffers in der Probe stark von 1 ml, das im hier optimierten Protokoll verwendet wird, auf nur wenige μL, was zu einer Ansäuerung des Bildgebungspuffers führt und die Zeit, für die die Probe abgebildet werden kann, stark verkürzt 38,53,54.

Lange Aufnahmezeiten sowohl für die SMLM- als auch für die STED-Mikroskopie beschränken den Einsatz dieser Methoden auf die Bildgebung chemisch fixierter Proben. Hier sorgt die Paraformaldehydfixierung dafür, dass die Struktur des SC während der Probenvorbereitung und Bildgebung erhalten bleibt. Trotz der hier getroffenen Vorsichtsmaßnahmen, um das SC in intaktem Gewebe abzubilden, ist die resultierende Struktur des SC nach der Fixierung nicht notwendigerweise identisch mit der Struktur in seinem nativen Zustand innerhalb eines lebenden Organismus. Da ein einzelnes Bild des fixierten SC eine einzige "Momentaufnahme" der biologischen Struktur darstellt, bleibt dieser Ansatz für die Dynamik der nativen Struktur in vivo blind.

Informationen über die Dynamik und Variabilität makromolekularer Strukturen lassen sich aber auch gewinnen, indem man nicht nur eine, sondern viele "Momentaufnahmen" aufnimmt. Während dieser Ansatz Veränderungen in der Struktur des SC während Pachyten¹⁹ beheben kann, gibt es mehrere Faktoren, die die Anzahl der Bilder begrenzen, die von einer einzigen Probe aufgenommen werden können, die mit diesem Protokoll erstellt wurde. Erstens führen die hohen Laserleistungen, die während der Bildaufnahme verwendet werden, zu einem dauerhaften Bleichen der Fluorophore und schließen die Abbildung benachbarter Regionen von Interesse oder mehrerer Z-Ebenen aus, wodurch die Anzahl der Bilder, die von einer einzigen Probe aufgenommen werden können, erheblich reduziert wird. Zweitens ist die Proben-/Gewebedichte auf dem mit dieser Methode hergestellten Deckglas gering, was die Anzahl der Bilder, die von einem einzelnen Deckglas aufgenommen werden können, erheblich einschränkt. Die geringe Probendichte verbietet auch die Verwendung automatisierter Bildakquisitionspipelines, die dazu beigetragen haben, Licht auf andere biologische Fragen zu werfen 34,55,56,57,58,59. Die Probendichte kann jedoch von einem erfahrenen Benutzer leicht erhöht werden.

Das hier vorgestellte Protokoll ist optimiert, um eine hohe Markierungsdichte zu erhalten, die notwendig ist, um eine optimale Auflösung in SMLM³⁵ zu erreichen. Während frühere Protokolle das Gewebe vor der Immunfärbung kovalent an das Deckglas anheften¹⁶, verbindet dieses neue Protokoll das Gewebe erst mit dem Deckglas, nachdem die Proben in Lösung gefärbt wurden. Diese Modifikation ermöglicht es den Antikörpern, die für die Immunmarkierung verwendet werden, von allen Seiten frei auf das Gewebe zuzugreifen, während die kovalente Anheftung des Gewebes an das Deckglas verhindern kann, dass Antikörper die Kerne erreichen, die dem Deckglas am nächsten sind, wodurch der Grad der Markierung verringert wird. Zusammen verbessern die hier beschriebenen Modifikationen die Auflösung von 40-50 nm (FRC-Auflösung)¹⁶ auf 30-40 nm (dieses Protokoll).

Wichtig ist, dass zwar eine hohe Markierungsdichte und eine hohe Konzentration von Antikörpern für SMLM unerlässlich sind, wir jedoch festgestellt haben, dass bessere STED-Mikroskopiebilder mit niedrigeren Antikörperkonzentrationen erhalten werden (Schritt 3). Bei einer Auflösung von mehreren zehn Nanometern wird die Größe der Moleküle, mit denen das interessierende Protein markiert wird, immer wichtiger. Wir haben daher F(ab')2-Fragmente verwendet, die halb so groß sind wie Antikörper voller Länge. Die Verbesserung des lokalen Kontrasts aufgrund einer kleineren Signalquelle und damit die durch diese Modifikation gewonnene Auflösung im Vergleich zur Verwendung von vollständigen sekundären Antikörpern ermöglichte die Auflösung der beiden C-Termini von SYP-5 innerhalb der zentralen Region durch TauSTED, die nicht durch konventionelle STED mit Antikörpern voller Länge aufgelöst werden (¹⁶ und Daten nicht gezeigt). Wir gehen davon aus, dass dieses optimierte Protokoll für die Bildgebung von SCs in intakten C. elegan-Keimbahnendie Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des SC während der Meiose erleichtern wird.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1,5 Öl Objektiv	Olympus	UPLAPO100XOHR	UPLAPO100XOHR
2-Mercaptoethylamin (MEA)	Sigma-Aldrich	30070-10G	Gelöst in MilliQ Wasser in 5 M Lösung, pH  8,7 eingestellt mit HCl. Aliquotiert auf ein Einwegvolumen, eingefroren und bei -80 °C gehalten.
