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Neuroscience

हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला का अध्ययन करने के लिए एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के साथ संयुक्त न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक नकारात्मक छंटाई

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64369
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1The Francis Crick Institute, 2MSD R&D Innovation Centre

Summary

यहां प्रस्तुत माउस डेंटेट गाइरस से अलग एकल नाभिक को अनुक्रमित करने की एक विधि है जो प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक (एफएएन) -सॉर्टिंग के माध्यम से अधिकांश न्यूरॉन्स को शामिल नहीं करती है। यह दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता वाले अभिव्यक्ति प्रोफाइल उत्पन्न करता है और आला में प्रतिनिधित्व किए गए अधिकांश अन्य सेल प्रकारों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, जिसमें तंत्रिका स्टेम सेल जैसी दुर्लभ आबादी शामिल है।

Abstract

वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस (एएचएन), जिसमें डेंटेट गाइरस (डीजी) के उप-दानेदार क्षेत्र (एसजीजेड) के भीतर प्रोलिफेरेटिव और क्वीसेंट न्यूरल स्टेम सेल (एनएससी) का आजीवन रखरखाव होता है और ग्रेन्युल सेल परत में नए पैदा हुए न्यूरॉन्स से ग्रेन्युल कोशिकाओं में उनका भेदभाव होता है, कई अध्ययनों में अच्छी तरह से मान्य है। आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों, विशेष रूप से कृन्तकों का उपयोग करना, एएचएन को विनियमित करने वाले सिग्नलिंग मार्गों की जांच करने और हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला की रचना करने वाले प्रत्येक सेल प्रकार की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। उत्तरार्द्ध को संबोधित करने के लिए, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ एकल नाभिक अलगाव के संयोजन के तरीकों का प्रत्येक कोशिका आबादी के लिए जीन हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए एएचएन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा है। हालांकि डीजी के भीतर दुर्लभ सेल आबादी को फेनोटाइपिक रूप से प्रोफाइल करने के लिए इन तकनीकों के और शोधन की आवश्यकता है। यहां, हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) करने के लिए, न्यून एंटीजन के लिए बिना दाग वाले नाभिक का चयन करके, ताजा विच्छेदित डीजी से अलग एकल नाभिक निलंबन से अधिकांश न्यूरोनल आबादी को बाहर करने के लिए फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड न्यूक्लियस सॉर्टिंग (एफएएनएस) का उपयोग करता है। यह विधि एएचएन के अंतरकोशिकीय विनियमन की जांच करने और प्रजातियों में नए सेलुलर मार्करों और तंत्र को उजागर करने के लिए एक संभावित कदम है।

Introduction

वयस्कता में हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की निरंतर पीढ़ी, जिसे वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस (एएचएन) के रूप में भी जाना जाता है, संज्ञानात्मक कार्यों जैसे सीखने, स्मृति अधिग्रहण / निकासी और पैटर्न पृथक्करण से जुड़ा हुआ है और संज्ञानात्मक घाटे को रोकने के लिए उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में लचीलापन का एक महत्वपूर्ण तंत्र प्रतीत होता है 1,2,3 . कृंतक कई तरीकों का उपयोग करके एएचएन का अध्ययन करने के लिए पसंद का मॉडल रहे हैं, जिसमें इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियां शामिल हैं। अन्य प्रजातियों के लिए इन परिणामों का अनुवाद विवादास्पद बना हुआ है। दरअसल, अधिकांश प्रजातियों में एएचएन देखा गया है, लेकिन जिस हद तक यह पूरे जीवन में बना रहता है, विशेष रूप से मनुष्यों में 4,5,6,7,8, नियमित रूप से बहस की जाती है।

आज तक, एएचएन1 को संशोधित करने के लिए विभिन्न आंतरिक और बाह्य सिग्नलिंग मार्गों की पुष्टि की गई है। हालांकि, एएचएन पर अंतरकोशिकीय संचार का प्रभाव केवल9 उभर रहा है। यह पहले आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के साथ विवो विश्लेषण में संचालन करने के लिए वर्तमान में ज्ञात सेल मार्करों की अपर्याप्त विशिष्टता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। दरअसल, कई अध्ययनों ने डबलकोर्टिन या ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) जैसे मार्करों पर भरोसा किया है जो कई सेलप्रकारों 1 में व्यक्त किए जाते हैं। दूसरा, वयस्क हिप्पोकैम्पल आला10 में जटिलता और सेल विविधता की उच्च डिग्री हर सेल प्रकार को प्रोफाइल करने के लिए तकनीकी चुनौतियां लाती है। यह विशेष रूप से विभिन्न आबादी, जैसे एनएससी या ग्लियल कोशिकाओं के लिए विश्लेषणात्मक पाइपलाइनों में उपयोग किए जाने वाले अतिव्यापी सेलुलर मार्करों के साथ जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए मामला है, जिसके परिणामस्वरूप एएचएन 7,11 का आकलन करते समय विवादास्पद निष्कर्ष निकलते हैं। तीसरा, न्यूरॉन्स की विशाल संख्या एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स या एपेंडिमल कोशिकाओं जैसे कम प्रचुर मात्रा में सेल आबादी की जांच को कमजोर करती है, भले ही एएचएन के ठीक-ट्यूनिंग विनियमन में उनकीभूमिका प्रमुख हो रही है। साथ में, ये सीमाएं कृन्तकों से अन्य प्रजातियों में परिणामों का अनुवाद करने की क्षमता को प्रभावित करती हैं। यह विशेष रूप से एक जटिल ऊतक, जैसे हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला, और मानवऊतकों से जुड़े अध्ययनों में ऊतक प्रसंस्करण के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी के साथ-साथ उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक तक पहुंचने के लिए कई बाधाओं से बढ़ जाता है। इसलिए प्रोफाइल सेल आबादी के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करना और डेंटेट गाइरस (डीजी) के भीतर नए सेलुलर मार्करों की पहचान करना महत्वपूर्ण है जो अंततः एएचएन विनियमन के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के विभिन्न योगदानों की बेहतर समझ पैदा करेगा।

