Tasarlanmış Kardiyak Dokuların Veri Toplamasını ve Model Verimini İyileştirmek için Bir Biyoreaktör Tasarlama

Summary

Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak biyomühendislik yapılan üç boyutlu kalp dokuları, doğal kardiyak nişin temel yönlerini özetlerken, sağlıklı ve hastalıklı insan miyokardını in vitro incelemek için umut verici modeller olarak ortaya çıkmıştır. Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden üretilen yüksek içerikli tasarlanmış kardiyak dokuların üretilmesi ve analiz edilmesi için bir protokolü açıklamaktadır.

Abstract

Kalp yetmezliği, dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmekte ve insan kalbinin daha iyi klinik öncesi modellerine acil bir ihtiyaç yaratmaktadır. Doku mühendisliği, temel bilim kardiyak araştırmaları için çok önemlidir; in vitro insan hücre kültürü, hayvan modellerinin türler arası farklılıklarını ortadan kaldırırken, daha doku benzeri bir 3D ortam (örneğin, hücre dışı matris ve heteroselüler eşleşme ile), in vivo koşulları, plastik Petri kapları üzerindeki geleneksel iki boyutlu kültürden daha büyük ölçüde simüle eder. Bununla birlikte, her model sistem, örneğin özel olarak tasarlanmış biyoreaktörler ve fonksiyonel değerlendirme cihazları gibi özel ekipman gerektirir. Ek olarak, bu protokoller genellikle karmaşıktır, emek yoğundur ve küçük, hassas dokuların başarısızlığından muzdariptir.

Bu makale, doku fonksiyonunun uzunlamasına ölçümü için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak sağlam bir insan mühendisliği kalp dokusu (hECT) model sistemi oluşturmak için bir süreci açıklamaktadır. Doğrusal şerit geometrisine sahip altı hECT paralel olarak kültürlenir ve her bir hECT, PDMS raflarına bağlı bir çift kuvvete duyarlı polidimetilsiloksan (PDMS) direğinden asılır. Her gönderi, kullanım kolaylığını, verimi, doku tutmayı ve veri kalitesini artıran yeni bir özellik olan siyah bir PDMS kararlı gönderi izleyici (SPoT) ile sınırlandırılmıştır. Şekil, sehimler sonrası sapmaların güvenilir optik takibine izin vererek, mutlak aktif ve pasif gerilimle gelişmiş seğirme kuvveti izlemeleri sağlar. Kapak geometrisi, direklerden kayan hECT'lerden kaynaklanan doku yetmezliğini ortadan kaldırır ve PDMS raf imalatından sonra ikinci bir adımı içerdiklerinden, SPoT'ler, biyoreaktör üretim sürecinde büyük değişiklikler yapılmadan mevcut PDMS post-based tasarımlarına eklenebilir.

Sistem, fizyolojik sıcaklıklarda hECT fonksiyonunun ölçülmesinin önemini göstermek için kullanılır ve veri toplama sırasında stabil doku fonksiyonunu gösterir. Özetle, in vitro uygulamalar için tasarlanmış kalp dokularının biyolojik uygunluğunu, verimliliğini ve titizliğini ilerletmek için temel fizyolojik koşulları yeniden üreten son teknoloji bir model sistemi açıklıyoruz.

Introduction

Tasarlanmış kardiyak doku modelleri, geleneksel iki boyutlu hücre kültürü ile elde edilmesi zor olan doğal kardiyak nişin çeşitli yönlerini özetlemek için çok çeşitli geometriler ve konfigürasyonlarda gelir. En yaygın konfigürasyonlardan biri^, dokunun kendi kendine birleşmesini indüklemek ve dokuya tanımlanmış bir ön yük ve ortaya çıkan seğirme kuvvetlerinin bir okumasını sağlamak için her iki ucunda esnek ankrajlar bulunan doğrusal doku şerididir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Üretilen kuvvet, doku kısalmasının optik olarak izlenmesi ve ölçülen sapmalardan gelen kuvveti ve^{ankrajların yay} sabitini hesaplamak için elastik ışın teorisi kullanılarak sağlam bir şekilde belirlenebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Bununla birlikte, kardiyak doku mühendisliği hala gelişen bir alandır ve bazı zorluklar devam etmektedir. Her model sistem ^10,29,30,31 için özel yapım biyoreaktörler ve fonksiyonel değerlendirme cihazları gibi özel ekipman gereklidir. Bu yapıların mikro çevresinin boyutu ve karmaşıklığı, emek yoğun protokoller, yüksek sayıda hücre ve doku kırılganlığı nedeniyle genellikle düşük verimle sınırlıdır. Bunu ele almak için, bazı gruplar, ilaç keşfi için yararlı olan yüksek verimli tahlilleri kolaylaştırmak için yalnızca yüzlerce veya binlerce hücre içeren mikro dokuların imalatına yöneldi. Bununla birlikte, bu azaltılmış ölçek, işlev^12'nin doğru değerlendirmesini zorlaştırır, doğal kardiyak nişin temel yönlerini (besin/oksijen difüzyon gradyanları ve karmaşık mimari³⁶ gibi) ortadan kaldırır ve sonraki moleküler ve yapısal analiz için mevcut malzeme miktarını sınırlar (genellikle dokuların havuzlanmasını gerektirir). Tablo 1, literatürdeki lineer doku şeridi modellerinin bazı konfigürasyonlarını özetlemektedir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Grup		Doku başına hücre sayısı	Plaka başına doku	Plaka formatı		Ankraj özelliği		İşlevsel veri toplama yöntemi		Paylaşılan medya banyosu mu?	İşlevsel ölçü- ment in situ mu?
Yoshida (EKT)38		4 milyon	6	modifiye edilmiş 6 kuyucuklu plaka*		kuvvet dönüştürücü		Doğrudan Kuvvet Ölçümü		Hayır	Hayır
Chan (hESC-CM-ECT'ler)26		310 bin	6	Özel 6 kuyulu çanak		PDMS gönderileri		Doğrudan Kuvvet Ölçümü		evet	Hayır
Feinberg (dyn-EHT)16		1.5 milyon	6	Özel 6 kuyulu çanak		PDMS kablosu		doku şekli		Hayır	evet
RDISIC (BioWire)39, 40		110 bin	8			polimer tel		Tel şekli		evet	evet
Kosta (tek hECT)1, 2		1-2 milyon	4**	10 cm Petri kabı**		PDMS gönderileri		Optik sapma (kenar/nesne izleme)		evet	evet
Kosta (çok hECT)3–9		500 K-1 milyon	6	6 cm Petri kabı		PDMS gönderileri		Optik sapma (kenar/nesne izleme)		evet	evet
Costa (SPoT ile çok hECT)		1 milyon	6	6 cm Petri kabı		Siyah kapaklı PDMS gönderileri		Optik sapma (nesne izleme)		evet	evet
Yolcu (EHT)17		245 bin	36	12 oyuklu plaka		Siyah kapaklı PDMS gönderileri		Optik sapma (nesne izleme)		evet	evet
Vunjak-Novakoviç13, 18		1 milyon	12	6 cm Petri kabı		Kapaklı PDMS gönderileri		Optik sapma (kenar algılama)		evet	evet
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 bin	6	Özel 6 kuyulu çanak		Kapaklı PDMS gönderileri		optik sapma (nesne izleme); Kalsiyum görüntüleme		Hayır	evet
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 milyon	12	12 oyuklu plaka		Kapaklı PDMS gönderileri		optik sapma (post sapmanın kenar tespiti); Kalsiyum görüntüleme		Hayır	evet
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 bin	96	96 oyuklu plaka		Kancalı PDMS direkleri		Optik sapma (kenar algılama)		Hayır	evet
Murry23, 24		900 bin	24	24 oyuklu plaka		Kapaklı PDMS direkleri, entegre mıknatıs		Manyetik sensör		Hayır	evet
Reich (μTUG)11, 12, 25		Tanımsız	156	156 kuyucuklu çanak		Kapaklı PDMS direkleri, entegre mıknatıs		Optik İzleme (Floresan Boncuk)		evet	evet

Tablo 1: Literatürdeki bazı lineer mühendislik kalp dokusu modellerinin özellikleri. Doğrusal mühendislik ürünü kalp dokusu modelleri, boyut, verim, ankraj özelliği tasarımları ve paylaşılan ortam banyolarının kolaylaştırılmasının yanı sıra fonksiyonel karakterizasyon için ayrı bir kas banyosu sistemi gereksinimleri bakımından farklılık gösterir. * Araştırmacılar, standart bir 6 oyuklu plakanın boyutlarına dayanan, ticari olarak temin edilebilen bir mühendislik doku sistemi kullandılar. ** Tek dokulu biyoreaktörlerin herhangi bir plastik kültür kabına istenilen sayı ve yerde ankrajlandığı modüler bir sistemdir.

Bu makale, yerleşik doğrusal insan mühendisliği kalp dokusu (hECT) modelimizi üretmek için en son protokolü açıklamaktadır1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 ve hECT kasılma fonksiyonunu değerlendirme yöntemleri. Her çok dokulu biyoreaktör, paylaşılan bir ortam banyosunda altı hekte kadar barındırır ve sert bir polisülfon çerçeve üzerine monte edilmiş silikon elastomer polidimetilsiloksan'dan (PDMS) yapılmış iki "raf" parçasından oluşur. Her PDMS rafı, 0,5 mm çapında ve 3,25 mm uzunluğunda altı esnek entegre kuvvet algılama direği içerir ve birlikte, iki raf, her biri bir heECT tutan altı çift direk sağlar. Biyoreaktörün ters çevrilmesi, kültür ortamından su yoğunlaşması veya hava-sıvı arayüzünün menisküsünden kaynaklanan bozulmalar nedeniyle hECT'lerin aşağıdan görselleştirilmesine yönelik herhangi bir engelin üstesinden gelmeye yardımcı olur. Bir hECT'nin her kasılması, entegre uç direklerin sapmasına neden olur ve sapma sinyalinin optik ölçümü, hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27'nin kasılma fonksiyonunu temsil eden bir kuvvete karşı zaman izlemesine işlenir . Tipik olarak bu boyuttaki dokular için kullanılan tek dokulu biyoreaktörlerle karşılaştırıldığında, çok dokulu tasarım deneysel verimi artırır ve potansiyel olarak farklı hücresel bileşime sahip bitişik dokular arasında parakrin sinyalizasyonunun incelenmesini sağlar. Bu sistem, hastalık modellemesi ^4,8, parakrin sinyalleme ^6,7, heteroselüler kültür ^5,9 ve terapötik tarama ^7,9'daki uygulamaları açıklayan yayınlanmış çalışmalarda doğrulanmıştır.

Bu sistemde, hECT'ler yaklaşık 6 mm uzunluğunda ve 0,5 mm çapında olacak şekilde tasarlanmıştır ve düşük gürültülü kuvvet ölçümlerinin sağlam optik takibini kolaylaştırır. Ayrıca, difüzyon gradyanları ve hücresel organizasyon gibi doku karmaşıklığının yönleri, doku başına 1 milyon hücrelik yönetilebilir bir gereksinimle dengelenir. Standart CCD kamera teknolojisiyle, 1 μN kadar zayıf kuvvetler (sapma sonrası 5 μm'den daha azını temsil eder) net bir sinyal üreterek, bazı hECT hastalık modellerinde gözlemlendiği gibi son derece zayıf kasılma fonksiyonunun bile doğru bir şekilde ölçülebilmesini sağlar. Bu aynı zamanda seğirme kuvveti eğrisinin ayrıntılı analizini kolaylaştırır, böylece gelişmiş kuvvet, kasılma (+dF/dt) ve gevşeme (−dF/dt) oranları ve vuruş hızı değişkenliği dahil olmak üzere 16'ya kadar kasılma metriğinin⁴¹ yüksek içerikli analizini mümkün kılar.