Zusätzlicher 640-nm-Booster-Laser	Toptica	IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS-Ester	ThermoFischer Scientific	A37572	Gelöst in DMSO in 1 mM Lösung, aliquotiert auf Einmalvolumen, eingefroren und bei -80 & deg gehalten; C
AlexaFluor 647, NHS-Ester	ThermoFischer Scientific	A37573	Gelöst in DMSO bis 1 mM Lösung, aliquotiert auf das Einmalvolumen, eingefroren und bei -80 μg gehalten; C
anti-HA	Thermo Fisher Scientific	2-2.2.14	Maus monoklonal, 1:250 (SMLM), 1:1.000 (STED Mikroskopie)
anti-HTP-3	ein Geschenk von Abby F. Dernburg	MacQueen et al., 2005	Huhn polyklonal, 1:250 (SMLM), 1:1.000 (STED Mikroskopie)
Caenorhabditis elegans Stamm  YKM349	ein Geschenk von Yumi Kim	Hurlock et al., 2020	syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS-Ester	Biotium	92139	In DMSO zu 1 mM Lösung gelöst, aliquotiert auf Einwegvolumen, eingefroren und bei -80 ° gehalten; C
Rundes Deckglas 12 mm Nr. 1	Menzel-Glä Ser; VWR	631-0713
Rundes Deckglas 24 mm Nr. 1.5	Carl Roth	PK26.1
Zylinderlinsen	Thorlabs	LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x)		Edgar 1995	250 mM HEPES, 1,18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7,4
Ethanol (absolut für die Analyse)	Merck	64-17-5
F(ab')2 Fragmente Anti-Hühner-IgY	Jackson Immunoresearch	AB_2340347	Esel polyklonal, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (STED-Mikroskopie)
F(ab')2 Fragmente Anti-Maus IgG	Jackson Immunoresearch AB_2340761		Donkey polyklonal, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Objektträger T/F Geschliffen 0,8-1,0 mm dick	Fisher Scientific	7107
Gauge Worm Pick 30 Durchmesser 0,254 mm - Iridium 10%	Kisker	789265
Glukoseoxidase/Katalase-Enzymmischung (GlOX/Cat) ein	Geschenk von Jonas Ries	Höß, Mund, Reitberger, & Ries, 2018	20x, 1916 U/mL Glukoseoxidase (Sigma G7141), 42350 U/ml Katalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 51% Glycerin, MilliQ Wasser. Gelagert bei -20 °C.
Imaging Buffer Base	ein Geschenk von Jonas Ries	Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018	50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 10 % D-Glucose. Aliquotiert auf ein Einmalvolumen (950 μ L), gefroren und bei -80°C gehalten.
Invitrogen ProLong Glas Eindeckmittel	ThermoFischer Scientific	P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON	Leica	N/A	Das Mikroskop ist ausgestattet mit dem Weißlichtlaser der neuesten Generation, einem gepulsten 775-nm-STED-Laser, dem FALCON Fluorescence Lifetime IMaging-Modul, HC PL APO CS2 100x/1,40 Ölobjektiv und Leica HyD X Detektor. Das System ist in der Lage, das FLIM-Modul mit Tau-STED zu unterstützen, das die spezifische Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs misst und daher in der Lage ist, Hintergrundsignale basierend auf Unterschieden in der Fluoreszenzlebensdauer der Farbstoffe und den Farbstoffbedingungen in der Probe zu entfernen. Zusätzlich wird die Auflösung erhöht, indem die Variation der Fluoreszenzlebensdauer in verschiedenen Bereichen des Depletion-Donuts berücksichtigt wird.
Langwellenkanal-Emissionsfilter	AHF Analysentechnik	F47-702	700/100 nm
Bandpass Methanol (absolut für die Analyse)	Merck	67-56-1
NaHCO3	Sigma-Aldrich/Merck	S5761-500G	100 mM NaHCO3, pH 8,3
Nahinfrarot-fasergekoppelter Laser	Toptica	IBEAM-SMART-PT-CD	Custom Design, 808 nm - 75mW
Objektiv Piezo Mount (PIFOC	Physik Instrumente	P-726.1.CD	100 µ m Reichweite
Orca Fusion BT sCMOS Kamera	Hamamatsu	C15440-20UP
PCR-Röhrchen	Greiner Bio-One	673283	0,2 mL
Phosphat Kochsalzpuffer (PBS 10x)		N/A	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Durchstechen 16 % Formaldehyd (w/v), methanolfrei	ThermoFischer Scientific	28906	16 % Formaldehyd wird aus der Original-Glasampulle in ein 1,5 mL Röhrchen überführt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
PlasmaPrep2 Plasmareiniger	GaLa Instrumente GmbH	N/A
Poly-L-Lysinhydrobromid	Sigma-Aldrich/Merck	P2636-25MG	0,1% w/v Lösung wurde in Milli-Q Wasser hergestellt und in Aliquoten bei -20 μC gelagert.
