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Methodenartikel

Zebrafisch-Tiermodell zur Untersuchung allergischer Reaktionen auf Zeckenspeichel-Biomoleküle

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DOI:

10.3791/64378

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16. September 2022

 ,  , 
1SaBio. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos IREC (CSIC-UCLM-JCCM), 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Oklahoma State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird Zebrafisch (Danio rerio) als Modell verwendet, um allergische Reaktionen und Immunreaktionen im Zusammenhang mit dem Alpha-Gal-Syndrom (AGS) zu untersuchen, indem allergische Reaktionen auf Zeckenspeichel und Säugetierfleischkonsum bewertet werden.

Zusammenfassung

Zecken sind Arthropodenvektoren, die durch die Übertragung von Krankheitserregern Krankheiten verursachen und deren Bisse mit allergischen Reaktionen zusammenhängen könnten, die sich weltweit auf die menschliche Gesundheit auswirken. Bei einigen Individuen wurden hohe Konzentrationen von Immunglobulin-E-Antikörpern gegen das Glykan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) durch Zeckenstiche induziert. Anaphylaktische Reaktionen, die durch Glykoproteine und Glykolipide vermittelt werden, die das im Zeckenspeichel vorhandene Glykan α-Gal enthalten, stehen im Zusammenhang mit dem Alpha-Gal-Syndrom (AGS) oder einer Säugetierfleischallergie. Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem weit verbreiteten Wirbeltiermodell für die Untersuchung verschiedener Pathologien entwickelt. In dieser Studie wurde Zebrafisch als Modell für die Untersuchung allergischer Reaktionen als Reaktion auf den Verzehr von α-Gal und Säugetierfleisch verwendet, da sie wie Menschen dieses Glykan nicht synthetisieren. Zu diesem Zweck wurden Verhaltensmuster und hämorrhagische anaphylaktische allergische Reaktionen als Reaktion auf den Speichel von Ixodes ricinus-Zecken und den Verzehr von Säugetierfleisch untersucht. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht die Gewinnung valider Daten, die das Zebrafisch-Tiermodell für die Untersuchung von durch Zecken übertragenen Allergien einschließlich AGS unterstützen.

Einleitung

Zecken sind Überträger von Krankheitserregern, die Krankheiten verursachen und auch allergische Reaktionen verursachen, die die Gesundheit von Mensch und Tier weltweit beeinträchtigen 1,2. Während der Zeckenfütterung erleichtern Biomoleküle im Zeckenspeichel, insbesondere Proteine und Lipide, die Fütterung dieser Ektoparasiten und vermeiden die Abwehrkräfte des Wirts3. Einige Speichel-Biomoleküle mit Glykan-Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal)-Modifikationen führen nur bei einigen Personen zur Produktion hoher Anti-α-Gal-IgE-Antikörperspiegel nach dem Zeckenstich, was als α-Gal-Syndrom (AGS) bekannt ist4. Dies ist eine Krankheit, die mit einer IgE-vermittelten Allergie verbunden ist, die zu einer Anaphylaxie gegen Zeckenstiche, zum Verzehr von Fleisch von Nicht-Primaten bei Säugetieren und einigen Medikamenten wie Cetuximab5 führen kann. Die Reaktionen auf α-Gal sind oft schwerwiegend und können manchmal tödlich sein 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Das α-Gal kommt in allen Säugetieren vor, mit Ausnahme von Altweltaffen, Menschenaffen und Menschen, die nicht in der Lage sind, α-Gal13 zu synthetisieren. Krankheitserreger wie Bakterien und Protozoen exprimieren dieses Glykan jedoch auf ihrer Oberfläche, was die Produktion hoher Mengen an Anti-α-Gal-IgM/IgG-Antikörpern induzieren kann und ein Schutzmechanismus gegen diese Erreger sein kann16,17. Die Produktion von Anti-α-Gal-Antikörpern erhöht jedoch das Risiko, IgE-vermittelte Anti-α-Gal-Allergien zu entwickeln 7,13. Natürliche Anti-α-Gal-Antikörper, die beim Menschen produziert werden, hauptsächlich der IgM/IgG-Subtypen, könnten mit dieser Modifikation in Verbindung gebracht werden, die in Bakterien aus der Darmmikrobiotavorhanden ist 16. AGS kann eine schwierige klinische Diagnose sein, da die wichtigste diagnostische Methode derzeit auf einer klinischen Vorgeschichte verzögerter allergischer Reaktionen basiert, insbesondere im Zusammenhang mit Nahrungsmittelallergien (d. h. Juckreiz, lokalisierte Nesselsucht oder rezidivierendes Angioödem mit Anaphylaxie, Urtikaria und gastrointestinalen Symptomen) und der Messung von IgE-Anti-α-Gal-Antikörperspiegeln9. Aktuelle Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zeckenstiche eines der Hauptrisiken für das Auftreten von AGS 18,19 darstellen, ein 20-facher oder größerer Anstieg des IgE-Spiegels auf α-Gal nach einem Zeckenstich 19, eine Vorgeschichte von Zeckenstichen bei Patienten mit AGS20,21,22, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf Zeckenantigene reaktiv sind, bei AGS-Patienten 19, und dass Anti-α-Gal-IgE stark mit Anti-Zecken-IgE-Spiegeln19,23 zusammenhängt, aber weitere Studien erforderlich sind, um zu beurteilen, welche Biomoleküle tatsächlich beteiligt sind.