Bu protokol, biyoreaktör bileşenlerinin üretilmesi için talimatlarla başlar. HEKT verimini en üst düzeye çıkarmak, doku fonksiyonundaki teknik değişkenliği azaltmak ve doku değerlendirmesinin kalitesini ve derinliğini optimize etmek için adımlara özel önem verilir. Kardiyak doku mühendisliği çalışmalarının çoğu, bu alanda iyi bilinen bir zorluk olmasına ve çalışmaların verimini ve verimliliğini azaltmasına rağmen, üretim ve uzun süreli testler sırasında doku kaybı oranlarını bildirmemektedir²⁷. Burada açıklanan doku mühendisliği yöntemleri, biyoreaktörlerin çoğunda (PDMS raflarının nasıl üretildiğine bakılmaksızın) tüm hECT'lerin tutulmasını sağlamak için yıllar içinde rafine edilmiştir. Bununla birlikte, %5-20'lik bir doku kaybı bile, özellikle mevcut kardiyomiyosit sayısı ile sınırlı daha küçük deneylerde (örneğin, bazı hastalıklı hücre dizileri⁴ ile farklılaşma zorlukları nedeniyle veya ticari olarak satın alınan kardiyomiyositlerin yüksek maliyeti nedeniyle) veya tedavi durumu (örneğin, çeşitli tedavi bileşiklerinin sınırlı mevcudiyeti veya yüksek maliyeti) ile istatistiksel gücü önemli ölçüde etkileyebilir.

Bu protokol, hECT'leri²⁷ tutan kuvvet algılama direklerinin uçlarında kapaklar olarak işlev gören PDMS raflarının yeni bir özelliği olan kararlı direk izleyicilerin (SPoT'ler) imalatını açıklar. Kapak geometrisinin, direklerin düşmesinden veya çekilmesinden kaynaklanan hECT kaybını nasıl önemli ölçüde azalttığı, böylece kapaksız direklerde kültürlenmesi zor olan daha çeşitli sertlik ve gerilimlere sahip hEKT'lerin kültürlenmesi için yeni fırsatlar açtığı gösterilmiştir. Ek olarak, SPoT'ler, tutarlı ve iyi tanımlanmış bir şekil²⁷ aracılığıyla hECT kasılmasının optik takibini iyileştirmek için yüksek kontrastlı bir nesne sağlar. Bunu, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) kültürlenmesinin ve daha önce yayınlanmış^{protokoller 3,42,43'e} dayalı kardiyomiyosit farklılaşmasının bir açıklaması ve hECT üretimi, kültürü ve fonksiyonel ölçümlerinin bir açıklaması takip eder.

Bu makale aynı zamanda fizyolojik sıcaklıkta doku fonksiyonunu ölçme ihtiyacını da ele almaktadır. İnsan miyokardının (fetal ve yetişkin sağlıklı ve hastalıklı doku) yanı sıra çok çeşitli hayvan türlerinden (sıçanlar, kediler, fareler, gelincikler ve tavşanlar dahil) alınan kalp ^dokusu44,45, fizyolojik sıcaklığa kıyasla 28 °C-32 °C sıcaklıklarda frekansla eşleşen seğirme kuvvetinde belirgin bir artış gösterir - hipotermik inotropi olarak bilinen bir fenomen ^{45, 46}. Bununla birlikte, sıcaklığın tasarlanmış miyokard dokusu fonksiyonu üzerindeki etkileri yeterince araştırılmamıştır. Literatürdeki birçok yeni tasarlanmış kalp dokusu modeli, fizyolojik koşullara^{yaklaşık 37} °C'de fonksiyonel olarak değerlendirilecek şekilde tasarlanmıştır 13,14,37. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, tasarlanmış kalp dokuları tarafından üretilen kuvvet üzerindeki sıcaklığa bağlı etkiler sistematik olarak araştırılmamıştır. Bu protokol, test sırasında ısı kaybını en aza indirmenin yanı sıra, steriliteden ödün vermeden hECT'leri fizyolojik sıcaklıkta tutabilen fonksiyonel ölçümler için kuruluma yalıtılmış bir ısıtma elemanının dahil edilmesine izin veren bir pacing elektrot tasarımını açıklar²⁷. Daha sonra, geliştirilen kuvvet, spontan atım frekansı, +dF/dt ve −dF/dt dahil olmak üzere sıcaklığın hECT fonksiyonu üzerindeki gözlemlenen etkilerinden bazılarını rapor ediyoruz. Toplamda, bu makale, insan tarafından tasarlanmış kalp dokularını üretmek ve kasılma işlevlerini değerlendirmek için bu çok dokulu kuvvet algılayıcı biyoreaktör sistemini üretmek için gereken ayrıntıları sağlar ve oda sıcaklığında ve 37 ° C'de ölçümler için bir karşılaştırma sağlayan bir dizi veri sunulur²⁷.

Protocol

Bu protokol, tanımlanmamış bir iPSC hattı olan SkiPS 31.3'ü (orijinal olarak 45 yaşındaki sağlıklı bir erkekten alınan dermal fibroblastlar kullanılarak yeniden programlanmıştır)⁴⁷ kullandı ve bu nedenle, kurumun insan araştırmaları etik komitesi yönergelerine uygun olarak belirli Kurumsal İnceleme Kurulu onayından muaftı. Tüm hücre ve hECT manipülasyonunu aseptik koşullarda HEPA filtreli sınıf II biyolojik güvenlik kabininde veya laminer akışlı çalışma tezgahında gerçekleştirin. Tüm steril olmayan çözeltileri 0,22 μm'lik bir filtreden süzülerek sterilize edin ve tüm hücreleri ve hEKT'leri bir inkübatörde 37 °C, %95 bağıl nem ve %5_CO2'de tutun.

1. Biyoreaktör imalatı

1. Biyoreaktör bileşenleri ve alüminyum ana döküm imalatı
   NOT: Bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyaları Ek Dosya 1'de verilmiştir. Protokol bu adımlar arasında herhangi bir yerde duraklatılabilir. Bu bölümde açıklanan ana kalıpları üretmek için profesyonel bir makinistin görevlendirilmesi tavsiye edilir, çünkü doğru direk geometrisi ve polisülfon çerçevelerin politetrafloroetilen (PTFE) taban plakalarına uygun şekilde preslenmesi için yüksek toleranslar (≤5 μm) ve pürüzsüz bir yüzey gereklidir (tam bir sürtünme oturması hedeflenir, ancak çok sıkı değildir).
   1. Bir bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) frezesi kullanarak, taban plakasını Şekil 1A'daki şemalara göre PTFE'den işleyin. HECT'ler, eşit aralıklı altı kuyucukta (beyaz oklar) oluşturulacaktır.
   2. Bir CNC freze kullanarak, Şekil 1B'deki şemalara göre alüminyumdan dökülen polidimetilsiloksan (PDMS) raf negatif ana dökümünü üç çerçeve desteği (yeşil yıldız) ile işleyin. PDMS direklerini oluşturmak için 0.5 mm çapında altı eşit aralıklı delik (macenta ok uçları) açın.
   3. Bir CNC freze kullanarak, biyoreaktör çerçevesini Şekil 1C'deki şemalara göre polisülfondan işleyin. Çerçeve destekleri (yeşil yıldızlar), raf dökümünde görülen çerçeve desteklerine karşılık gelir (Şekil 1B, yeşil yıldız işaretleri).
   4. Bir CNC freze kullanarak, alüminyum döküm tutucuyu Şekil 1D'deki şemalara göre alüminyumdan işleyin. Her yuva, PDMS'nin PDMS raf kalıplarındaki deliklerden akması için ölü bir alan sağlamak üzere 0,25 mm yüksekliğinde üçgen bir raf (turuncu üçgen) içerir (Şekil 1B, macenta ok uçları).
2. PDMS rafının alüminyum negatif masterlardan dökümü
   1. Termoplastik kaynaşmış biriktirme modelleme 3D yazıcı kullanarak, iki PDMS raf döküm aparatı braketi yazdırın (Ek Dosya 1). Şu yazdırma ayarlarını kullanın: 0,1 mm katman yüksekliği, 1 mm duvar/alt/üst kalınlığı, üçgenlerle %90 dolgu yoğunluğu, 230 °C baskı sıcaklığı, 70 °C yapı plakası sıcaklığı ve yapışma için kenarlık.
   2. Direk delikleri üçgen rafların karşısındaki ölü boşlukla aynı hizaya gelecek şekilde döküm tutucuya (Şekil 2AI) dört alüminyum negatif ana döküm yerleştirin (bkz. Şekil 1D). Sıvı PDMS'nin sızmasını önlemek için cihazı 0.5 mm kalınlığında silikon kaplamadan oluşan dikdörtgen bir parçaya (Şekil 2B, beyaz oklar) conta olarak sarın ve bir vida kelepçesi kullanarak iki paralel 3D baskılı braket arasına sıkıştırın.
   3. Sığ bir kapta 5 mL PDMS elastomer tabanına (üreticinin talimatlarına göre 1:10 oranına) 0,5 mL PDMS kürleme maddesi ekleyin ve 5 dakika kuvvetlice karıştırın. PDMS karışımını bir vakum odasında gazdan arındırın ve oda sıcaklığında 20-60 dakika veya kabarcıklar kaybolana kadar güçlü bir vakum (0.1-1 kPa) uygulayın.
   4. PDMS karışımını, her bir yuvanın tam olarak kaplanmasını sağlamak için aşırı doldurarak döküm aparatına dökün (Şekil 2AII). İstenirse, her bir PDMS rafının benzersiz bir şekilde tanımlanması için PDMS raflarının gövdesine (Şekil 2AII), direklerin (Şekil 2B) karşısına küçük, renkli cam boncuklar ekleyin. Döküm aparatını vakum odasına geri koyun (yatay olarak düz olduğundan emin olun) ve en az 12 saat boyunca güçlü bir vakum uygulayın. Hassas direklerin tam kürlenmesini ve maksimum mukavemetini sağlamak için PDMS'nin oda sıcaklığında yaklaşık 48 saat tozdan uzakta kürlenmesine izin verin. 3D yazdırılmış bileşenleri büktüğü için fırın kullanmaktan kaçının.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
3. Alüminyum negatif ana dökümlerden PDMS rafının çıkarılması
   1. cl'yi çıkarınamp, braketler ve silikon kaplama döküm aparatından. Paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı kullanarak, döküm aparatının ve çerçeve desteklerinin üstündeki PDMS filmini kesin ve PDMS raflarını döküm tutucunun kenarlarından ayırmak için parmaklarınızı nazikçe kullanın. Döküm ile döküm tutucu arasındaki ölü boşluğa körelmiş paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı yerleştirin ve bunları ayırın (Şekil 2CI, II), ölü alanı dolduran PDMS'nin döküm tutucuda kalmasını sağlayın (direklere takılı olduğu için). Keskin bir paslanmaz çelik bıçak kullanarak, kalan PDMS filmlerini kesin ve ölü boşluk PDMS'sini direklerin uçlarından kesin (Şekil 2C III-V).
   2. KRİTİK ADIM: PDMS rafını kalıptan kurtarın (Şekil 2D). Direklerin karşısındaki taraftan başlayarak, PDMS rafını alçıdan yavaşça ayırmak için parmaklarınızı kullanın ve direkler ana kalıplardan kurtulana kadar alternatif taraflarda çalışın.
   3. Tüm PDMS rafları ve tüm direkler serbest kalana kadar önceki adımı tekrarlayın. Raflarda kalan fazla PDMS'yi kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın. Sonuç, tanımlama için altı sağlam direğe (turuncu ok uçları) ve renkli boncuklara (mavi ok) sahip bir PDMS rafıdır (Şekil 2E).
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
4. Kararlı post tracker (SPoT) üretimi
   1. Termoplastik kaynaşmış biriktirme modelleme 3D yazıcı kullanarak, SPoT döküm aparatının bileşenlerini yazdırın (Ek Dosya 2 ve Şekil 3AI, II). Şu yazdırma ayarlarını kullanın: 0,1 mm katman yüksekliği, 1 mm duvar/alt/üst kalınlığı, üçgenlerle %80 dolgu yoğunluğu, 230 °C baskı sıcaklığı, 70 °C yapı plakası sıcaklığı ve yapışma için kenarlık.
   2. 3D baskılı parçalar arasında ve ayrıca PDMS rafları ile üç uçlu aparat arasında güvenli bir pres oturduğundan emin olun ve PDMS raflarının, bükülmeden kuyuların dibine ulaşan direklerle sıkıca oturduğunu onaylayın. Gerekirse plastiği kırpın/törpüleyin.
   3. Küçük bir tartım teknesine (veya benzer küçük, sığ bir kap) 0,5 mL siyah PDMS A kısmı ila 0,5 mL B kısmı (üreticinin talimatlarına göre 1:1 oranı) ekleyin ve homojen olana kadar iyice karıştırın. Karışık siyah PDMS'yi bir vakum odasında 20 dakika boyunca güçlü bir vakum altında gazdan arındırın. Delikleri doldurmak için gazı alınmış siyah PDMS'yi 3D baskılı tabana dökün ve kabarcık kalmadığından emin olmak için hafifçe vurun. Tabandan mümkün olduğunca fazla PDMS'yi kazıyın.
   4. Üç uçlu parçayı tabana oturtun ve PDMS raflarını üç uçlu jig üzerindeki oluklara yerleştirin (Şekil 3AII, turkuaz dikdörtgen), direklerin uçlarının dairesel kuyucuklardaki siyah PDMS'ye dalmasını sağlayın (Şekil 3B, C). Siyah PDMS'yi oda sıcaklığında kürleyin ve 48 saat boyunca tozdan koruyun.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   5. Direklerdeki gerilimi en aza indirerek üç uçlu parçayı dışarı kaydırın. Her SPoT'yi çevreleyen ince siyah PDMS filmini kazımak için küçük forseps kullanın; daha sonra, 3D baskılı tabandan kurtarmak için SPoT kuyucuğuna ince uçlu bükülmüş forseps yerleştirin (Şekil 3D).
   6. SPoT'leri inceleyin (Şekil 3E) ve ince Vannas makası kullanarak adım 1.4.5'te çıkarılmayan döküm işleminden kalan siyah PDMS filmini kesin. PDMS raflarını polisülfon çerçeveye takarak ve ardından bunu siyah taban plakasına kaydırarak bitmiş direklerin doğru uzunlukta olduğundan emin olun (Şekil 4A).
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   7. PDMS raflarını eşleştirin ve çerçeve tırnaklarını kullanarak çerçeveye ekleyin (Şekil 4A). En az 30 dakikalık bir döngü için PTFE taban plakalı bir torbada otoklavlayın (bükülmeyi azaltmak için <122 °C).