Primär dichroitisch (Beleuchtung reflektierend)	AHF Analysentechnik	F73-866S	Quad Bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch Filter	AHF Analysentechnik	F40-072	405/488/561/640 nm
Quadranten-Fotodiode (QPD)	Laser Components	SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Rasierklingen	Apollo Herkenrath Solinger	N/A
Der refraktive Strahlformer	AdlOptica	PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagenz	Roche	11096176001	10x Lösung wurde gemäß den Empfehlungen hergestellt. Gefrorene Aliquots wurden bei -20 °C gelagert.
Skalpellklinge (Federmarke #11, Nr. 3)	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1110911
Skalpell-Entnahmebox	Fisher scientific	10002-50
Sekundärdichroitisch (emissionsreflektierend)	AHF Analysentechnik	F38-785S	750 nm
Langpass Kurzpassfilter	Semrock	BSP01-785R-25	750 nm
Kurzwellenkanal-Emissionsfilter	AHF Analysentechnik	F37-677	676/37 nm Bandpass
Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskop	EMBL Imaging Centre	Diekmann et al., 2020 mit Modifikationen Das	Mikroskop bietet eine Weitfeld-Epi-Beleuchtung über eine fasergekoppelte Singlemode-Laser-Engine, einen zusätzlichen Booster-Laser und einen refraktiven Strahlformer, um ein gleichmäßiges Beleuchtungsfeld zu erzeugen (Stehr et al., 2019). Weitfeldbilder werden mit einer sCMOS-Kamera aufgenommen  und geeignete Relaisoptiken für eine Systemvergrößerung von 61x und eine Pixelgröße von 106 nm. Für die ratiometrische Abbildung von spektral überlappenden dunkelroten Farbstoffen erzeugt ein Bildsplitter zwei spektral unterschiedliche Bilder auf der Kamera (dichroitischer Splitting: 665 nm Langpass, Kurzwellenkanal-Emissionsfilter: 676/37 nm Bandpass, langwelliger Emissionsfilter: 700/100 nm Bandpass). Ein zusätzlicher 405/488/561/640 nm Quadnotch-Filter und ein 750 nm Kurzpassfilter sind für beide Pfade gleich und sorgen für zusätzliche Laserblockierung) Eine zusammengesetzte zylindrische Linse sorgt für den für die 3D-Bildgebung erforderlichen Astigmatismus. Um einen festen Fokus bei Aufnahmen von mehr als 2 Stunden (bestehend aus 200 000 - 250 000 Bildern) aufrechtzuerhalten, Die Fokuskopplung wird durch die interne Totalreflexion eines fasergekoppelten Lasers im nahen Infrarot erreicht. aus dem Deckglas und der anschließenden höhenempfindlichen Detektion auf einer Quadranten-Fotodiode (QPD). Das QPD-Signal ermöglichte die Regelung des Piezo-Anschlusses des Objektivs. Für den Zugang zu diesem Mikroskop siehe https://www.embl.org/about/info/imaging-centre oder kontaktieren Sie ic-contact@embl.de
Single-mode fasergekoppelte Multi-Laser-Engine	Toptica	iCHROME MLE-LFA-HP	Bietet eine Weitfeld-Epi-Beleuchtung von 100 mW bei 405, 488, 561, 640 nm
Spaltung dichroitischer	AHF Analysentechnik	F48-665SG	665 nm langer Pass
Quadratisches Deckglas 22 x 22 mm Nr.1	Menzel-Glä Ser; VWR	630-2882
STAR 635P, NHS-Ester	Abberior	ST635P-0002-1MG	Gelöst in DMSO zu 1 mM Lösung, aliquotiert auf Einmalvolumen, eingefroren und bei -80 μg gehalten; C
Stereomikroskop Stemi 305 Stativ K LAB	Zeiss	N/A
Tetramisolhydrochlorid	Sigma-Aldrich/Merck	T1512-2G	1%ige (w/v) Lösung wurde in Milli-Q Wasser hergestellt. Gefrorene Aliquots wurden bei -20 °C gelagert Aufgetaute Aliquoten wurden bei 4 °C gelagert; C und mehrere Monate lang verwendet.
TetraSpeck Mikrosphären	ThermoFischer Scientific	T7279	0,1 &Mikro; m, fluoreszierend blau/grün/orange/dunkelrot
Tris Kochsalzlösung Puffer (TBS 10x)		N/A	200 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5
TWEEN 20	Sigma-Aldrich/Merck	P9416-50ML	Bei Raumtemperatur in der Originalverpackung aufbewahrt.
WormStuff Wurmpicker	Kisker	789277
XY Mikroskoptisch	Smaract	N/A	Custom Design
Zeba Micro Spin Entsalzungssäule	ThermoFischer Scientific	89877	7K MWCO, 75 & Mikro; L