Ein weiteres mögliches Szenario sind Patienten, die starke allergische Reaktionen auf Zeckenstiche und hohe Konzentrationen von Anti-α-Gal-IgE-Antikörpern aufweisen, aber tolerant gegenüber dem Verzehr von Säugetierfleisch sind12. Daher könnte die Fleischallergie bei Säugetieren eine bestimmte Art von Allergie im Zusammenhang mit Zeckenstichen sein. Zu den wichtigsten Zeckenarten, die mit AGS assoziiert werden, gehören Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasilien), Amblyomma testudinarium und Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australien) und Ixodes ricinus (der Hauptvektor der Lyme-Borreliose in Europa)11,24.

Das einzige Modell, das verwendet wurde, um die IgE-Produktion im Zusammenhang mit Zeckenstichen zu bewerten, ist das Mausmodell, das genetisch mit dem Gen für α−1,3-Galactosyltransferase-ausgeschaltete (α-Gal KO) Mäuse25,26 modifiziert wurde, da Mäuse wie andere Säugetiere auch α-Gal auf Proteinen und Lipiden exprimieren und kein IgE zu α-Gal produzieren. Der Zebrafisch (Danio rerio) ist jedoch ein nützliches Modell für die biomedizinische Forschung an Säugetieren, da er viele anatomische Ähnlichkeiten mit Säugetieren aufweist und wie der Mensch auch nicht in der Lage ist, α-Gal zu synthetisieren. Da α-Gal nicht auf natürliche Weise im Zebrafisch produziert wird, ist es ein erschwingliches Modell, das leicht zu manipulieren ist und eine hohe Stichprobengröße für die Untersuchung von α-Gal-bedingten allergischen Reaktionen ermöglicht.

In dieser Studie wird Zebrafisch als Modellorganismus verwendet, um lokale allergische Reaktionen, Verhaltensmuster und die molekularen Mechanismen zu charakterisieren und zu beschreiben, die mit der Reaktion auf die perkutane Sensibilisierung auf Zeckenspeichel26,27 und den anschließenden Verzehr von Säugetierfleisch verbunden sind. Zu diesem Zweck werden die Fische durch intradermale Injektion Zeckenspeichel ausgesetzt und dann mit Hundefutter gefüttert, das Säugetierfleischprodukte enthält, die für den Tiergebrauch geeignet sind und α-Gal27 enthalten, dann werden mögliche damit verbundene allergische Reaktionen bewertet. Diese Methode kann auf die Untersuchung anderer Biomoleküle angewendet werden, die mit allergischen Prozessen zusammenhängen, insbesondere solchen, die mit AGS zusammenhängen.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Kastilien-La Mancha im Rahmen der Studie "Evaluation of the immune response to inactivated M. bovis vaccine and challenge with M. marinum in the zebrafish model number PR-2017-05-12" genehmigt.

Zecken wurden aus der Laborkolonie gewonnen, wo repräsentative Proben von Zecken in der Kolonie mittels PCR auf häufige Zeckenpathogene getestet wurden, um die Abwesenheit von Krankheitserregern zu bestätigen, und am Institut für Parasitologie, Biologiezentrum der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (IP BC CAS), Tschechische Republik, aufbewahrt wurden.Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz der Tschechischen Republik Nr. 246/1992 Sb (Ethikgenehmigung Nr. 34/2018) durchgeführt.