इसे प्राप्त करने के लिए, आरएनए अनुक्रमण के साथ संयुक्त एकल कोशिका (एससी) और एकल नाभिक (एसएन) अलगाव डीजी14 जैसे जटिल ऊतकों की जांच करने के लिए सहायक बन गया है। जैसे, माउस वयस्क हिप्पोकैम्पल आला से एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेलुलर संवर्धन की रणनीतियों को ज्यादातर एनएससी15,16 की जांच करने के लिए किया गया है। डीजी से गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक दिलचस्प रणनीति ग्लूआर 1 / सीडी 24 डबल-नकारात्मक एकल कोशिकाओं को अनुक्रमित करके लागू की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण17 के बाद एस्ट्रोसाइट्स और एनएससी के बीच अलग-अलग समूहों के बिना 1,408 कोशिकाओं को अनुक्रमित किया गया था। यह एकल कोशिका तैयारी के लिए आवश्यक कठोर एंजाइमेटिक पाचन के कारण हो सकता है जो सेल अखंडता और आरएनए को नुकसान पहुंचाता है। इस तकनीकी मुद्दे को बायपास करने के लिए, इसके बजाय एकल नाभिक अलगाव का उपयोग करने वाले कई तरीके विकसित किए गए हैं और विशेष रूप से जटिलऊतकों के लिए अनुकूल हैं। हालांकि, डीजी के भीतर या अधिक व्यापक रूप से हिप्पोकैम्पल-एंटोरिनल सिस्टम के भीतर न्यूरॉन्स की प्रबलता इन मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर मौजूद सेल आबादी की संपूर्णता का अध्ययन करने के लिए एक नमूना पूर्वाग्रह उत्पन्न करती है। इसके अलावा, एकल सेल पुस्तकालयों की तैयारी के लिए लोड करने के लिए कोशिकाओं की सीमित संख्या अनुक्रमित एकल नाभिक की विश्लेषणात्मक पाइपलाइनों में प्रमुख सेल आबादी की उपस्थिति को बढ़ाती है। दरअसल, बड़े न्यूरोनल क्लस्टर को अक्सर एनोटेट और विश्लेषण किया जाता है जबकि अन्य सेल आबादी को कम प्रतिनिधित्व दिया जा रहा है या 5,11 से चूक गया है।

इन पूर्वाग्रहों को दूर करने और माउस डीजी में मौजूद न्यूरॉन्स के अलावा अन्य सेल प्रकारों को प्रोफाइल करने में सक्षम होने के प्रयास में, फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड न्यूक्लियस सॉर्टिंग (एफएएनएस) 18 के सिद्धांत का उपयोग करके इस अध्ययन में एक विधि तैयार की गई थी जो न्यूरोनल परमाणु एंटीजन (न्यून) के साथ दाग वाले एकल नाभिक के नकारात्मक चयन द्वारा अधिकांश न्यूरोनल आबादी को बाहर करती है। Rbfox3 के रूप में भी जाना जाता है)। एंटीजन की इस पसंद को साहित्य द्वारा निर्देशित किया गया था जिसमें न्यूएन को एक विश्वसनीय न्यूरोनल मार्कर19 के रूप में वर्णित किया गया था और इस दृष्टिकोण के लिए परमाणु प्रोटीन का उपयोग करने की आवश्यकता थी। न्यून-नकारात्मक एफएसीएस-क्रमबद्ध कोशिकाओं को तब 10x जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म पर आरएनए अनुक्रमण के लिए तैयार किया गया था। परिणाम बताते हैं कि न्यून-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का बहिष्करण ग्लियल और दुर्लभ सेल आबादी के सेल-प्रकार विशिष्ट, उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है।

Protocol

पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट के दिशानिर्देशों के साथ-साथ यूके होम ऑफिस के दिशानिर्देशों और कानूनों के अनुसार किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: गैर-न्यूरोनल आबादी के एसएनआरएनए-सेक के लिए वयस्क चूहों के विच्छेदित डीजी से एकल नाभिक निलंबन की तैयारी। प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों का वर्णन करने वाला प्रवाह आरेख जिसमें माउस डीजी का विच्छेदन, एकल नाभिक के निलंबन की तैयारी, न्यून इम्यूनोस्टेनिंग और एसएनआरएनए-सेक के साथ आगे बढ़ने से पहले नकारात्मक न्यून-एफएएनएस-सॉर्टिंग शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. डीजी का विच्छेदन (समय: 15 मिनट)

  1. नाभिक अलगाव मीडिया 1 और 2 (एनआईएम 1 और एनआईएम 2), होमोजेनाइजेशन बफर (एचबी), और वॉश मीडिया (डब्ल्यूएम) (पूरक तालिका 1) तैयार करें। आवश्यकता होने तक बर्फ पर सभी बफर, मीडिया, अभिकर्मक और उपकरण रखें। तैयारी के दौरान बर्फ पर डौंस होमोजेनाइज़र ( सामग्री की तालिका देखें) रखें (होमोजेनाइजेशन चरण से कम से कम 1 घंटे पहले)।
    नोट: एनआईएम 1 तैयार किया जा सकता है और 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एनआईएम 2, एचबी और डब्ल्यूएम को ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
    सावधानी: डीटीटी, प्रोटीज अवरोधक और ट्राइटन एक्स -100 को देखभाल के साथ हेरफेर करें। ये यौगिक त्वचा और आंखों को परेशान करने वाले, तीव्र रूप से विषाक्त और जलीय वातावरण के लिए खतरनाक हैं। इन रसायनों का उपयोग करते समय सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, आंख और चेहरे की सुरक्षा पहनें, हैंडलिंग के बाद हाथों को अच्छी तरह से धोएं, और पर्यावरण में रिलीज से बचें।
  2. होम ऑफिस शेड्यूल 1 प्रक्रिया 20 के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा एक22 महीने के पुरुष C57Bl / 6J माउस को इच्छामृत्यु करें।
    नोट: इस अध्ययन में 22 महीने के माउस के उपयोग के बारे में तर्क के लिए चर्चा देखें। हालांकि, यह प्रोटोकॉल पूरे जीवनकाल में किसी भी उम्र में किया जा सकता है।
  3. एक इच्छामृत्यु माउस से मस्तिष्क को विच्छेदित करें और इसे बर्फ-ठंडे 1x PBS से भरे 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें (चित्रा 1)। पेट्री डिश को बर्फ पर रखें। एक स्केलपेल का उपयोग करके सेरिबैलम को हटा दें और मस्तिष्क को दोनों गोलार्धों के बीच आधे में काट लें (धनु अक्ष के साथ)।
  4. बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ एक नया 10 सेमी पेट्री डिश भरें और इसे बर्फ पर रखें। मस्तिष्क के आधे हिस्से को नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। दूरबीन का उपयोग करके, डीजी को विच्छेदित करें और मस्तिष्क के दूसरे आधे हिस्से से दूसरा डीजी प्राप्त करने के लिए इस चरण को दोहराएं।
    नोट: ये चरण (चरण 1.2-1.4) पहले वर्णित प्रक्रिया21 से अनुकूलित किए गए थे। कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखने के लिए इस स्तर पर जितनी जल्दी हो सके आगे बढ़ना महत्वपूर्ण है।
  5. दो डीजी को प्रीकूल्ड डौंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें और 1 एमएल ठंडा एचबी जोड़ें।