Şekil 1: hECT biyoreaktör bileşenleri. (A) hECT (beyaz oklar) oluşturmak için eşit aralıklı altı kuyuya sahip PTFE taban plakasının üstten görünümü (solda) ve yandan görünümü (sağda). (B) Altı eşit aralıklı direk (macenta ok uçları) ve biyoreaktör çerçevesine takmak için üç boşluk (yeşil yıldızlar) ile PDMS rafları için alüminyum negatif ana dökümlerin yandan görünümü (solda) ve üstten görünümü (sağda). (C) PDMS raf dökümündeki (panel B) çerçeve desteklerine karşılık gelen üç eşit aralıklı çerçeve desteğine (yeşil yıldız) sahip PDMS rafları için polisülfon çerçevelerin yandan görünümü (solda) ve alttan görünümü (sağda). (D) Her biri 0,25 mm yüksekliğinde üçgen rafa (en soldaki raf turuncu renkle vurgulanmıştır) sahip PDMS raf kalıpları için dört yuvaya sahip alüminyum döküm tutucunun üstten görünümü (üstte) ve yandan görünümü (altta). Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: hECT = insan mühendisliği kalp dokusu; Ø = çap; PTFE = politetrafloroetilen; PDMS = polidimetilsiloksan; R = yarıçap. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PDMS raflarının imalatı. (A) CAD görüntüleri, döküm aparatının eğik bir görünümünü gösterir. (I) Üçgen rafın karşısındaki ölü alanın üzerine yerleştirilmiş PDMS direklerini (macenta ok uçları) oluşturan delikler ile döküm tutucunun dört yuvasının her birine negatif bir PDMS raf ana dökümü yerleştirilir (Şekil 1D, turuncu üçgen). (II) PDMS, negatif ana dökümün her boşluğuna dökülür. (III) Renkli boncuklar, kürlenmemiş PDMS'ye renk kodlu bir tanımlama sistemi olarak eklenir. (B) Bir vida kelepçesi ile yerinde tutulan iki adet 3D baskılı braket ile her iki tarafa kenetlenen ve kelepçeli kenarları kapatmak için 0,5 mm kalınlığında silikon kaplama (beyaz oklar) ile sarılan monte edilmiş PDMS raf döküm aparatını gösteren fotoğraf. Renkli boncuklar, direkleri oluşturan 0,5 mm çapındaki delikleri (eflatun ok uçları) kapatmayacak şekilde yerleştirilir. (C) PDMS sertleştikten sonra, alçı tutucudan çıkarılır. (I) Dökümü döküm tutucudan (II) kaldırmak için döküm ile döküm tutucu arasına körelmiş paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı veya benzeri ince metal alet sokulur. (III) Direklerin deliklerinden akan PDMS'nin oluşturduğu film (turkuaz braketler) direklerin uçlarına tutturulur ve keskin bir bıçak (IV,V) kullanılarak kesilmelidir. (D) PDMS rafı dökümden ayrılmıştır. (E) PDMS rafının eğik (üst), yan (orta) ve alt (alt) görünümlerini tanımlama için gövdeye gömülü bir cam boncuk ile gösteren fotoğraflar (mavi ok). Direklerin uçları (turuncu ok uçları) siyah mürekkeple işaretlenmiştir. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: CAD = bilgisayar destekli tasarım; PDMS = polidimetilsiloksan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: SPoT üretimi. (A) SPoT döküm aparatının (I) tabanının ve (II) üç uçlu parçasının temel boyutlarını gösteren CAD işlemeleri. Dairesel SPoT formlarının boyutları (AI, siyah oklar) 0,2 mm derinlik x 1,2 mm çap olarak ayarlanmıştır ve her biri ayrı bir SPoT için siyah PDMS'yi tutar. Üstten görünümde görülen 11,1 mm x 27 mm rafa (AII, üst, turkuaz dikdörtgen), kürleme sırasında PDMS rafını yerinde tutmak için 0,4 mm (aşağıdaki yan görünümde görüldüğü gibi) bastırılır. (B) SPoT döküm aparatının montajını gösteren CAD render. (C) Monte edilmiş SPoT döküm aparatının bir fotoğrafı. (D) PDMS sertleştikten sonra, üç uçlu jig PDMS raflarının altından kaydırılır ve SPoT'ler ince forseps kullanılarak kuyularından serbest bırakılır. (E) PDMS rafının (üstte) ve (altta) SPoT'lu fotoğrafları. Ekler, gönderilerin büyütülmüş görünümlerini gösterir. Ölçek çubukları = 1 cm (E), 2,5 cm ( E'nin yakınlaştırılmış görüntüleri). Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: CAD = bilgisayar destekli tasarım; Ø = çap; PDMS = polidimetilsiloksan; R = yarıçap; SPoT = kararlı gönderi izleyici. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Hücre kültürü

1. iPSC'lerin kültürlenmesi
   NOT: Farklı hücre hatları, geçiş seyreltmesinde ve frekansında ve/veya ortam katkı maddelerinin titrasyonunda ayarlamalar gerektirebilir.
   1. Hücre kültürü ile muamele edilmiş 6 oyuklu bir plakayı nitelikli bazal membran matrisi ile kaplayın (üreticinin talimatlarına göre 1:1 Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium:Ham's F12 Besin Çözeltisi [DMEM/F12] ile seyreltilmiş) ve plakayı 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre 500 mL iPSC kültür ortamı hazırlayın ve 5 mL penisilin-streptomisin (10.000 IU / mL ila 10.000 μg / mL) stok çözeltisi ekleyin.
   2. iPSC'leri geçmek için, ortamı kuyulardan aspire edin ve her kuyucuğu bir kez 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Oyuk başına 1 mL iPSC ayrışma çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca bir laminer akış başlığında inkübe edin.
   3. iPSC ayrışma solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 37 ° C'de (herhangi bir ortam olmadan) 5 dakika inkübe edin. iPSC ayrışma çözeltisini nötralize etmek için iPSC ortamına 1 mL 2 μM tiazovivin ekleyin.
   4. Kolonileri kabaca 10 hücreden oluşan kümelere ayırmak için 2 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ve her bir kuyuyu iPSC ortamında 1 mL ek 2 μM tiazovvivin ile yıkayın. Bazal membran matrisi ile yeni kaplanmış plakanın her bir oyuğuna 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin (adım 2.1.1).
   5. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve taze iPSC ortamı (tiazovivin olmadan) ekleyin. iPSC'leri her 48 saatte bir 2 mL iPSC ortamı ile veya her 72 saatte bir 4 mL ortam ile besleyin. Hücreleri her 3 günde bir veya% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçmek için 1: 6 seyreltmede yeniden plakalayın.
      NOT: Farklı hücre hatları, seyreltme ve geçiş frekansının ayarlanmasını gerektirebilir.
2. Kardiyomiyosit farklılaşması
   1. iPSC tek katmanları %80-%90 birleştiğinde farklılaşmaya başlayın.
   2. 500 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 besiyerine (RPMI) insülin içermeyen 10 mL B27 takviyesi ve 5 mL penisilin-streptomisin stok çözeltisi ekleyerek farklılaşma ortamını hazırlayın. 500 mL RPMI 1640'a 10 mL B27 takviyesi ve 5 mL penisilin-streptomisin stok çözeltisi ekleyerek kardiyomiyosit bakım ortamını hazırlayın.
      NOT: Farklılaşma ortamı ve kardiyomiyosit bakım ortamı 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
   3. 0. Gün: Hücreleri 1 mL DMEM / F12 ile yıkayın ve farklılaşma ortamına 2 mL 10 μM CHIR99021 ve seyreltilmiş bazal membran matrisi ekleyin.
   4. 1. Gün: 24 saat sonra veya hücre birleşmesi% 70'in altına düştüğünde, hücreleri 1 mL DMEM / F12 ile yıkayın, 2 mL farklılaşma ortamı ekleyin ve 48 saat inkübe edin.
   5. 3-4. Gün: Hücreleri 1 mL DMEM / F12 ile yıkayın ve farklılaşma ortamına 2 mL 5 μM IWR-1 ekleyin. 4. günde tekrarlayın.
   6. 5-6. Günler: Hücreleri 1 mL DMEM / F12 ile yıkayın ve 2 mL farklılaşma ortamı ekleyin. 6. günde tekrarlayın.
   7. 7-10. Günler: Hücreleri 1 mL DMEM / F12 ile yıkayın ve 2 mL kardiyomiyosit bakım ortamı ekleyin. Her 24 saatte bir tekrarlayın.
   8. 11+ Gün: Ortamı her 48-72 saatte bir 4 mL taze kardiyomiyosit bakım ortamı ile değiştirin. Güçlü bir şekilde çırpılan tek katmanlara zarar vermemek için yavaşça aspire edin ve pipetleyin.