1. Zebrafisch-Behandlung

HINWEIS: Die Studie wurde entwickelt, um allergische Reaktionen und die Immunantwort bei Zebrafischen zu bewerten, die mit Zeckenspeichel als Reaktion auf den Verzehr von Säugetierfleisch behandelt wurden.

  1. Behandeln Sie den Fisch (wie in Abschnitt 4 erläutert) mit Zeckenspeichel, handelsüblichem Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (siehe Materialtabelle), der als Positivkontrolle verwendet wird, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Negativkontrolle. Erwachsene Zebrafische werden nach dem Zufallsprinzip in drei geschlechterspezifische Gruppen eingeteilt (Abbildung 1).
    HINWEIS: Jede andere gewünschte Verbindung, die mit AGS zusammenhängt, kann mit diesem Modell bewertet werden.

2. Ixodes ricinus Zecken Speichelextraktion

  1. Verwenden Sie halb angeschwollene pathogenfreie weibliche Zecken, die 6-7 Tage lang an Meerschweinchen gefüttert wurden.
  2. Behandeln Sie die Zecke mit 5 μl einer 2%igen (Gew./vol) Lösung von Pilocarpinhydrochlorid in PBS (siehe Materialtabelle) bei einem pH-Wert von 7,4 in das Hämocoel mit einer 50-μl-Spritze mit einer 0,33-mm-Nadel, wie zuvor beschrieben28 , um die Zeckenspeichelproduktion zu induzieren.
    HINWEIS: Zecken werden mit einer Pinzette behandelt; Achten Sie darauf, beim Greifen nicht zu viel Kraft aufzuwenden.
  3. Sammeln Sie Speichel mit einer 10-μl-Spitze, die auf einer Mikropipette montiert ist.
    1. Führen Sie die Spitze vorsichtig in das Zeckenhypostom ein.
    2. Bewahren Sie den Speichel in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis auf, sammeln Sie ihn und lagern Sie ihn bei -80 °C, wie zuvor beschrieben27.
  4. Bestimmen Sie die Speichelproteinkonzentration, um die Menge an Protein zu bestimmen, die in den Fisch injiziert werden soll, wie in früheren Studien27 , unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

3. Pflege von Zebrafischen

  1. Halten Sie Zebrafische in einem Durchflusswassersystem bei 27 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h (Abbildung 2).
  2. Füttern Sie die Fische bis zum 2. Tag zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit trockenem Fischfutter (50-70 μg/Fisch).
  3. Füttern Sie die Fische zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit trockenem Hundefutter (50-70 μg/Fisch) vom Tag 2 nach der Behandlungsinjektion bis zum Ende des Versuchs

4. Zebrafisch-Injektion

  1. Wählen Sie 10 Fische pro Gruppe mit einem ähnlichen Verhältnis von Weibchen zu Männchen und ähnlichem Gewicht.
    HINWEIS: Gruppe 1 enthält Fische, denen PBS injiziert wurde, Gruppe 2 enthält Fische, denen Zeckenspeichel injiziert wurde, und Gruppe 3 enthält Fische, denen α-Gal injiziert wurde.
  2. Betäuben Sie den Fisch kurzzeitig durch Eintauchen in 0,02% Tricainmethansulfonat (MS-222) (Film 1).
    HINWEIS: Richtig betäubte Fische zeigen normale Atmung und schwimmen nicht, während sie am Boden des Wassertanks platziert oder schwimmend platziert werden können. Jeder Fisch muss einzeln betäubt werden, um mögliche physiologische Schäden zu vermeiden.
  3. Fangen Sie den betäubten Fisch mit einem Fischernetz.
  4. Legen Sie den Fisch mit einer Pinzette oder den Händen vorsichtig auf einen feuchten Schwamm, mit der Schwanzflosse auf der rechten Seite, um die Verbindungen in die gleiche Richtung zu injizieren, um die Läsionen zu kontrollieren.
  5. Injizieren Sie Gruppen von Fischen intradermal, wie in früheren Studien26, in den Muskel in einem Abstand von 5 mm zur Schwanzflosse und in einem Winkel von 45° zum Körper des Fisches (Film 2). Verwenden Sie die geeignete Behandlung an den Tagen 0, 3 und 8 wie zuvor beschrieben 27 mit einer 100-μl-Spritze, die mit einer 1 cm, 29 g-Nadel mit 1 μl (mit 9 μg/μl Protein) I. ricinus-Speichel in 10 μl PBS (Zeckenspeichel), 5 μg α-Gal in 10 μl PBS (α-Gal)27 ausgestattet ist.  und 10 μl PBS (Abbildung 3).
    HINWEIS: Die Handhabung muss schnell und sorgfältig erfolgen, um körperliche Schäden am Tier zu vermeiden.
    Andere Biomoleküle im Zeckenspeichel können nach diesem Protokoll bewertet werden.
  6. Legen Sie den behandelten Fisch zur Genesung ohne Betäubung wieder in ein Süßwasserbecken.
    HINWEIS: Alle Fische derselben Gruppe können zur Erholung in denselben Wassertank gesetzt werden.