2. ऊतक पृथक्करण, एकल नाभिक अलगाव, और एंटी-न्यून इम्यूनोस्टेनिंग (समय: 2 घंटे)

  1. ढीले "ए" मूसल के 10 स्ट्रोक के साथ ऊतक को समरूप करें, इसके बाद तंग "बी" मूसल के 15 स्ट्रोक।
    नोट: घर्षण और फोमिंग के कारण गर्मी को कम करने के लिए कोमल स्ट्रोक के साथ बर्फ पर मोर्टार के साथ डौंस होमोजेनाइजेशन किया जाना चाहिए। प्रक्रिया के दौरान सभी बफर और उपकरणों को प्रीकूल किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
  2. होमोजेनेट को एक प्रीचाइल्ड 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें; डौंस होमोजेनाइज़र को 1 एमएल ठंडे एचबी के साथ धोएं और उसी ट्यूब में मिलाएं। 15 एमएल ट्यूब में 3 एमएल एचबी जोड़ें और बर्फ पर 5 मिनट इनक्यूबेट करें। ट्यूब को धीरे से मोड़कर 2x मिलाएं।
  3. 50 एमएल टेस्ट ट्यूब पर 0.5 एमएल एचबी के साथ 70 μm छन्नी टोपी को पहले से गीला करें। चरण 2.2 से नाभिक निलंबन को 15 एमएल ट्यूब पर धीरे से सेल स्ट्रेनर में घुमाकर छान लें। सेल छन्नी को 0.5 एमएल एचबी के साथ धो लें।
  4. सेल छन्नी को हटा दें और स्विंग बकेट सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 500 x g पर 500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर टेस्ट ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    नोट: होमोजेनेट को तनाव देने से मलबे को कम करने में मदद मिलेगी, जो प्रवाह साइटोमेट्री और एसएनआरएनए-सेक डाउनस्ट्रीम चरणों के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके एचबी के 4 एमएल में गोली को धीरे से पुन: निलंबित करें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 x g पर स्पिन करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 3 एमएल डब्ल्यूएम में गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. 15 एमएल टेस्ट ट्यूब पर 0.5 एमएल डब्ल्यूएम के साथ 35 μm छन्नी कैप को पहले गीला करें। नाभिक निलंबन को चरण 2.5 से सेल छन्नी के माध्यम से छान लें, धीरे से P1000 पिपेट का उपयोग करके एक बार में 0.5 mL को पाइप करें।
  7. 0.5 एमएल डब्ल्यूएम के साथ छन्नी टोपी धोएं और ट्यूब को बर्फ पर रखें। फिल्ट्रेट को एक नए 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 500 x g पर स्थानांतरित करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 3 एमएल डब्ल्यूएम में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर स्पिन करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और माउस एंटी-न्यूएन, एलेक्सा फ्लूर 488-संयुग्मित एंटीबॉडी (एंटी-न्यून-एएफ 488, 1: 32,000) और 1 μg / mL DAPI के साथ WM के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में बर्फ पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: पृथक नाभिक के इम्यूनोस्टेनिंग को अनुकूलित करने के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और छंटाई के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने को निर्धारित करने के लिए एंटीबॉडी को टाइट करने की सिफारिश की जाती है। फिर, यह पुष्टि करने के लिए पर्याप्त नियंत्रण चलाएं कि धुंधला होने की स्थिति इष्टतम है। उदाहरण के लिए, संयुग्मित एंटी-न्यून-एएफ 488 एंटीबॉडी के साथ, एक नकारात्मक नियंत्रण (यानी, एंटीबॉडी का कोई अतिरिक्त नहीं, पूरक चित्रा 1 ए) और एक सकारात्मक नियंत्रण (यानी, एंटीबॉडी के साथ धुंधला, पूरक चित्रा 1 बी) बिना दाग और दाग वाली आबादी के अलगाव का आकलन करने के लिए चलाया गया था। एएफ 488-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ काम करना शुरू करते समय, विशिष्टता का आकलन करने के लिए एएफ 488-संयुग्मित आइसोटाइप नियंत्रण चलाने की सिफारिश की जाती है। यदि एक गैर-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी के अस्पष्ट बंधन का आकलन करने के लिए केवल नाभिक तैयारी में द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ने जैसे अतिरिक्त नियंत्रण की आवश्यकता हो सकती है।

3. न्यूरोनल आबादी को बाहर करने के लिए फ्लोरेसेंस सक्रिय नाभिक छंटाई (एफएएनएस) (समय: 45 मिनट)