3. hECT kültürü

1. Kardiyomiyositlerin toplanması
   1. Farklılaşma indüksiyonundan 8-60 gün sonra hECT imalatında kullanılmak üzere kardiyomiyosit tek katmanlarını hasat edin. Kuyucuk başına 2-5 milyon hücre bekleyin.
      NOT: Hücreler 10. güne kadar atmaya başlamadıysa, farklılaşmanın başarılı olması olası değildir. Kuvvetli bir şekilde atan tek tabakalar genellikle 11-15 gün sonra farklılaşmaya ayrılır ve yoğun dokulara sıkışır. Bu tür hücrelerin şu anda kullanılması veya yeniden plakalanması önerilir.
   2. Her bir kardiyomiyosit kuyusunu 2x 2 mL PBS ile durulayın. 1 mL oda sıcaklığında% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreler yuvarlak görünene ve plakaya hafifçe vurulduğunda ayrılana kadar 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
   3. Ayrışmayı nötralize etmek için her bir oyuğa kardiyomiyosit bakım ortamında 1 mL% 10 FBS ekleyin. 5 mL'lik bir serolojik pipet ucu kullanarak tek katmanları nazikçe pipetleyin ve peleti 10-20 hücrelik kümelere ayırmak için 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
   4. 10 μL hücreyi 10 μL tripan mavisine aktarmadan önce konik tüpü ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın. Otomatik bir hücre sayacı veya cam hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Tüm hücreler kullanılmayacaksa veya bazı hücreler akış sitometrisi için ayrılmışsa, hücre süspansiyonunu uygun şekilde ayırın.
      NOT: Bu noktada ek hücreler (fibroblastlar gibi) eklenebilir.
   5. Hücreleri 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan hemen mümkün olduğunca fazla süpernatanı aspire edin ve buz üzerinde tutun. Hücrelerin pelette geçirdiği süreyi en aza indirmek için hızlı çalışın.
2. hECT üretimi
   1. Tablo 2'deki hacimleri kullanın ve peletteki hücre sayısına göre ayarlayın, böylece her hECT 1 milyon hücre içerir. Her adımdan sonra, kabarcıkları önlemek için yavaşça pipetleyerek karıştırın.
      NOT: Bazı bileşenler ışığa duyarlı olduğundan, 3.2.2-3.2.3 adımlarını doğrudan ışıktan korumalı olarak gerçekleştirin.
   2. 13.442 μL damıtılmış su, 4.4 μL 10x PBS ve 0.638 μL 1M NaOH ekleyerek 1.7 mL'lik bir mikrotüp içinde 2.9 g/mL tip-1 kollajen çözeltisi hazırlayın. 25.52 μL 5 mg/mL kollajen stok çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın.
   3. Hücre dışı matris karışımı hazırlayın (Tablo 2'den ECM karışımı): 5.5 μL 0.2 N pH 9 HEPES çözeltisi ve ardından 5.5 μL 10x MEM ekleyin. Düzgün bir açık sarı ila açık pembe renk gözlenene kadar iyice karıştırın. 35,2 μL ECM karışım çözeltisini hücre peletine aktarın ve 4,4 μL bazal membran matrisi ekleyin.
   4. Otoklavlanmış biyoreaktör parçaları torbasını açın (adım 1.4.7, Şekil 4A). %70 etanol ile sterilize edilmiş eldivenler giyerken, siyah taban plakasını otoklav torbasından çıkarın ve kuyucukları yukarı bakacak şekilde 60 mm'lik bir tabağa yerleştirin. Kabarcıkların oluşmasını önlemek için 44 μL hücre karışımını her bir oyuğa yavaşça pipetleyin. Gerekirse, pipetleme sırasında ortaya çıkan veya PTFE'nin hidrofobikliği nedeniyle oluşan kabarcıkları çıkarmak için pipeti kullanın. Sıvının yüzeyi kuyu dudağı ile aynı hizada olacak şekilde hECT hacmini eski haline getirin (Şekil 4BI).
   5. Yeni bir çift sterilize eldiven giyin ve PDMS raflı polisülfon çerçeveyi otoklav torbasından çıkarın. Çerçeveyi, uçları taban plakasının uçlarındaki oluklara oturacak şekilde taban plakasına indirin (Şekil 4BII, III). 60 mm'lik bir tabağa yerleştirmeden önce direklerin düz olduğundan ve çerçevenin eğilmediğinden emin olmak için biyoreaktörü inceleyin.
   6. HEKT'ler katılaştıkça çanaktaki nemi artırmak için 60 mm'lik çanağa kardiyomiyosit bakım ortamında 1 mL %10 FBS ekleyin (hECT'leri bozmamaya dikkat edin). 60 mm'lik kabı kapaksız olarak yüksek profilli (20 mm boyunda) 100 mm'lik bir tabağa yerleştirin, 100 mm'lik bir tabak kapağıyla örtün ve kollajenin süspansiyondaki hücrelerle bir jel oluşturmasını sağlamak için biyoreaktörü 37 °C, %5_CO2 inkübatörüne geri koyun.
   7. 2 saat sonra, çanağı inkübatörden çıkarın. Kardiyomiyosit bakım ortamına 13 mL %10 FBS ekleyin, ortamın PTFE taban plakası ile PDMS rafları arasında akmasını teşvik etmek için çanağı eğin.
   8. PTFE taban plakasının hidrofobik yüzeyleri ile PDMS rafları arasında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için biyoreaktörü yandan inceleyin ve kabı inkübatöre geri koyun. Sıkışmış hava varsa, kabarcığın kırılmasına izin vermek için biyoreaktörü ortamdan dışarı eğin ve yavaşça tekrar indirin veya direkleri rahatsız etmemeye dikkat ederek havayı sifonlamak için jel yükleme ucu olan bir mikropipet kullanın.
3. Taban plakasının çıkarılması
   1. Çerçevedeki boşluktan hECT sıkıştırmasını kontrol edin. 24-96 saat boyunca, hECT'ler sıkışır ve daha opak hale gelir (Şekil 4CI-III). HECT'ler ile taban plakasının duvarı arasında gözle görülür bir boşluk olduğunda (Şekil 4CII), FBS olmadan ortamı kardiyomiyosit bakım ortamına değiştirmek için iki yarım hacimli ortam değişikliği gerçekleştirin. hECT'ler orijinal çapa kıyasla en az %30 sıkıştırıldığında taban plakasını çıkarın (Şekil 4CIII). Biyoreaktörü içeren 60 mm'lik kabı, sıvı yemeğin ağzıyla aynı hizaya gelene kadar kardiyomiyosit bakım ortamı ile doldurun ve 60 mm'lik yeni bir kaba 14 mL ekleyin.
   2. KRİTİK ADIM: Steril eldiven giyerken, biyoreaktörü taban plakası üstte olacak şekilde çanağında ters çevirin (Şekil 4BIV). Adım 3.2.8'de olduğu gibi sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Taban plakasını düz tutarak yavaşça kaldırın (Şekil 4BV).
   3. Taban plakasının çıkarılması sırasında bir hECT düşer ancak taban plakasında kalırsa, hECT'yi taban plakasından 60 mm'lik çanağa aktarmak için steril kavisli ince forseps kullanın. ECT'nin sonunu görevine yönlendirmek için forseps kullanın. Direği sabit tutmak için ikinci bir forseps kullanın ve hEKT'deki delikten geçirin. Gerekirse ikinci gönderi için tekrarlayın.
   4. Tüm hECT'ler direklere takılıyken, hECT'lerle çerçeveyi yeni 60 mm'lik çanağa aktarın ve çerçeveyi direkler aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 4BVI). HETT'lerin SPoT'lerin hemen yakınındaki direklerinde kaldığından emin olmak için biyoreaktörü inceleyin.
   5. Bir hECT yüzey gerilimi ile direklerinin tabanına itilmişse, çerçeveyi bir çift steril kavisli forseps ile sabitleyin. Diğer forseps çiftini kapalı tutarak çerçevedeki yuvadan geçirin. Forsepsin ucu PDMS raflarını geçecek şekilde indirildikten sonra, direğe ulaşacak şekilde çevirin ve kapalı uçları kullanarak hECT'yi SPoT'ye dayanana kadar direğin sonuna doğru hafifçe itin (Şekil 4BVI, ek).
4. hECT bakımı
   1. Her 24-48 saatte bir kardiyomiyosit bakım ortamı ile yarım hacimli ortam değişiklikleri gerçekleştirin (2 haftalık kültürden sonra, sıklık haftada iki kez azaltılabilir.)
   2. HETT'ler, tipik olarak 3. günde spontan atım kümeleri ve 5. günde görünür post sapma ile koordineli dayak gösterdiğinde, fonksiyonel ölçümlere başlayın ve istediğiniz sıklıkta tekrarlayın.
      NOT: 7. güne kadar koordineli atmaya başlamamış olan hEKT'lerin bunu yapması pek olası değildir.

Parça			Hacim (μL)
damıtılmışH2O			13.442			2.9 mg/mL kollajen çözeltisi	"ECM karışımı"	son hECT hücre karışımı
NaOH 1N			0.638
PBS 10 kat			4.4
5 mg/mL kolajen stoğu			25.52
0.2 N pH 9 HEPES			5.5
10 adet MEM			5.5
Hücre peletine aktarılacak ECM karışımının hacmi			35.2
Matrigel Hacmi			4.4

Tablo 2: hECT reaktifleri. Bileşenler listelenen sırayla eklenmeli ve buz üzerinde tutulmalıdır.