5. Zebrafisch-Fütterung

  1. Das Hundefutter mit einem Mörser und Stößel zerdrücken.
  2. Füttern Sie 50-70 μg/Fisch zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit trockenem Fischfutter bis zum 2. Tag.
  3. Füttern Sie 50-70 μg/Fisch zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit Hundepüree von Tag 2 nach der Behandlungsinjektion bis zum Ende des Experiments am Tag 8.
    HINWEIS: Wenn Immunitätsmarker oder Antikörpertiter gegen α-Gal- oder IgE-Antikörper als Reaktion auf die Behandlungen oder das Futter während der verschiedenen Impfungen bewertet werden sollen, wäre eine Fütterung bis zum Ende des Experiments erforderlich.

6. Bewertung von allergischen Reaktionen, Läsionen und Verhalten bei Zebrafischen

  1. Untersuchen Sie die hämorrhagische Art der allergischen Reaktionen (Hautrötung, Verfärbung und Blutung) mit einer Lupe oder einem Stereomikroskop auf Genauigkeit und geben Sie den Ort ihres Auftretens auf dem Fisch gemäß der in Tabelle 1 enthaltenen Kategorisierung an (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Die in Abbildung 4 dargestellten allergischen Reaktionen traten nach der Injektion von Zeckenspeichel und dem Verzehr von Futtermitteln mit rotem Fleisch auf. Daher handelt es sich bei den beschriebenen Reaktionen um die Art von Reaktionen, die mit AGS assoziiert sind, da ähnliche Reaktionen im klinischen Kontext auftreten.
    1. Beobachten Sie, ob nach den Behandlungen und bei der Verabreichung von Futter zweimal täglich eine Reaktion auftritt, während sich die Fische im Wassertank befinden.
  2. Untersuchen Sie das Verhalten der Fische, indem Sie die Veränderungen27 in den Schwimmmustern (Mobilität, Geschwindigkeit, bewegungsloses Stehen am Boden des Wassertanks und Zickzackschwimmen) gemäß der in Tabelle 1 enthaltenen Kategorisierung bewerten.
  3. Bewerten Sie die kumulierte Mortalität und geben Sie die Anzahl der toten Fische einschließlich der Uhrzeit/des Todestages an (Abbildung 4B).
    HINWEIS: Alle Parameter werden direkt nach der Behandlung oder nach dem Futterwechsel ausgewertet und täglich bis zum Ende des Experiments am Tag 8 beobachtet, wobei die qualitativen Variablen kategorisiert werden (Tabelle 1). Als Empfehlung sollte diese Bewertung von einem Fachmann mit Kenntnissen über Zebrafische durchgeführt werden, um Verhaltensänderungen auf der Grundlage seines Hintergrunds und seiner Erfahrung in der Arbeit mit diesem Tiermodell zu berücksichtigen.
  4. Berechnen Sie die Anzahl der Zebrafische pro Tag mit gemeldeten allergischen Reaktionen, abnormalem Verhalten und Fütterungsänderungen in jeder Gruppe und vergleichen Sie die Gruppen durch einen Einweg-ANOVA-Test.