  1. इम्यूनो-सना हुआ नाभिक निलंबन को 5 एमएल टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया की शुरुआत तक बर्फ पर रखें।
    नोट: यदि दो माउस डीजी की तुलना में ऊतक के बड़े टुकड़ों के साथ काम कर रहे हैं, तो समाधान में नाभिक घनत्व अधिक होने पर एफएसीएस को बंद करने से बचने के लिए डब्ल्यूएम बफर के साथ और कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. एफएसीएस उपकरण में ट्यूबों को रखने से पहले कम गति पर 3 सेकंड के लिए नमूने ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: (एफएसीएस सेटअप) सॉर्टिंग मशीनों को निर्माता की सिफारिशों के बाद अंशांकन कणों के साथ प्रक्रिया की शुरुआत में संरेखित करने की आवश्यकता होती है। एफएसीएस मॉडल के अनुसार ड्रॉप देरी को मोतियों या माइक्रोसेफर्स ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ कैलिब्रेट किया गया था। नमूने शुद्धता मोड पर 4 डिग्री सेल्सियस पर क्रमबद्ध किए गए थे। संग्रह की मात्रा को कम करने के लिए, नाभिक को प्रवाह साइटोमीटर के लिए अनुशंसित दबाव पर 70 μm नोजल के माध्यम से क्रमबद्ध किया गया था। नाभिक को 1.5 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूबों ( सामग्री की तालिका देखें) में क्रमबद्ध किया गया था जिसमें 50 μL WM था। ट्यूब की दीवारों से चिपके नाभिक के जोखिम को कम करने के लिए सभी संग्रह ट्यूबों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस + 5% बीएसए में लेपित किया गया था।
  3. दाग वाले नाभिक निलंबन के नमूने से डेटा प्राप्त करने के लिए, सेल मलबे और एकत्रित नाभिक को बाहर करने के लिए DAPI-ऊंचाई और DAPI-क्षेत्र में द्वार सेट करें (चित्रा 2A)। इसके अलावा, लॉग साइड स्कैटर (एसएससी)-क्षेत्र और लॉग फॉरवर्ड स्कैटर (एफसीएस)-क्षेत्र (चित्रा 2 बी) में गेट सेट करके किसी भी शेष डीएपीआई-दाग वाले समुच्चय या सेल मलबे से एकल नाभिक को अलग करें।
  4. जैसा कि चित्र 2 सी में दिखाया गया है, न्यून-एएफ 488-नकारात्मक आबादी को अलग करने के लिए एंटी-न्यून-एएफ 488 और एफएससी-क्षेत्र के लिए द्वार सेट करें।
  5. विश्लेषण के बाद, ऊपर वर्णित गेटिंग रणनीति का उपयोग करके, 50 μL WM से भरे 1.5 mL संग्रह ट्यूब में NeuN-AF488-नकारात्मक आबादी को क्रमबद्ध करें।
    नोट: ऊपर वर्णित गेटिंग रणनीति और एक वयस्क माउस के मस्तिष्क से डीजी को अलग करने के लिए विच्छेदन प्रक्रिया के बाद, न्यून-एएफ 488-नकारात्मक आबादी को एकल नाभिक के ~ 14% का प्रतिनिधित्व करने की उम्मीद है।

Figure 2
चित्रा 2: डीजी से गैर-न्यूरोनल सेल आबादी का अलगाव और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग (ए-सी) गेटिंग रणनीति न्यून-एएफ 488 नकारात्मक एकल नाभिक को अलग करने और सेल मलबे को बाहर करने के लिए। (ए) अलग-थलग नाभिक के प्रतिनिधि नमूने का एफएएनएस डॉट प्लॉट, जो डीएपीआई + नाभिक के चयन के लिए गेट सेटिंग और सेल मलबे और समुच्चय के बहिष्करण को दर्शाता है। (बी) एफएससी-क्षेत्र और एसएससी-क्षेत्र का उपयोग करके प्रासंगिक एकल नाभिक का आगे चयन। (C) सकारात्मक जनसंख्या को बाहर करने और नकारात्मक एकल नाभिक के लिए क्रमबद्ध करने के लिए NeuN-AF488 के लिए द्वार। (डी) खराब गुणवत्ता वाले नाभिक (सफेद तीर) की तुलना में मलबे की न्यूनतम मात्रा और अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक (गोल आकार, काले तीर) के उच्च अनुपात के साथ एक अच्छे एकल नाभिक निलंबन का माइक्रोग्राफ। स्केल सलाखों = 50 μm, 10 μm (इनसेट)। (E, F) 22 महीने के सी 57बीएल / 6 जे नर चूहों के डीजी से अलग किए गए विशिष्ट सेल आबादी के एसएनआरएनए-सेक डेटा और प्रोफाइलिंग का विश्लेषण। (ई) गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध कोशिकाओं और (एफ) न्यून-नकारात्मक एफएसीएस-क्रमबद्ध कोशिकाओं से एकल नाभिक प्रोफाइल के आयाम न्यूनीकरण (यूएमएपी) भूखंडों के लिए समान मैनिफोल्ड सन्निकटन और प्रक्षेपण, सेल प्रकार द्वारा रंगीन। (जी) पाई चार्ट दोनों नमूनों में पहचाने गए सेल प्रकारों की आवृत्तियों की तुलना करते हैं। (एच) अनुक्रमित नमूनों के लिए संबंधित मैट्रिक्स: नाभिक की संख्या, जीन की औसत संख्या, और प्रति नाभिक प्रतिलेख। (I) वायलिन प्लॉट दोनों नमूनों में प्रत्येक सेल प्रकार के लिए पाए गए जीन और प्रतिलेख की संख्या के वितरण को दर्शाते हैं। Astr. = एस्ट्रोसाइट्स, ओलिग। = ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, वास्क। = संवहनी कोशिकाएं, सीआरसी = कैजल-रेट्ज़ियस कोशिकाएं, न्यूर = न्यूरॉन्स, आईएमएम। = प्रतिरक्षा कोशिकाएं, ओपीसी = ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण करने के लिए एकल नाभिक निलंबन की तैयारी (समय: 30 मिनट)

  1. छंटाई के बाद, ट्यूब की दीवार पर बूंदों को इकट्ठा करने के लिए संग्रह ट्यूब में 1% बीएसए युक्त 1 एमएल पीबीएस जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर घूमें। 50 μL छोड़कर, सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेटेड नाभिक को सावधानी के साथ संभालें क्योंकि ट्यूब के तल पर किसी भी गोली का निरीक्षण करना मुश्किल हो सकता है। स्विंग-बकेट सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करने से गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरने वाले को छोड़ने में मदद मिलेगी।
  2. धीरे-धीरे सेंट्रीफ्यूजेटेड नाभिक को पुन: निलंबित करने के लिए पाइप करें। 0.5 एमएल माइक्रोट्यूब में ट्राइपैन ब्लू के 5 μL में नाभिक निलंबन का 5 μL जोड़ें।
    सावधानी: ट्रिपैन ब्लू को देखभाल के साथ संभालें क्योंकि यह स्वास्थ्य के लिए खतरनाक है, कैंसर का कारण बन सकता है, और प्रजनन क्षमता या अजन्मे बच्चे को नुकसान पहुंचाने का संदेह है। सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंख और चेहरे की सुरक्षा पहनें। तब तक न संभालें जब तक कि सभी सुरक्षा सावधानियों को पढ़ा और समझा न जाए।
  3. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके एकल सेल निलंबन की एकाग्रता को मापें और व्यवहार्यता का आकलन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। चरण 5 में विस्तृत रूप से पुस्तकालय की तैयारी और नाभिक का अनुक्रमण करें।
    नोट: जिन नमूनों को अनुक्रमण के लिए अच्छी गुणवत्ता का माना जाता था, उन्होंने माइक्रोस्कोप के तहत गोल और नियमित नाभिक आकार दिखाया, जिसमें कोई सेल मलबे नहीं थे (चित्रा 2 डी)। परमाणु झिल्ली के चारों ओर एक प्रभामंडल की उपस्थिति या एक साथ कई नाभिकों का एकत्रीकरण क्षतिग्रस्त नाभिक के संकेत हैं और इस तरह के सेल निलंबन को एसएनआरएनए-सेक (चित्रा 2 डी) के लिए नहीं माना जाना चाहिए। नाभिक की मापी गई सांद्रता 300-700 नाभिक /

5. पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण

नोट: निम्नलिखित चरणों का विवरण इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले इन-हाउस अनुक्रमण मंच पर आधारित है ( सामग्री की तालिका देखें)। इसलिए, एक अलग प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करते समय कुछ सेटिंग्स भिन्न हो सकती हैं। यहां, केवल प्रमुख चरणों का वर्णन किया गया है और प्रत्येक पैरामीटर को पहले उपयोग से पहले अनुकूलन के साथ चुने हुए निर्माता से मार्गदर्शन और प्रोटोकॉल का पालन करते हुए निर्धारित किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि आरएनए क्षरण से बचने और अनुक्रमण की इष्टतम गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए क्रमबद्ध नाभिक निलंबन पर ध्यान केंद्रित करने के बाद पुस्तकालयों की तैयारी जितनी जल्दी हो सके की जाए।

  1. एक माइक्रोफ्लुइडिक्स सिंगल सेल चिप में 7,000 और 10,000 नाभिक के बीच लोड करें।
  2. प्रदान किए गए नियंत्रक और चुने हुए आपूर्तिकर्ता से अभिकर्मकों का उपयोग करके नैनोलीटर स्केल बूंदों में विभाजन ने नाभिक लोड किया। प्रत्येक बूंद के भीतर लाइस नाभिक और रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट आरएनए।
    नोट: एक बूंद के भीतर सभी परिणामी सीडीएनए ने एक ही सेल बारकोड साझा किया।
  3. चुने हुए आपूर्तिकर्ता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए एसएनआरएनए-सेक के लिए पुस्तकालय तैयार करें और अनुक्रमण मंच के साथ संगतता सुनिश्चित करें। वैद्युतकणसंचलन, फ्लोरोमेट्री, या क्यूपीसीआर-आधारित विधियों का उपयोग करके अंतिम पुस्तकालयों की गुणवत्ता और एकाग्रता की जांच करें और यदि लागू हो, तो अनुक्रमण से पहले उन्हें समान रूप से पूल करें।
  4. निर्माता की सिफारिश के अनुसार डिनेचर ने 3'जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालयों को पूल किया और पतला किया।
  5. प्रति सेल 50,000 रीड जोड़े की अनुक्रमण गहराई के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर युग्मित-अंत, एकल या दोहरी अनुक्रमण अनुक्रमण करें।

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एसएनआरएनए-सेक करने के लिए डीजी से अलग गैर-न्यूरोनल एकल नाभिक के निलंबन को तैयार करने की एक विधि का वर्णन करता है। एफएएनएस के साथ या बिना, जैव सूचना त्मक क्लस्टरिंग ने डीजी (चित्रा 2 ई, एफ) के भीतर ज्ञात सेल प्रकारों के अनुरूप नाभिक के अच्छी तरह से अलग समूहों का खुलासा किया। गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने के भीतर, अनुक्रमित उच्च गुणवत्ता वाले नाभिकों में से अधिकांश में न्यूरॉन्स के तीन समूह शामिल थे (इस नमूने के लिए कुल नाभिक का 84.9%, चित्रा 2 ई, जी, एच)। इस तरह के परिणामों की उम्मीद है, यह देखते हुए कि डीजी में सबसे अधिक प्रतिनिधित्व वाली सेल आबादी ग्रेन्युल न्यूरॉन्स, अन्य उत्तेजक न्यूरॉन्स (लेबल उत्तेजक न्यूरॉन्स), और निरोधात्मक न्यूरॉन्स10 हैं। पहचाने गए गैर-न्यूरोनल क्लस्टर ज्यादातर ग्लियल सेल प्रकार (11.1%) से बने थे, जिनमें एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं (ओपीसी), प्रतिरक्षा कोशिकाएं (3.3%), और कैजल-रेट्ज़ियस कोशिकाएं (0.6%) शामिल थीं। न्यून पॉजिटिव आबादी को बाहर करने के लिए एफएएनएस का प्रदर्शन करते समय (न्यून-नकारात्मक एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूना; चित्रा 2 एफ, जी, एच), ग्लियल कोशिकाओं के समूह प्रमुख हो गए (81.3%)। ग्लियल नाभिक की अधिक संख्या का अलगाव विभिन्न आबादी के बेहतर विभाजन की अनुमति देता है जो एफएएनएस के बिना एक साथ क्लस्टर होगा। दरअसल, एनएससी या एस्ट्रोसाइट्स में व्यक्त विशिष्ट जीनों को फिर से क्लस्टरिंग और विश्लेषण करने पर, चार उप-समूह अलग हो गए (पूरक चित्रा 2 ए, बी)। अधिक विशिष्ट सेलुलर मार्करों को देखते हुए और सेल-प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करते हुए, एनएससी के एक छोटे समूह को मुख्य एस्ट्रोसाइटिक आबादी से अलग करने का पता चला, जिसमें होपक्स और नॉच 2 की उच्च अभिव्यक्ति थी और एएलडीएच 1 ए 1 या एक्यूपी 4 (पूरक चित्रा 2 सी) की लगभग कोई अभिव्यक्ति नहीं थी। हालांकि, एस्ट्रोसाइट्स और एनएससी के बीच जीन अभिव्यक्ति में ओवरलैप के कारण, विशेष रूप से विभिन्न उप-प्रकार की कोशिकाओं को प्रोफाइल और पहचानने के लिए आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, न्यून-नकारात्मक एफएएनएस नमूने में संवहनी कोशिकाओं (2.3%) के रूप में लेबल किए गए अतिरिक्त क्लस्टर थे जो एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट और संवहनी लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं को शामिल करते हैं जब सेल विशिष्ट मार्करों (डेटा नहीं दिखाया गया) की अभिव्यक्ति के लिए क्रॉस-संदर्भित किया जाता है।

अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए चुने गए प्रोटोकॉल के मार्गदर्शन के बाद, एफएएनएस के साथ या बिना उच्च गुणवत्ता वाले अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त किए गए थे। नाभिक पर अनुक्रमित नमूनों के लिए, गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने (5,578 प्रतिलेख, चित्रा 2 एच) और न्यून-नकारात्मक एफएएनएस नमूने के लिए 1,665.5 जीन (3,508 प्रतिलेख) के लिए प्रति नाभिक औसतन 2,510 जीन का पता लगाया गया था। ये मैट्रिक्स पुष्टि करते हैं कि यह प्रोटोकॉल विभिन्न दृष्टिकोणों22,23 का उपयोग करके अध्ययनों की तुलना में एकल नाभिक की उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग उत्पन्न करता है और एफएसीएस सॉर्टिंग की प्रक्रिया बाद के एसएनआरएनए-सेक के लिए नाभिक को नुकसान नहीं पहुंचाती है। विशेष रूप से, दो नमूनों के बीच प्रति नाभिक जीन और प्रतिलेख की संख्या में अंतर कम डेटा गुणवत्ता के कारण नहीं है, बल्कि गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने में न्यूरॉन्स के उच्च अनुपात (न्यून-नकारात्मक एफएएनएस नमूने में 1.7% की तुलना में 84.9%) के कारण है, जिसमें सभी गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों की औसत ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि (2,660 जीन / न्यूक्लियस और गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने में 6,170 प्रतिलेख / नाभिक) हैं। न्यूक्लियस, चित्रा 2 आई)।

साथ में, इन प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि एफएएनएस का उपयोग करके न्यून नकारात्मक नाभिक का चयन ताजा विच्छेदित मस्तिष्क ऊतक से कम बहुतायत सेल प्रकारों को अलग करने और एसएनआरएनए-सेक विधियों के माध्यम से इन अलग-अलग सेल आबादी की उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