Şekil 4: Biyoreaktör montajı ve hECT üretimi. (A) (I) Polisülfon çerçeveye (sağ, ten rengi) takılan iki PDMS rafı (sol, açık mavi). (II) PTFE taban plakası (siyah, sol) daha sonra çerçeveye (sağda) oturur, böylece her bir direk çifti taban plakasının bir kuyusuna sığar. (B) (I) Kollajen bazlı hücre dışı matriste kırk dört mikrolitre kardiyomiyosit süspansiyonu, altı taban plakası kuyucuğunun her birine eklenir. (II,III) PDMS raflı çerçeve, taban plakasına bastırılarak takılır. 1-4 gün sonra, hEKT'ler taban plakasından çıkarılabilir. (IV) İlk olarak, (V) taban plakası çerçeveden kaldırılmadan önce biyoreaktör ters çevrilir. (VI) Altı hECT ile biyoreaktörün yandan görünümü. Ek: SPoT'lere göre gönderilerdeki hECT konumunu gösteren büyütülmüş görünüm (ek). (C) Polisülfon çerçevesindeki boşluktan görüldüğü gibi üç hECT sıkıştırma seviyesini ([I] düşük, [II] orta ve [III] yüksek) gösteren CAD işleme. Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: CAD = bilgisayar destekli tasarım; PDMS = polidimetilsiloksan; PTFE = politetrafloroetilen; SPoT = kararlı gönderi izleyici; hECT = insan mühendisliği kalp dokusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. hECT pacing ekipmanı

1. Isıtmalı sahne için ceket
   1. Akrilik yalıtım ceketinin bileşenlerini 0.635 cm kalınlığında şeffaf akrilik levhadan (Ek Dosya 3), Şekil 5A-D'den birer ve Şekil 5E, F'den ikişer tane kesmek için bir lazer kesim makinesi kullanın.
   2. Şekil 5'teki (B), (C), (D) ve (E) parçalarından birini birleştirin ve Şekil 5GI'de gösterildiği gibi akrilik yapıştırıcı kullanarak birbirine yapıştırın. Üst paneli takın (Şekil 5GII), yapıştırıcının kuruması için birkaç saat bekleyin ve ardından ısıtılmış s'yi kaydırın.tage ceketin yan tarafına (Şekil 5GIII).
   3. Ceket yerleştirildikten sonra, ekleri ısıtılmış s'nin bacakları arasına sabitlemek için bant kullanın.tage ve montajı bitirmek için ön paneli (Şekil 5GV) ekleyin (Şekil 5GV).
2. Grafit elektrot imalatı
   1. 6,25 mm kalınlığında, 25 mm genişliğinde grafit çubukları bir şerit testere kullanarak 35 mm uzunluğunda bloklar halinde kesin; Ardından, her bir elektrot bir uçta 13-16 mm ve diğer uçta 8-10 mm boyunda olacak şekilde her bloğu eğri bir çizgide uzunlamasına kesin. Üst köşeye 0.7 mm çapında iki delik açın (Şekil 6AI). Parçaları kağıt havluyla parlatın ve grafit tozunu gidermek için 20 dakika suda sonikasyon yapın. Elektrotlar arasında tutarlı bir mesafe sağlamak için elektrotların çanağın duvarları ile 25 mm genişliğindeki biyoreaktör arasına sıkıştığından emin olun (Şekil 6AII).
   2. Elektrotların deliklerinden 150 mm uzunluğunda x 0.25 mm çapında bir çelik tel geçirin ve kapağın kapanabilmesi için 60 mm'lik çanağın dudağına ve 100 mm'lik çanağın duvarlarına sığacak şekilde bükün (Şekil 6AII).
   3. Emilen ortamı çıkarmak için her kullanımdan sonra 1-2 saat damıtılmış suda bekleterek elektrotları temizleyin, gece boyunca kurumasını bekleyin ve ardından 132 °C'de 30 dakika otoklavlayın. Ölçümlere başlamadan önce, biyoreaktörün her iki tarafına birer elektrot yerleştirin (Şekil 6AII). Telleri 100 mm'lik çanak kapağı kapatılabilecek şekilde konumlandırın ve biyoreaktörü dengelemek için inkübatöre geri koyun.

Şekil 5: Isıtılmış cam tablayı yalıtmak için akrilik kılıf. Cam masa için tasarlanan akrilik ceketin parçalarının temel boyutlarını gösteren CAD görüntüleri. (A) Üst panelde, biyoreaktör çanağının ısıtma elemanına oturmasına izin vermek için 27 cm x 18.5 cm'lik bir delik oyuğu vardır. Köşelerdeki turuncu dikdörtgenler, ceketin üst kısmı ile ısıtma elemanı arasında boşluk sağlamak için küçük ara parçaların önerilen yerleşimini gösterir. (B) Ceketin alt kısmında, ısıtılmış tablanın bacaklarının içeri kaymasına izin vermek için iki kesik bulunur (yeşil yıldızlar). (C&D) Üst parçanın altına iki yan panel sığar. (D) Sol yan panel, sahne alanı güç kablosu için 3 cm x 0.3 cm'lik bir oyuk (iç) içerir. (E) Uzun paneller öne ve arkaya sığar. (F) Tablo içeri girdikten sonra boşlukları doldurmak için ekler eklenir. (G) (I) Yan ve arka paneller alt parçaya tutturulur ve ardından (II) üst panel eklenir. (III) Cam masa ceketin içine kaydırılır (eflatun oklar). (IV) Ekler masanın ayakları arasına tutturulur ve arka kısım kutuyu kapatmak için açıklığa oturur. (V) Tamamlanmış ceket montajı. Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: CAD = bilgisayar destekli tasarım; R = yarıçap; Ø = çap. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: hECT kasılmasına ilişkin verilerin elde edilmesi. (A) (I) Grafit çubuklardan kesilen elektrotların fotoğrafları. Eflatun oklar, paslanmaz çelik tellerin takılması için delikleri gösterir. Ölçek çubuğu = 1 cm. (II) Grafit elektrotların biyoreaktördeki yerleşimini gösteren eğik görünüm (solda) ve üstten görünüm (sağda). Elektrotlar, elektrotlar arasında tutarlı bir mesafe sağlamak için 25 mm genişliğindeki biyoreaktör ile çanağın duvarı arasındaki boşluğu kaplar. Teller, çanak kapağının kapanmasına izin verecek şekilde bükülür. (B) Laminer akışlı temiz tezgah içindeki hECT pacing kurulumunun fotoğrafı - temiz tezgahtan gelen titreşim gürültüsünü azaltmak için tüm ekipman titreşim izolasyon masasına yerleştirilir. Biyoreaktör (macenta ok ucu), yukarıdan bir LED ışık kaynağı ile aydınlatılan ceketli ısıtmalı tablaya oturur. Diseksiyon mikroskobu, biyoreaktörü aşağıdan görüntülemek için dik açılı bir aynaya (turuncu yıldız) yatay olarak doğrultulmuştur ve bir CCD kamera (solda) ile donatılmıştır. Turkuaz braket, kapalı devre ısıtmalı s'ye geri bildirim sağlamak için sürekli sıcaklık izleme için bir su banyosunu gösterir.tage kontrolör. Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: hECT = insan mühendisliği kalp dokusu; LED = ışık yayan diyot. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. hECT fonksiyonel ölçümleri

1. İlerleme hızı çalışma alanını ayarlama
   1. Isıtmayı açıntage 39.5 °C'ye getirin ve ilerleme hızı ekipmanını Şekil 6B'ye göre laminer akışlı temiz bir tezgah içindeki bir titreşim izolasyon masasına kurun. Diseksiyon mikroskobunu bir bom standına monte edin ve biyoreaktörü aşağıdan görüntülemek için cam masanın altındaki bir laboratuvar jakında bulunan dik açılı bir aynaya (Şekil 6B, turuncu yıldız) doğrultun. Mikroskoba yüksek hızlı bir CCD kamera takın ve bilgisayara bağlayın. Çalışma alanını sterilize etmek için kurulumu 15 dakika UV ışığıyla ışınlayın.
   2. Biyoreaktörü (Şekil 6B, macenta ok ucu) yukarıdan çift başlı bir deveboynu LED ışık kaynağı ile aydınlatılan ceketli ısıtmalı s'ye yerleştirin (LED lambaların boyunları, fiber optik lambalara kıyasla ana üniteye daha güvenli bir şekilde sabitlenebilir). Titreşim tablasındaki (ve tablanın kendisindeki) ilerleme hızı ekipmanının laminer akışlı temiz tezgahın herhangi bir parçasına temas etmemesini sağlayarak ek gürültüyü en aza indirin.
   3. Isıtılmış masaya 100 mm'lik bir kabın içine önceden ısıtılmış suyla doldurulmuş 60 mm'lik ikinci bir tabak ekleyin (Şekil 6B, turkuaz braket) ve sürekli sıcaklık izleme için bir sıcaklık probu ile donatın. Referans çanağın sıcaklığını 36-37 °C'de tutmak için ısıtılmış s'nin sıcaklık ayarını gerektiği gibi ayarlayın.
   4. Mikroskop büyütmesini 1.5x'e (veya bir hECT'nin bütünüyle yeterli çözünürlükle görselleştirilebileceği başka bir istenen büyütmeye) ayarlayın.
2. Kamera ayarlarının yapılması
   1. Kamera yazılımını açın. Görüş alanını mümkün olduğunca kırpmak için video akışını yeniden boyutlandırın ve aynı zamanda tüm hEKT'yi görselleştirmeye devam edin. Bu, kamera hızını en üst düzeye çıkarır.
   2. Yakalama hızını saniyede 90 kare olarak ayarlayın. Görüş alanı boyunca aydınlatma koşullarının homojenliğini optimize etmek ve SPoT'ların kontrastını en üst düzeye çıkarmak için pozlama süresini ve ışık kaynağı konumunu ayarlayın.
3. Satın alma yazılımı kurulumu
   1. Kare nabız stimülatörünü açın ve bilgisayara bağlayın. 12 V genlik ve 5 ms süre ile bifazik darbeler vermek için ayarları yapın.
   2. Veri toplama yazılımını açın ve ardından "AutomatedPostTracking3.vi" dosyasını açın (Ek Dosya 4). Yüklendikten sonra, programı başlatmak için araç çubuğunun sol tarafındaki beyaz oka tıklayın (Şekil 7A).
   3. Isıtılmış aşamada bir cam hemositometre kullanarak yazılımı kalibre edin. Araç çubuğunda (Şekil 7B), hemositometre işaretlerinin (gösterilmemiştir) 1 mm'si boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını tıklatın. Mesafe kalibrasyonu (piksel/mm) kutusunda (Şekil 7C), Referans uzunluğunu (mm) 1 olarak ayarlayın ve ardından Hesapla düğmesine tıklayın.
   4. Dokunun genişliği boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanarak hECT kesit alanını ölçün. Alanı hesaplamak için Kesit alanı (mm^2) kutusundaki (Şekil 7D) 1'e tıklayın (literatürde belirtildiği gibi doğrusal doku şeritlerinin silindirik bir geometrisi varsayılarak, ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,15,16,18,19,20^,
      21,22,23,24,25,26,37,38). hECT'nin farklı bölümleri boyunca tekrarlayın ve kutudaki diğer iki düğmenin altındaki değerleri kaydedin. Çıktı veri tablosu dosyası, dokunun çapını hesaplamak için bu üç değerin ortalamasını bildirir.
4. hECT fonksiyonel karakterizasyonu
   1. Gönderi ipuçlarının odakta olduğundan emin olun. Eşik anahtarını açın (Şekil 7E) ve kaydırıcıyı (Şekil 7F) SPoT'ler (Şekil 7G) düzgün bir şekilde ayrılana ve hECT daraldıkça şekil değiştirmeyene kadar ayarlayın.
   2. SpoT'lerden birinin çevresine bir dikdörtgen çizmek için dikdörtgen aracını kullanın (Şekil 7, yeşil dikdörtgen) ve SPoT'nin her zaman dikdörtgenin sınırları içinde kalmasını sağlamak için SPoT'nin etrafındaki dikdörtgen konumunu ayarlamak için Post sınırları kutusunun (Şekil 7H) içindeki Set 1 düğmesine tıklayın. Diğer gönderi için tekrarlayın ve Küme 2'nin altına kaydedin.
   3. Programın daha küçük nesneleri izlemesini önlemek için nesne boyutu ayarlarını (Şekil 7I) yapın. Her dikdörtgende izlenen nesne sayısının sabit kaldığından emin olun. Arayüz (Şekil 7J), izlenen nesneler arasındaki ölçülen mesafeyi gerçek zamanlı olarak gösterir. Gürültüyü izlemek için bu grafiği kullanın.
   4. Dosyaları kaydetmek için bir dizin seçin (Şekil 7K). Farklı günlere ait verileri ayrı klasörlerde saklayın. Geçerli Doku numarasını seçin ve istediğiniz yorumları Yorumlar kutusuna yazın.
   5. Pacing Frekansı (Hz) başlığının altında (Şekil 7L), istenen frekans aralığını (Min ve Max) ve Minimum'dan Max'e adım atmak için istenen Aralığı belirtin. hECT'leri tüm yakalama aralıkları boyunca hızlandırıyorsanız, 1:1 uyaran:tepe oranının elde edildiği en düşük frekansı bulmak için farklı ilerleme hızı frekanslarını test edin ve bu oran kaybolana kadar frekansı artırmaya devam edin. İsteğe bağlı bir frekans aralığı (örneğin, 0.01 Hz ila 0.01 Hz) seçerek ve kare nabız stimülatörü çıkışını kapalı tutarak spontan işlevi ölçün.
   6. Sağdaki kutularda, hECT'nin yeni ilerleme hızı frekansına ayarlanmasına izin vermek için istenen Ayar süresini/zamanlarını (frekans ayarlandıktan ancak veriler kaydedilmedikten sonraki bir zaman aralığı) seçin. Kayıt süresini (s) ve Pacing Voltage'ı (V) belirtin. Programı Başlat düğmesine tıklayarak programı başlatın (Şekil 7M).
      NOT: Sonuçlar seçilen dizine otomatik olarak kaydedilir. Her kayıttan sonra, komut dosyasının verilerin Fourier dönüşümünü gösterdiğini gözlemleyin (Şekil 7N), burada tepe noktaları algılanan vuruş frekansına karşılık gelir.
   7. İstenirse, görünümde hECT'yi uyarmak için gereken minimum voltajı bulmak için "Uyarma Eşiği Bulma" programını çalıştırın (Şekil 7O). İstenirse, direklerin maksimum ve minimum sapmalarını hesaplayın (Şekil 7P).