7. Probenentnahme

  1. Euthanasieren Sie den Fisch durch Eintauchen in 0,04% MS-222 am Tag 8.
    HINWEIS: Sammeln Sie auch die Proben von Fischen, die während des Versuchs an allergischen Reaktionen sterben.
  2. Befestigen Sie den Fisch mit Stiften auf einer Paraffinplatte.
  3. Sammeln Sie das Serum aus den Kiemenblutgefäßen 29 der Fische unmittelbar nach der Euthanasie, wenn die Kiemen noch mit Blut gespült sind, mit einer 0,5-ml-Spritze, die mit einer 1 cm,29 g Nadel ausgestattet ist. Lagern Sie es bis zur Verwendung in einem 1,5-ml-Röhrchen bei -20 °C (Film 3).
  4. Schneiden Sie den Fisch sagittal mit einer Skalpellklinge und beurteilen Sie die inneren Läsionen (hämorrhagische Läsionen oder Granulome)27,30, wenn sie auftreten.
    HINWEIS: Läsionen treten nicht unbedingt auf, müssen aber registriert werden, wenn dies der Fall ist.
  5. Sammeln Sie den Darm (Film 4) und die Niere (Film 5) von jedem Fisch in separaten leeren 1,5-ml-Röhrchen, wie zuvor beschrieben31, und lagern Sie sie bei -80 ° C (Abbildung 4C).
  6. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den Darm- und Nierenproben des Zebrafisches mit einem RNA-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle).
  7. Analysieren Sie die Expression von Genen, die mit der Immunantwort zusammenhängen, wie zuvor beschrieben30,32 (siehe Tabelle 2 für Primersequenzen) im Zebrafisch, indem Sie eine quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung einer reversen Transkriptionsmischung für RT-qPCR (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Normalisieren Sie die mRNA-cT-Werte gegen D. rerio GAPDH und vergleichen Sie zwischen den Gruppen (mit Speichel behandelte Fische, α-Gal und die PBS-behandelten Gruppen) unter Verwendung eines Student-t-Tests mit ungleicher Varianz.
  8. Bestimmen Sie IgM-Antikörpertiter, die α-Gal im Zebrafisch in Serumproben erkennen, mittels ELISA, wie zuvor beschrieben 27,30. Zeichnen Sie die Antikörpertiter mit einem Plattenleser als O.D.450 nm-Werte auf und vergleichen Sie zwischen den Gruppen (mit Speichel behandelte Fische, α-Gal und die PBS-behandelten Gruppen) unter Verwendung eines Student-t-Tests mit ungleicher Varianz.
    HINWEIS: Die Bestimmung von IgM-Antikörpertitern und die Analyse von Expressionsgenen ist optional und wird nur durchgeführt, wenn immunologische Informationen erforderlich sind. Der RT-qPCR-Mix ist ein Erststrang-cDNA-Synthesekit für die Genexpressionsanalyse mittels real-time qPCR.

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Ergebnisse

Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf mehreren Aspekten zuvor veröffentlichter Experimente27,30 und Ergebnissen, die in unserem Labor durchgeführt wurden, wo das Zebrafischmodell für die Untersuchung von AGS und der Immunantwort auf α-Gal etabliert und validiert wird, da sowohl Menschen als auch Zebrafische dieses Molekül nicht synthetisieren13. Dieses Modell ermöglicht die Charakterisierung und Bewertung einer Vielzahl von allergisc...

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Diskussion

Zebrafisch ist ein kostengünstiges und einfach zu handhabendes Modell, das sich auch als sehr praktikables Werkzeug für die Untersuchung molekularer Mechanismen der Immunantwort, von Erregerkrankheiten, neuartigen Arzneimitteltests sowie von Impfungen und Impfungen und zum Schutz vor Infektionen erwiesenhat 33,34,35. Die Studie über das Verhalten von Zebrafischen ist nützlich, da frühere Studien ergeben haben, dass einige Fischa...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei den Mitgliedern der SaBio-Gruppe für die Zusammenarbeit bei der Versuchsplanung und der technischen Unterstützung bei der Fischversuchsanlage und bei Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spanien) für die Bereitstellung von Zebrafischen. Diese Arbeit wurde vom Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spanien und EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00) unterstützt. Marinela Contreras wird gefördert durch das Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien, Stipendium IJC2020-042710-I.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-ml-RöhrchenVWR525-0990
All Prep DNA/RNAQiagen80284
Aquatics
facilities BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23225
SeziersetVWR631-1279
Hundefutter - Rot ClassicAcana
ELISA Platten-96 WellThermo Fisher Scientific10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) DextraNGP0203
iScript Reverse Transkription SupermixSupermix 1708840
MikroliterspritzenHamilton7638-01
Plattenleserbeliebig
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigmaP4417-50TAB
Pilocarpinhydrochlorid SigmaP6503
Pipettenspitze P10 VWR613-0364
Pipettenspitze P1000VWR613-0359
Premiumfutter TropenfischDAPC
Schwamm Tierhalter  Hergestellt aus Schaumstoffschrott
Stereomikroskopbeliebiger
Thermocycler, Real-Time PCRbeliebiges
Tricain, Methansulfonat (MS-222)SigmaE10521
, , ,

Referenzen

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