पूरक चित्रा 1: प्रशंसकों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग का सत्यापन। नाभिक निलंबन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एंटी-न्यून-एएफ 488 एंटीबॉडी के बिना या एंटीबॉडी के साथ (बी) इनक्यूबेट (ए) किया गया था और इम्यूनोस्टेनिंग स्थितियों को मान्य करने के लिए एफएसीएस सॉर्टर के माध्यम से चलाया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और एस्ट्रोसाइट क्लस्टर का पुन: क्लस्टरिंग। (क) समरूप मैनिफोल्ड सन्निकटन और आयाम न्यूनीकरण के लिए प्रक्षेपण (यूएमएपी) प्लॉट चित्र 2एफ से जीनोम-वाइड अभिव्यक्ति प्रोफाइल के आधार पर 4968 नाभिकों के क्लस्टरिंग को दर्शाता है। सेल-टाइप कॉल सेल-टाइप मार्करों के आधार पर किए गए थे। (बी) एस्ट्रोसाइट क्लस्टर में संभावित सेलुलर उप-प्रकारों की जांच के लिए आगे की उप-सेटिंग के लिए (ए) से चुने गए 2579 नाभिक शामिल थे। सेरेट (0-3) क्लस्टरिंग द्वारा चार उप-प्रकारों का पता लगाया गया था, जो विभिन्न रंगों द्वारा दिखाए गए थे। (सी) चार सेल-प्रकारों में विशिष्ट सेलुलर मार्करों के जीन अभिव्यक्ति स्तर। सभी भूखंड सेरेट आर पैकेज24 का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। संक्षेप में, आरएनए-सेक गणना को कुल अभिव्यक्ति द्वारा प्रत्येक सेल के लिए सामान्यीकृत किया गया था और स्केल फैक्टर (10,000) से गुणा किया गया था। यह परिणाम तब लॉग रूपांतरित किया गया था। एम्बेडिंग की गणना करने के लिए यूएमएपी लागू होने से पहले प्रत्येक सेल के भीतर रूपांतरित मूल्यों को स्केल किया गया था (विचरण को एक पर स्केल किया गया था) और केंद्रित (औसत सेट से शून्य पर) किया गया था, जिसका उपयोग एक्स और वाई अक्षों पर मूल्यों के रूप में किया गया था। ग्राफ़ एक 2 डी स्कैटर प्लॉट पर एक आयामी कमी तकनीक के आउटपुट का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां प्रत्येक बिंदु कमी तकनीक द्वारा निर्धारित सेल एम्बेडिंग के आधार पर संबंधित एक्स और वाई समन्वय के साथ एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है। समान जीन हस्ताक्षर वाली कोशिकाओं को एम्बेडिंग द्वारा एक दूसरे के करीब रखा जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: न्यूरोजेनिक वंश में न्यून का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। (ए) सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटासेट15 से न्यूरोजेनिक वंश के क्लस्टरिंग को दर्शाने वाला यूएमएपी प्लॉट। यूएमएपी को पूरक चित्र 2 में प्रस्तुत किया गया था। (बी) न्यूरोजेनिक वंश में विशिष्ट सेलुलर मार्करों के जीन अभिव्यक्ति स्तर एस्ट्रोसाइट्स (एक्वापोरिन 4 = एक्यूपी 4), एनएससी (होमोडोमेन-ओनली प्रोटीन = हॉप्स), न्यूएन / आरबीफॉक्स 3 (एनएससी और मध्यवर्ती पूर्वज कोशिकाएं [आईपीसी]), और साइकिलिंग कोशिकाएं (साइक्लिन-निर्भर किनेज 6 = सीडीके 6)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर की रचनाएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए, डीजी का विच्छेदन पहला महत्वपूर्ण कदम है, जिसके लिए इसे बिना नुकसान के रखने और आसपास के ऊतकों से संदूषण को सीमित करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है। अनुभव से, हिप्पोकैम्पस से डीजी को अलग करना एक कुशल शोधकर्ता द्वारा बहुत जल्दी हासिल किया जा सकता है, जो तब विच्छेदन की तेजी को बढ़ाने के लिए अपनी तकनीक को परिष्कृत करने पर काम कर सकता है और इसलिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए ऊतक की ताजगी में सुधार कर सकता है। इसी तरह, एकल नाभिक की तैयारी और पुन: निलंबन एक ही प्रयोग में उपयोग की जाने वाली विभिन्न स्थितियों में स्थिरता की मांग करता है, लेकिन अत्यधिक पाइपिंग से भी बचा जा सकता है जो परमाणु झिल्ली को परिवेश आरएनए जारी करने में बाधा डाल सकता है जो अनुक्रमण परिणामों को पूर्वाग्रह ति करेगा। उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक तैयार करने के लिए पहले उल्लिखित सिफारिशों के अलावा, अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ने से पहले एकल नाभिक निलंबन की एकाग्रता पर भी विचार किया जाना है। दरअसल, निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार, 1,200 nuc / μL से अधिक एकाग्रता वाली तैयारी को पतला किया जाना चाहिए, क्योंकि नाभिक एकाग्रता के इस स्तर में डाउनस्ट्रीम जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण को प्रभावित करने वाले गुणक बनाने का उच्च जोखिम होगा। ध्यान दें, 500 nuc / μL से कम नाभिक सांद्रता वाले अनुक्रमण नमूने शामिल लागत के कारण सार्थक नहीं हो सकते हैं। यह भी अनुशंसा की जाती है कि सभी गेटिंग सेट करने के लिए एक उन्नत एफएसीएस उपयोगकर्ता की सलाह का पालन करें और नमूनों और जैविक प्रतिकृतियों में सेटिंग्स के अनुरूप रहें। इसी तरह, आरएनए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों की तैयारी में उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण शामिल है और अधिकांश विक्रेताओं के पास इसे कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए उत्कृष्ट समर्थन है। इस पद्धति को इस अध्ययन में केवल ताजा ऊतक के साथ परीक्षण किया गया था; हालांकि, FANS को जमे हुए ऊतक25 के साथ भी प्रदर्शन किया गया है। इसलिए यह मानना उचित है कि इस प्रोटोकॉल को मामूली अनुकूलन के साथ जमे हुए ऊतक के साथ किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को एक विशेष डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया है, जो हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला के भीतर न्यूरॉन्स के अलावा अन्य सेल आबादी की जांच करना है। दरअसल, सबूतों की बढ़ती रेखाओं से संकेत मिलता है कि उम्र बढ़ने में एएचएन की हानि को आला 1,2,3,9 के भीतर आसपास की कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। विशेष रूप से, एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स एएचएन के प्रमुख नियामकों के रूप में उभरते हैं; हालांकि, आरएनए-अनुक्रमण के साथ मिलकर डीजी से उनके अलगाव ने मिश्रित परिणाम उत्पन्न किए हैं, जिससे इस परिकल्पना को इस तकनीकके साथ आकलन करना चुनौतीपूर्ण हो गया है। एफएसीएस सॉर्टिंग न्यून-नकारात्मक नाभिक के इस दृष्टिकोण ने उन नमूनों की तुलना में अधिक एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के अलगाव की अनुमति दी जो एफएसीएस-क्रमबद्ध नहीं थे, जो बेहतर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल पूरे जीवनकाल में सभी उम्र में लागू होता है और पुराने जानवरों के ऊतकों के साथ यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा इस अवधारणा का प्रमाण प्रदान करता है कि यह विधि उम्र बढ़ने वाले हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला की जांच करने के लिए मजबूत है। इस विधि के उपयोग का विस्तार करने और विभिन्न जैविक प्रश्नों के लिए इसे अनुकूलित करने के लिए, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि अन्य न्यूरोनल परमाणु झिल्ली एंटीजन को इन मार्करों के लिए सर्वोत्तम मान्य एंटीबॉडी के गहन अनुमापन के साथ एक साथ परीक्षण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीजी में एनएससी से न्यूरोनल भेदभाव की प्रक्रिया का अध्ययन करते समय, कुछ सेल प्रकार जैसे टाइप 2 कोशिकाएं या न्यूरोब्लास्टन्यूएन (पूरक चित्रा 3) व्यक्त करना शुरू करते हैं। इसलिए, विशेष रूप से इन सेल प्रकारों की जांच करने के लिए एक और एंटीजन की आवश्यकता होगी। इसके विपरीत, इस अध्ययन में कुछ न्यूरॉन्स की पहचान अभी भी न्यून-नकारात्मक एफएसीएस-सॉर्टिंग के बाद की गई थी, संभवतः इन आबादी में न्यूएन की कम या कोई अभिव्यक्ति नहीं होने के कारण (उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल कैजल-रेट्ज़ियस न्यूरॉन्स19)। इसके अतिरिक्त, न्यून को ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स26 की उप-आबादी में व्यक्त किया गया है, जो पक्षपाती परिणाम दे सकता है यदि ये उप-आबादी रुचि रखती थी। इस प्रकार, एफएएनएस का उपयोग शुरू करते समय एंटीजन की पसंद को सेल आबादी के समावेश या बहिष्करण से बचने के लिए सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए जो एक विशिष्ट जैविक प्रश्न के सटीक उत्तर को रोक देगा। इसके साथ सहमति में, यह भी सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक अनुक्रमण परिणाम को इस प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण की गई परिकल्पना को मान्य या अस्वीकार करने से पहले ऑर्थोगोनल परख (जैसे, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या आरएनए-स्कोप) द्वारा आगे मान्य किया जाता है। अंत में, FANS से जुड़े कदम को वांछित सेल आबादी को बाहर करने और / या शामिल करने के लिए अधिक विस्तृत सॉर्टिंग रणनीति के साथ एक से अधिक एंटीबॉडी को शामिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है।

अंततः, इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रौद्योगिकियों में अन्य प्रजातियों के साथ उपयोग किए जाने पर कुछ सीमाएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, डीजी के विशिष्ट उप-क्षेत्रों के भीतर प्रतिबंधित प्रोलिफेरेटिव और क्वीसेंट एनएससी या नए पैदा हुए न्यूरॉन्स की उपस्थिति के साथ कृन्तकों में आला को बहुत अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, लेकिन यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि अन्य प्रजातियों में हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला को कैसे चित्रित किया जाना चाहिए। दरअसल, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं गैर-मानव प्राइमेट्स और मनुष्यों में डीजी के निरंतर क्षेत्र के भीतर संरेखित नहीं होती हैं, बल्कि इसके चारों ओर बिखरी होती हैं और एमिग्डाला7 में भी मौजूद हो सकती हैं। इसलिए, अन्य प्रजातियों में डीजी की तुलना में व्यापक क्षेत्रों को विच्छेदित और अलग करना संभावित रूप से इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रभावित करेगा। विशेष रूप से, ऊतक की तैयारी के लिए पृथक्करण और ट्राइट्यूरेशन चरणों को ऊतक27,28 के बड़े टुकड़ों के साथ काम करते समय अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के संबंध में, जबकि इनब्रीड में रखे गए कृन्तकों में एक बहुत ही सजातीय और बहुत अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम होता है, मानव जीनोम की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता को विभिन्न सेल आबादी (जैसे, एनएससी और एस्ट्रोसाइट्स) को स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए सेलुलर मार्करों की अपर्याप्त संख्या के साथ संयुक्त विश्लेषण के लिए बहुत अधिक सामान्यीकरण की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं के एक छोटे समूह की पहचान होने पर अलग-अलग निष्कर्ष निकाल सकती है। 11. ऐसी स्थितियों में, सेल संवर्धन अभी भी एक पसंदीदा विकल्प हो सकता है या विश्लेषणात्मक शक्ति बढ़ाने के लिए अन्य रणनीतियों के साथ उपयोग किया जाना चाहिए।