Şekil 7: Sapma sonrası veri toplama arayüzü. (A) Yazılımı çalıştırmak için düğme. (B) Sırasıyla uzunluk ölçümleri ve nesne seçimi için çizgi ve dikdörtgen araçlarını içeren araç çubuğu. (C) Mesafe kalibrasyon kontrolleri. (D) Üç farklı noktada hECT kesit alanını ölçmek için araçlar. (E) Video akışını gerçek zamanlı olarak yüksek kontrastlı görüntülere dönüştürmek için eşik anahtarı ve (F) kaydırıcısı. (G) Önizleme penceresinde görünen bir SPoT. (H) SPoT'ları seçmek için araçlar. (I) Nesneleri boyuta göre filtrelemek için kaydırıcı. (J) İzlenen nesneler arasındaki ölçülen mesafeyi gerçek zamanlı olarak gösteren grafik. (K) Çıktı dosyalarının kaydedileceği dizini seçme seçenekleri. (L) İzleme sonrası program (M) için frekans aralığını, frekans aralığını, kayıt süresini ve kayıtlar arasındaki süreyi ayarlama seçenekleri. (N) Son kaydedilen kaydın sapma eğrisinin Fourier dönüşümünün grafik çıktısı. (O) hECT'leri uyarmak için gereken minimum voltajı bulmak için program. (P) Direklerin maksimum ve minimum sapmalarını hesaplamak için program. Kısaltmalar: hECT = insan mühendisliği kalp dokusu; SPoT = kararlı gönderi izleyici. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. PDMS raf ölçümleri

1. Yüksüz mesafeler
   1. HCECT imalatından önce, istenen PDMS rafı çiftini bir çerçeveye monte edin. İşlevsel ölçümler için adım 5.1'de açıklanan ilerleme hızı kurulumunu ve yazılımını kullanın. Gönderilerin sonundaki sabit SPoT'ları seçin.
   2. Gürültüyü <2 μm'ye düşürmek için gerekirse ışık kaynağını ve/veya eşiği ayarlayın. Grafikte gösterilen ortalama canlı y değerini bir elektronik tabloya kaydedin.
2. Direk yükseklikleri ve hECT yükseklikleri
   1. Adım 5.2'de açıklanan ilerleme hızı kurulumundan, açılı aynayı ve ısıtmalı s'yi çıkarıntage. Biyoreaktörün yandan görünümü için biyoreaktörü doğrudan laboratuvar jakına yerleştirin.
   2. Kamera yazılımını açın. Görüş alanı boyunca aydınlatma koşullarının tekdüzeliğini optimize etmek ve direklerin görünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için pozlama süresini ve ışık kaynağı konumunu ayarlayın.
   3. Veri toplama yazılımını açın ve ardından "PostMeasurement_PB3.vi" dosyasını açın (Ek Dosya 5). Yüklendikten sonra, programı başlatmak için araç çubuğunun sol tarafındaki beyaz oka tıklayın.
   4. Yazılımı bir cam hemositometre kullanarak kalibre edin. Görüntüleme penceresinin solundaki dikey araç çubuğundaki çizgi aracına tıklayın ve hemositometre işaretlerinin 1 mm'si boyunca bir çizgi çizin. Ekranın sol alt kısmındaki Mesafe kalibrasyonu (piksel/mm) kutusunda, Referans uzunluğunu (mm) 1 olarak ayarlayın ve ardından Hesapla düğmesine tıklayın.
   5. Kalibrasyon alanlarının altında, Doku Numarası alanında istenen doku numarasını (tanımlama için) ayarlayın. Kamerayı hECT'nin sol direğine odaklayın ve Yazı Tarafı kutusunda Sol'u seçin.
   6. Gönderinin tabanından (üstte) SPoT'lerin ucuna (altta) bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın ve Gönderi Ht'sini Ölç'e tıklayarak kaydedin.
   7. Gönderinin tabanından hECT'nin uzak kenarına bir çizgi çizin ve Doku Üst Ht'yi Ölç'e tıklayarak kaydedin. Direğin tabanından hECT'nin yakın kenarına bir çizgi çizin ve Doku Tabanını Ölç Ht'ye tıklayarak kaydedin.
   8. Bu noktada, sağ direk yüksekliğini ölçmek için biyoreaktörü çevirin. Aynı ölçümleri kaydetmek için sağ gönderi seçeneğini seçin. Elektronik tabloyu ölçülen değerlerle doldurmak ve 7. adımda kullanılacak olan hECT'nin ortalama yüksekliğini otomatik olarak hesaplamak için Ekle düğmesine tıklayın.
   9. Doku yüksekliklerini kaydetmeyi bitirdikten sonra, İndirim Değerleri bir metin dosyasına kaydetmek için düğmesine basın.

7. Özel analiz komut dosyaları kullanarak işlevsel veri işleme

1. Bir e-tablo düzenleyicisinde, şablonu kullanarak özet dosyasını doldurun (Ek Dosya 6). Adım 6.2'de elde edilen post uzunluğu ve ortalama doku yüksekliği değerlerini kullanın. Klasörde veri bulunan tüm hECT'lerin özet dosyasında gösterildiğinden emin olun. Dosyayı "özet #.csv" olarak adlandırın, burada # denemenin kaç gün olduğunu gösterir.
   NOT: hECT fonksiyonel verileri, deney gününe göre ayrı klasörlerde olmalıdır.
2. AnalyzeLogsGUI betiklerini içeren klasörün (Ek Dosya 7) ve hECT kayıtlarının bulunduğu klasörün her ikisinin de yola eklendiğinden emin olun.
3. Veri analizi yazılımını açın. Dizin çubuğunun solunda, hem AnalyzeLogsGUI klasörünü hem de hECT işlevsel verilerini içeren üst klasöre gitmek için Klasöre Gözat düğmesine tıklayın. Geçerli Pencere kenar çubuğunda, Yola Ekle | Seçili klasörleri ve alt klasörleri ekleyin.
4. "AnalyzeLogsGui_SC.m" dosyasını açın. Editör sekmesinde Çalıştır düğmesine basın ve grafik kullanıcı arayüzünün (GUI) yeni bir pencerede görünmesini bekleyin.
   1. Günlük Seçimi kutusunda (Şekil 8AI), Dizin Seç düğmesine tıklayın ve hECT işlevsel verilerini içeren klasöre gidin. Doku açılır menüsünden işlenmek istenen hECT'yi seçin.
   2. Veri Girişleri kutusuna (Şekil 8AII), Diyastolik Mesafe alanındaki 6.1 adımlarından kaydedilen gönderiler arasındaki yüksüz mesafeyi girin. Post Radius (mm) alanına 0.25 girin.
   3. Analiz Kısıtlamaları kutusunda (Şekil 8AIII), analizden çıkarılacak frekansları seçin veya dahil edilecek belirli frekansları seçin (virgülle ayırarak). Başlangıç zamanı ve bitiş zamanı, kayıtların tüm uzunluğunu işlemek için varsayılan olarak sırasıyla 0 ve -1 olarak ayarlanmıştır. Gerekirse kayıtları kırpmak için bu değerleri değiştirin.
   4. Filtreleme işlemi sırasında yumuşatma düzeyini değiştirmek için Polinom Sırası ve Çerçeve Boyutu'nun filtre parametrelerini (Şekil 8AIV) ve komut dosyaları tarafından tanınacak en düşük tepe boyutunu ayarlamak için Tepe Algılama Eşiği kaydırıcısını değiştirin.
      NOT: Komut dosyası, artefaktların neden olduğu yüksek tepeleri kırpan Ani Artış Kaldırma seçeneğini içerir; Ancak bu, seğirmelerin şeklini değiştirdiği için önerilmez. Bunun yerine kaydı kırparak yapıları kaldırın (Şekil 8AIII).
   5. Ek veri analizi çıktısı için ek seçenekleri (Şekil 8AV) kullanın: Ek bir tepe algılama algoritması çalıştırmak için sapma sonrası analiz , Seğirme kuvveti eğrisindeki eksenleri otomatik olarak ayarlamak için yakınlaştırma grafiklerinde y eksenini otomatik ölçeklendirme (Şekil 8B), Her seğirme kuvveti figürünü bir .fig dosyasına kaydetmek için kuvvet izleme eğrilerini kaydetme ve Kuvvet süresi verilerini kaydetme Seğirme kuvvet eğrisi şeklinde çizilen filtrelenmiş verilerin x ve y koordinatlarını kaydetmek için.
   6. Tüm kayıt boyunca ortalaması alınan seğirme kuvvet eğrisinin (Ek Dosya 8) niteliklerini içeren bir .txt dosyası oluşturmak için Analizi Çalıştır'a tıklayın.