बहरहाल, वर्तमान दृष्टिकोण एएचएन के विनियमन में संभावित रूप से महत्वपूर्ण सेल आबादी की भूमिका की जांच को सक्षम कर सकता है। यह विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स की आबादी के लिए मामला हो सकता है, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की शुरुआत और प्रगति में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इस अध्ययन से पता चला है कि एस्ट्रोसाइट्स और अन्य दुर्लभ सेल आबादी को डीजी के भीतर मौजूद न्यूरॉन्स के विशाल बहुमत को छोड़कर पहचाना और प्रोफाइल किया जा सकता है। विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करने वाले अन्य अध्ययन सेल आबादी 5,11,17 की एक ही श्रेणी से नाभिक की समान वसूली प्राप्त करने में सक्षम नहीं हैं। इसके अलावा, इस अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि इस सेल आबादीके विशिष्ट संवर्धन के बिना एनएससी क्लस्टर को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना संभव है।

अंत में, इस पद्धति का पालन करना और सुधारना एएचएन के मॉड्यूलेशन के लिए हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला की प्रासंगिक भूमिका से संबंधित उत्कृष्ट प्रश्नों को संबोधित करने के लिए एक कदम आगे होगा। विशेष रूप से, यह एएचएन9 के विनियमन से जुड़े सेल आबादी में वृद्ध और रोगग्रस्त दिमाग में जीन अभिव्यक्ति के स्तर में नई अंतर्दृष्टि ला सकता है, एनएससी1 की संभावित विषमता की पहचान का समर्थन कर सकता है या एएचएन में वाहिका की भूमिका को संबोधित कर सकता है। अंततः, इस विधि को समान प्रश्नों और मुद्दों के साथ अन्य वयस्क स्टेम सेल niches के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Disclosures

एसजी, टीएल और एसके मर्क शार्प एंड डोहम एलएलसी के कर्मचारी हैं, जो मर्क एंड कंपनी, इंक, राहवे, एनजे, यूएसए की सहायक कंपनी है, जिसे अमेरिका और कनाडा के बाहर एमएसडी के रूप में जाना जाता है। एसजी मर्क एंड कंपनी, इंक, राहवे, एनजे, यूएसए का शेयरधारक है।

Acknowledgments

लेखक तकनीकी सहायता के लिए लाचलान हैरिस और पिएरो रिगो और पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए जेसन एम उस्लानर और डिट्टे लोवेट को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को एमआरसी से अनुदान समर्थन और एमएसडी, फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट के साथ एक पूर्व-प्रतिस्पर्धी अनुसंधान सहयोग द्वारा समर्थित किया गया था, जो कैंसर रिसर्च यूके (एफसी0010089), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एफसी0010089), वेलकम ट्रस्ट (एफसी0010089) और एफजी (106187 / जेड / जेड / जेड) के लिए वेलकम ट्रस्ट इन्वेस्टिगेटर अवार्ड द्वारा अपना वित्त पोषण प्राप्त करता है। हम कई लेखकों से माफी मांगते हैं जिनके काम पर हम जगह की कमी के कारण चर्चा और हवाला नहीं दे सके।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microtube Eppendorf 30124537
10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres Polysciences 15700-10
15 mL polypropylene centrifuge tubes Corning 430052
2 pairs of sterile Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma Aldrich D9564-10MG
4150 TapeStation System Agilent N/A
5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap Falcon 352063
5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Falcon 352235
50 mL polypropylene centrifuge tubes Corning 430829
70 µm cell strainer Falcon 352350
8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles BD Biosciences RCP-30-5A
Accudrop Beads BD Biosciences N/A
Allegra X-30R Centrifuge Beckman Coulter N/A
Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated Millipore MAB377X
 BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP Beckman Coulter N/A
Chromium Controller 10x Genomics N/A
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 10x Genomics PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213
BSA 7.5% Gibco 15260037
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861
Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) KIMBLE D8938-1SET
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml Eppendorf 30108116
 Halt, 100x Protease inhibitor ThermoFisher 78429
HiSeq 4000 Sequencing System Illumina N/A Sequencing configuration: 28-8-0-91
KCl Any chemical supplier Laboratory made
LUNA-FX7 Automated Cell counter Logos Biosystems N/A
MgCl2 Any chemical supplier Laboratory made
N°10 guarded sterile disposable scalpels Swann-Morton 6601
Nuclease-free water Sigma Aldrich W4502-1L
Pair of sterile student surgical scissors Fine Science Tools 91401-12
PBS Any chemical supplier Laboratory made
RNase Inhibitor 40 U µl-1 Ambion AM2684
RNasin 40 U µl-1 Promega N211A
Sterile Petri dish Corning 430167
Sucrose Sigma Aldrich 59378-500G
Tris buffer, pH 8.0 Any chemical supplier Laboratory made
Triton X-100 10% (v/v) Sigma Aldrich T8787-250ML
Trypan blue Invitrogen T10282

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 188
हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला का अध्ययन करने के लिए एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के साथ संयुक्त न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक नकारात्मक छंटाई
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Kerloch, T., Lepko, T., Shkura, K.,… More

Kerloch, T., Lepko, T., Shkura, K., Guillemot, F., Gillotin, S. Fluorescence-Activated Nuclei Negative Sorting of Neurons Combined with Single Nuclei RNA Sequencing to Study the Hippocampal Neurogenic Niche. J. Vis. Exp. (188), e64369, doi:10.3791/64369 (2022).

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