Şekil 8: Seğirme kuvvet eğrisi hesaplamaları. (A) Veri işleme yazılımında "AnalyzeLogsGUI.m" dosyası çalıştırıldığında GUI penceresi açılır. (I) Günlük Seçimi kutusu, kullanıcının hECT işlevsel verilerini içeren klasör için dizini seçmesine olanak tanır. Gün Sayısı alanı, protokol adımı 7.1'de oluşturulan özet dosyasının başlığından otomatik olarak doldurulur. İşlenecek hECT, Doku açılır menüsü kullanılarak seçilir. (II) Veri Girişleri kutusu, yüksüz mesafe (protokol adımı 6.1'de elde edilir) ve direk yarıçapı (0,25 mm) gibi hECT'yi destekleyen PDMS direği çifti hakkında bilgiler içerir. (III) Analiz Kısıtlamaları kutusu, kullanıcının kayıtları atlamak veya dahil etmek ve kırpmak için frekansları seçmesine olanak tanır. (IV) Filtre parametreleri kutusu, ham seğirme kuvveti eğrisinin nasıl filtreleneceğini seçme seçeneklerini içerir. Polinom Sırası ve Çerçeve Boyutu, filtreleme işlemi sırasında yumuşatma düzeyini değiştirir. Tepe Algılama Eşiği kaydırıcısı, komut dosyaları tarafından tanınacak en düşük tepe boyutuna karar verir. Ani Artış Kaldırma seçeneği, artefaktların neden olduğu uzun tepeleri keser. (V) Ek seçenekler arasında, ek bir tepe algılama algoritması çalıştıran Sapma sonrası analizi, seğirme kuvveti eğrisine etki eden yakınlaştırma grafiklerinde y eksenini otomatik ölçeklendirme, seğirme kuvveti rakamlarını kaydeden kuvvet izleme eğrilerini kaydetme ve çizilen seğirme kuvveti verilerini kaydeden kuvvet süresi verilerini kaydetme yer alır. (B) Panel A'dan GUI ekran görüntüsü tarafından üretilen 1 Hz'de tempolu bir hECT'nin 30 s'lik kaydının seğirme kuvveti eğrisi örneği. Kırmızı seğirme kuvveti eğrisi, ham seğirme kuvveti eğrisi üzerine bindirilen AIV'deki parametreler tarafından üretilen filtrelenmiş kuvveti gösterir (koyu mavi eğri, AV'de filtrelenmemiş verileri göster seçeneği seçildiğinde görünür). Kısaltmalar: hECT = insan mühendisliği kalp dokusu; GUI = grafik kullanıcı arayüzü; PDMS = polidimetilsiloksan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Representative Results

Yukarıdaki protokolü takiben, kardiyomiyositler daha önce grubumuz ^9,15 tarafından kullanılan sağlıklı bir iPSC hattından üretildi ve kültürde 8-61 gün sonra hEKT'lere üretildi. Şekil 9A, alttan bakıldığında, (üstte) ve (altta) SPoT'lar olmadan oluşturulan hEKT'lerin temsili görüntülerini göstermektedir. Fonksiyonel ölçümler, oda sıcaklığında (23 °C) ve fizyolojik sıcaklıkta (36 °C) hECT üretiminden 37 gün ile 52 gün sonra alındı. PDMS raflarının imalatında, deneyimli bir kullanıcının, altı direğin tümü bozulmadan PDMS raflarında %80 verim ve en az beş direğin toplam %95 verimine (laboratuvarımızdaki üç kullanıcıya göre) ve direk yüksekliğinde %<3 değişkenlik olmasını bekleyebileceğini belgeledik.

SPoT'ler, PDMS direklerinin uçlarına iyi bağlanmayan işaretleyici mürekkebin parçalanmış şekillerine kıyasla veri toplama sırasında izlenecek tek bir tanımlanmış şekil sağladı (Şekil 9B ve Ek Video S1) (Ek Video S2)²⁷. Bazı aşırı durumlarda, izleme nesnesi gizlenebilir (Şekil 9C, üst satır). Bu düzensizlikler, seğirme kuvveti eğrisini gizleyen ve böylece 10 μN altında geliştirilen kuvvetlerin doğru ölçümünü engelleyen çok fazla gürültüye neden olur. Bunu düzeltmek ve bu şekillerin tutarlı bir şekilde izlenmesini sağlamak için, kontrastı ve netliği optimize etmek için tipik olarak aydınlatma açısının ve konumunun birçok şekilde ayarlanması gerekir. SPoT şekillerinin koyuluğu ve düzenliliği bu süreci kolaylaştırır, böylece çekim süresini yaklaşık %50 azaltır (1 Hz ila 4 Hz tipik bir yakalama aralığı için ~12-30 dakikadan heECT başına 5-10 dakikaya kadar). Ek olarak, bu çalışmada, SPoT'ler optik izleme için daha güvenilir bir şekil sağladı ve gürültüdeki azalma, 5 μm'den daha az bir post sapmayı temsil eden 1 μN kadar düşük gelişmiş bir kuvvete sahip zayıf dokuların ölçülmesini sağladı (Şekil 9D) ve aynı hECT^27'nin ölçümleri arasındaki değişkenliği azalttı.

Deneyimlerimize göre, uzunlamasına deneylerde numune kaybı tipik olarak hECTS'nin ters çevrilmiş PDMS direklerinin uçlarından kayması nedeniyle meydana gelir. HETT'lerden bu kayma genellikle hEKT'lerin taban plakasından çıkarılmasıyla (Şekil 4BV, hECT imalatından 1-4 gün sonra) veya hatta daha sonra (hECT imalatından 1-3 hafta sonra) hEKT'ler kompakt ve olgunlaştıkça meydana gelir. HETT'lerin bu olgunlaşması bazen esnek direkler üzerinde, hEKT'lerin kendilerini bir direğin ucundan çekmelerini sağlamak için yeterli pasif ve aktif gerilim uygular ve bu da karşı direğin etrafında sıkıştırılmış işe yaramaz bir doku kümesine neden olur (Şekil 9E). SPoT'ler, Şekil 9G'de ölçüldüğü gibi, hECT kaybını önleyen bir kapak geometrisi sağlar (Şekil 9F). 2 yıl boyunca oluşturulan 103 biyoreaktör için (her biri başlangıçta üç ila altı heECT ile), SPoT'siz PDMS rafları, 66 biyoreaktörde ortalama olarak hECT'lerin %95'ini korudu. Bununla birlikte, çoğu biyoreaktörde doku kaybı olmazken, bazı biyoreaktörler hECT'lerin %30-100'ünü kaybetti (genellikle tek bir biyoreaktör tüm bir deney grubunu temsil ettiğinde), bu da önemli ölçüde verimsizliğe neden oldu. Bu çalışmada, SPoT'ler hECT kaybını etkili bir şekilde ortadan kaldırdı, böylece 37 biyoreaktörde tutma oranını %100'e kadar önemli ölçüde iyileştirdi (p = 0.038)²⁷.

Şekil 9: PDMS gönderilerine SPoT'lerin eklenmesiyle sapma sonrası veri kalitesinin iyileştirilmesi ve hECT tutulmasında artış. (A) SPoT'siz (üstte) veya (altta) SPoT'lu hEKT'lerin alttan görünümü. (B,C) Biyoreaktörün altından görüntülenen bir direkte bir hECT'nin bir ucunun yakın çekim görüntüleri, sağ sütun eşik ayarları veri toplama sırasındakiyle aynıdır. Kırmızı kutular, gönderi izleme yazılımı tarafından izlenebilen nesneleri gösterir. (B) Keçeli kalem mürekkebi olan bir direkteki izlenebilir referans işaretleyicilerin SPoT ile karşılaştırılması. (C) Keçeli kalem mürekkebi (üstteki iki sıra) veya SPoT'lu (alttaki iki sıra) direklerde rahat ve daraltılmış hECT'ler. (D) 5 μm'den daha az bir sapmaya karşılık gelen, 1 μN'lik gelişmiş bir kuvvetle 1 Hz'de elektriksel olarak tempolu bir hECT'nin örnek seğirme kuvveti izlemesi (deniz mavisi: filtrelenmemiş iz; macenta: filtrelenmiş iz). (E) HCECT'lerin direklerinden birinden kaydığı ve karşı direğin etrafında oluşan bir doku kümesine (turkuaz ok uçları) neden olduğu SPoT'leri olmayan bir biyoreaktörün eğik görünümü. (F) %100 hECT tutma oranını gösteren SPoT'lere sahip bir biyoreaktörün fotoğrafı. (G) SPoT'siz PDMS rafları (her biri üç ila altı hECT'li) (n = 322 hECT, 66 biyoreaktör) ve SPoT'li PDMS rafları (n = 134 hECT, 37 biyoreaktör) için biyoreaktör başına doku tutulmasını gösteren nokta grafiği, taban plakasının çıkarılması sırasında (1-4. günler) ve daha sonra kültür sürecinde (4-15. günler) doku arızası olan biyoreaktörlerden elde edilen veriler dahil. *p = 0.038; Elmas ortalamayı gösterir. Ölçek çubukları = 1 mm (A,C), 1 cm (E). Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltmalar: hECT = insan mühendisliği kalp dokusu; SPoT = kararlı gönderi izleyici; GUI = grafik kullanıcı arayüzü; PDMS = polidimetilsiloksan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yukarıdaki yöntemlerin örnek bir uygulaması olarak, hECT fonksiyonunun oda sıcaklığında (23 °C) yerine fizyolojik sıcaklıkta (36 °C) ölçülmesinin önemini de gösteriyoruz. hECT fonksiyonunun, ısıtılmış aşama ile mevcut pacing kurulumunda uzatılmış kültür süresi boyunca kararlı olduğu bulunmuştur (Şekil 10A)²⁷. Fizyolojik sıcaklıktaki ölçümlerle karşılaştırıldığında, hEKT'ler oda sıcaklığında daha yavaş kasılma ve gevşeme oranları ile değişen büzülme dinamikleri gösterdi ( Şekil 10B'deki zirvelerin eğimleri ile gösterilmiştir).

Bu çalışmada, 10 hECT üzerinden 1 hECT hipotermik inotropi gösterdi (geliştirilen kuvvetin 23 ° C'de 36 ° C'den daha yüksek olduğu), ancak yalnızca düşük frekanslarda. HCECT 1.5 Hz'de tempolandığında, 36 °C'de daha güçlü bir gelişmiş kuvvete (hipotermik inotropi yok) ve seğirmeler arasında tam bir gevşemeye (seğirme kuvveti eğrisinin düz tepe arası bölgeleri, sağ panel) sahipti, ancak 23 °C'de kasılmalar arasında eksik gevşemeye sahipti (tepeler arasında artan pasif kuvvet, sol panel) (Şekil 10BI). hECT 0.75 Hz'de tempolandığında, hipotermik inotropi mevcuttu (Şekil 10BII) ve hECT'nin 23 °C'de bile kasılmalar arasında tamamen gevşediği gözlendi (sol panel). Bununla birlikte, çoğu hEKT'nin yakalama aralığı sıcaklıklar arasında minimum örtüşme gösterdiğinden, hECT fonksiyonunun kesin frekans uyumlu karşılaştırmaları zordu. Bu, büyük ölçüde 23 °C'de (çoğunlukla ≤1.5 Hz) düşük maksimum yakalama frekansı ve 36 °C'de (çoğunlukla 1.5 Hz'≥) yüksek minimum yakalama frekansından kaynaklanıyordu (Şekil 10D); bu sınırlamalar doğal miyokardda (28 °C ve 37 °C'de test edilmiştir) görülmez, çünkü doğal ventriküler miyokard kendiliğinden atmaz⁴⁶. Frekans örtüşmesi olan hEKT'lerden sadece birinde frekans uyumlu hipotermik inotropi görüldü (Şekil 10D). Şekil 10B'deki seğirme kuvveti eğrileri ile gösterildiği gibi, 36 °C'de tempolu hEKT'ler, 23 °C'de (kesikli çizgiler) tempolu olduğundan daha yüksek +dF/dt ve -dF/dt büyüklükleri gösterdi (Şekil 10E, düz çizgiler). Hipotermik inotropi (kırmızı çizgi) gösteren hECT'de, düşük kuvvete rağmen 36 ° C'de kasılma ve gevşeme çok daha hızlıydı. 36 ° C'de tempolandığında, hEKT'ler ayrıca daha yüksek bir spontan atım hızına (Şekil 10F) (eşleştirilmiş bir t-testi için n = 10, p = 0.000016) ve daha geniş bir yakalama frekansı aralığına (Şekil 10G) (n = 9, eşleştirilmiş bir t-testi için p = 0.0000061), böylece^{4.5 Hz ila 6.75} Hz'nin 48 suprafizyolojik frekanslarında 1: 1 yakalama elde edilir (Şekil 10C).

Şekil 10: Sıcaklık bağımlılığını gösteren hECT kasılma dinamiği. (A) Zaman içinde işlevde kararlılığı göstermek için 30 dakika boyunca 1 Hz'de (üstte) tempolu bir hECT'nin seğirme kuvveti izlemesi, iç kısımlar (altta) 5 dakikalık aralıklarla üst kısmın büyütülmüş bir görünümünü gösterir. (B) Sırasıyla hipotermik inotropi olmadan ve hipotermik inotropi ile (I) 1.5 Hz ve (II) 0.75 Hz'de tempolu bir hECT'nin seğirme kuvveti izleri. Sol panel izleri 23 °C'de ve sağ panel izleri 36 °C'de elde edildi. (C) 23 °C'de (kesikli çizgiler) ve 36 °C'de (düz çizgiler) hEKT'lerin (iki biyoreaktörde üretimden sonraki 37. günde n = 6 hEKT, iki biyoreaktörde üretimden sonraki 52. günde n = 4) kuvvet-frekans ilişkisi. Her renk bir hektarı temsil eder. (D) Panel C'den her iki sıcaklıkta frekans örtüşmesini gösteren üç hECT'nin kuvvet-frekans ilişkileri, bunlardan biri frekans uyumlu hipotermik inotropi (siyah ok ucu) gösterir. (E) 23 °C (kesikli çizgiler) ve 36 °C'de (düz çizgiler) frekanslar arasında çizilen D panelindeki aynı hECT'lerin +dF/dt ve −dF/dt'si. (F) İki sıcaklık koşulunda hEKT'lerin spontan atım hızı (n = 10, p = 0.000016). (G) 1:1 stimülasyonlu frekans aralığı: her sıcaklıkta tepe yakalama (bu grafikteki frekans aralığı, maksimum yakalama frekansı - minimum yakalama frekansı olarak tanımlanır) (n = 9, p = 0.000006.1). Eşleştirilmiş Öğrenci t-testinden p değerleri. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu rakam van Neste^27'den değiştirildi. Kısaltma: hECT = insan mühendisliği kalp dokusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: İşlenmiş biyoreaktör parçaları için CAD dosyaları. Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: 3D baskılı SPoT döküm aparatı için CAD dosyaları. Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Isıtmalı aşama için yalıtkan akrilik kılıf için CAD dosyaları. Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: hECT sapmalarını izlemek için AutomatedPostTracking3.vi dosya (protokol adımı 5.3). Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: Direk uzunluklarını ve doku yüksekliklerini ölçmek için PostMeasurement_PB3.vi dosyası (protokol adımı 6.2). Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 6: Sapma sonrası verileri işlemek için kullanılan "özet #.csv" (protokol Adım 7.1) şablonu. Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 7: Sapma sonrası verileri işlemek için MatLab komut dosyalarını içeren AnalyzeLogsGUI klasörü (protokol adımı 7). Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 8: MatLab komut dosyası çıktısı "_datatable.txt" dosyasındaki değişkenlerin açıklamaları. 10-24 satırları, kayıt süresi boyunca tüm tepe noktalarında ortalaması alınan seğirme kuvveti eğrisinin parametrelendirmeleridir (satır 25'te gösterilmiştir). Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: SPoT'lu gönderilerde kendiliğinden dövülen hEKT'lerin videosu. Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: SPoT'leri olmayan gönderilerde kendiliğinden atan hEKT'lerin videosu. Bu dosya van Neste^27'den uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Literatürde yayınlanmış çok sayıda lineer mühendislik kardiyak doku modeli vardır ve bunların bazıları Tablo 1'de tanımlanmıştır. Bazı modeller doku kuvvetinin doğrudan ölçülmesini içerir, ancak bunlar tipik olarak yapının ayrı bir kas banyosuna^{aktarılmasını gerektirir 38}. Çoğu model, dokular her iki uçta, en yaygın olarak^PDMS direkleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ^,17,18,19,20,21,
22,25,26 (veya teller³⁹), doku manipülasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır ve dokular tarafından üretilen kuvvet, uç ankraj özelliklerinin optik takibi yoluyla doğru bir şekilde hesaplanabilir. ^Grubumuz 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 tarafından geliştirilen PDMS direkleri, orta büyüklükteki dokuları desteklemek için tasarlanmıştır ve bu direkler, verimi, hassas fonksiyonel ölçümleri ve doğal kardiyak nişin temel yönlerini korumayı dengeler. Direkler, 10,13,14,18,19,20,21,24 bölünmüş döküm yöntemine izin vermeyecek kadar küçüktü ve entegre kapaklar, kritik protokol adımı 1.3.2 sırasında direklerin kopmasına neden oluyordu. Kapaklar olmadan, hECT'ler direklerden kayabilir. Doku retansiyonunun %100 olmadığı durumlarda, bu biyoreaktörler genellikle hECT'lerin büyük bir bölümünü kaybederek ya hep ya hiç sorunu yaratır²⁷. Bu, en sık kritik protokol adımı 3.3.2 sırasında, hECT'ler taban plakası kuyusundan çıkarıldığında meydana geldi. HECT'ler bazen, direğin her iki ucu hECT'deki delikten dikkatlice geçirilerek direklere fiziksel olarak manipüle edilebilir; Bu sadece teknik olarak zorlayıcı değil, aynı zamanda müteakip kasılma işlevini olumsuz yönde etkileyebilecek önemli bir hasar kaynağıydı.

PDMS sonrası tasarımına eklenen SPoT'ler, daha geniş bir gerilim aralığına sahip hECT kültürüne izin verir. Bu nedenle, düşük sıkıştırma/pasif gerilim fenotipine sahip HEKT'ler (örneğin, düşük miyosit olmayan içerik veya dilate kardiyomiyopati^{modelleri 4}), aksi takdirde direklerden kayacak, SPoT'ler ile kültürlenebilir ve değerlendirilebilir. Tersine, kapak geometrisi, yüksek pasif gerilime sahip hEKT'lerin (örneğin, yüksek miyosit olmayan içerik veya bozulmuş diyastolik gevşeme⁴⁹ olan hastalık modelleri) düzgün PDMS direklerini çekme eğiliminde olan yerinde tutulmasını sağlar²⁷. Ek olarak, SPoT'ler, yalnızca önemli ölçüde daha küçük dokulara sahip başka bir modelde görülen ikinci bir üretim adımında PDMS direklerine eklendikleri için nispeten benzersizdir¹⁷. SPoT'ler bu ayrı üretim adımını gerektirse de, opak siyah renk, mıknatıslar veya floresan boncuklar gibi farklı malzemeleri kapağa dahil etme fırsatı ile aynı anda bir kapak geometrisinin eklenmesine izin verirler; Bunlar diğer bazı gruplar tarafından araştırılmıştır, ancak aynı zamanda ek üretim adımları^gerektirir 23,25,26.

Bu makalenin bir diğer odak noktası, sıcaklığın hECT fonksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmaktı. İn vivo kardiyak fonksiyonun birçok yönünü modellemek için kardiyak mühendislik dokuları kullanılmış olsa da (örneğin, hastalık modellemesi 4,8,50,51 ve ilaç yanıtları 15,21,52), bildiğimiz kadarıyla, sıcaklığa bağlı etkiler bu modellerde sistematik olarak araştırılmamıştır. Frekans uyumlu hipotermik inotropi, çok sayıda memeli türünde (sıçanlar 46,53,54, gelincikler⁵⁴, tavşanlar ⁵⁵ ve kediler⁵⁴) ve farklı yaşlardaki sağlıklı ve başarısız insan miyokardında görüldüğü gibi, hem belirgin - bazen gelişmiş kuvvette beş kat artışla - hem de her yerde bulunur⁴⁴. HEKT spontan atım hızının ve yakalama frekansları aralığının daha düşük sıcaklıklarda çok daha düşük frekanslara kaydırıldığını, ancak frekans uyumlu hipotermik inotropinin her zaman mevcut olmadığını bulduk²⁷. Olgunlaşma ^13,18 ve biyokarmaşıklık^56'daki ilerlemeler yoluyla tasarlanmış kalp dokularını iyileştirme arayışında, hipotermik inotropi, kardiyak biyosadakatin bir ölçütü olarak kullanılabilecek başka bir fonksiyonel doğal kalp kası fenotipi sunar.

Doğal miyokardın sıcaklığa bağımlılığı ışığında ve doğal kardiyak niş ortamını özetleme çabasıyla, tasarlanmış doku fonksiyonu genellikle fizyolojik sıcaklıkta karakterize edilir. Bununla birlikte, bu her zaman mümkün değildir, çünkü steriliteyi korurken doku fonksiyonel verilerini elde etmek için bazı sistemler ısıtmaya elverişli değildir. Bu nedenle, farklı sıcaklıklarda ölçülen dokular (veya doku modelleri) arasındaki fonksiyon karşılaştırmaları uygun olmayabilir. Gerçekten de, in vitro doku mühendisliği deneyleri için test koşullarının standardizasyonu hem rejeneratif tıpta⁵⁷ hem de Gıda ve İlaç İdaresi^58,59 gibi düzenleyici kurumlar tarafından gerekli görülmektedir. Bu yazıda açıklanan yöntemler, sıcaklığın hECT fonksiyonu²⁷ üzerindeki etkileri hakkında daha fazla çalışmaya olanak sağlamanın yanı sıra bu tür bir standardizasyonun sağlanmasına yardımcı olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp