Methodenartikel

Eine modifizierte Technik zur transversalen Aortenverengung bei Mäusen

DOI:

10.3791/64386

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18. August 2022

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1Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Hubei Key Laboratory of Genetics and Molecular Mechanism of Cardiological Disorders, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine modifizierte und vereinfachte Technik mit einem minimal-invasiven Verfahren der transversalen Aortenverengung (TAC) unter Verwendung eines selbst hergestellten Retraktors. Dieses Verfahren kann ohne Beatmungsgerät oder Mikroskop durchgeführt werden und führt zu einer Drucküberlastung, die schließlich zu Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz führt.

Zusammenfassung

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Die transversale Aortenverengung (TAC) ist eine häufig verwendete Operation in der Forschung zu Herzinsuffizienz und Herzhypertrophie, die auf der Bildung einer Drucküberlastung in Mausmodellen basiert. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren besteht darin, den quer verlaufenden Aortenbogen klar sichtbar zu machen und das Zielgefäß präzise zu binden. Klassische Ansätze führen eine partielle Thorakotomie durch, um den transversalen Aortenbogen freizulegen. Es handelt sich jedoch um ein Modell mit offenem Brustkorb, das ein ziemlich großes chirurgisches Trauma verursacht und während der Operation ein Beatmungsgerät erfordert. Um unnötige Traumata zu vermeiden und den Operationsablauf zu vereinfachen, wird der Aortenbogen über den proximalen Anteil des Brustbeins angefahren, wobei das Zielgefäß mit einem kleinen selbstgebauten Retraktor, der eine Schlinge enthält, erreicht und gebunden wird. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden, ohne in die Pleurahöhle einzudringen, und erfordert kein Beatmungsgerät oder eine mikrochirurgische Operation, wodurch die Mäuse physiologische Atemmuster erhalten, das Verfahren vereinfacht und die Operationszeit erheblich verkürzt wird. Aufgrund des weniger invasiven Ansatzes und der kürzeren Operationszeit können Mäuse weniger Stressreaktionen durchlaufen und sich schnell erholen.

Einleitung

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Herzinsuffizienz ist ein komplexes klinisches Symptom, das auf eine Beeinträchtigung der Struktur und Funktion der ventrikulären Füllung oder des Ausstoßes von Blut zurückzuführenist 1. Das Krankheitsstadium wird hauptsächlich über die Funktionsklassifikation der New York Heart Association definiert, die auf der Schwere der Symptome und der körperlichen Aktivitätbasiert 2. Bei Patienten mit einer Ejektionsfraktion von über 50 % erhöhten strukturelle und/oder funktionelle Anomalien natriuretische Peptide, um die Diagnose einer Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) zu unterstützen2. Die ischämische Herzkrankheit ist eine der Hauptursachen für Herzinsuffizienz. Daher wird das Myokardinfarktmodell (z. B. permanente Koronarligatur) häufig verwendet, um die Pathophysiologie nach kardialer Hypoperfusion oder Ischämie-Reperfusionsverletzung zu untersuchen 3,4. Neben einer akuten Myokardverletzung tragen auch andere Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Diabetes, Fettleibigkeit und eine familiäre Vorgeschichte von Kardiomyopathie zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz bei. Nachdem die Patienten das Stadium A (Risiko für Herzinsuffizienz) bestanden und in das Stadium B (Präherzilosizienz) eingetreten sind, tritt eine strukturelle Veränderungauf 1. Zum Beispiel durchlaufen hypertensive Patienten zuerst eine adaptive Hypertrophie des linken Ventrikels und entwickeln sich dann allmählich zu einer maladaptiven Herzhypertrophie und gehen durch pathologischen Umbau zu Herzinsuffizienzüber 5.

Als Endstadium verschiedener Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird die chronische Herzinsuffizienz seit Jahrzehnten untersucht6. Mehrere Mausmodelle sind in der Herzinsuffizienzforschung weit verbreitet, einschließlich der Infusion von Medikamenten (Angiotensin II), Stoffwechselstörungen (Diabetes oder kalorienreiche Ernährung) und der Aortenverengung7. Bei diesen Modellen wird die Angiotensin-II-Perfusion von verschiedenen Organnebenwirkungen begleitet, wie z. B. Nieren7. Die Induktion von Stoffwechselstörungen erfordert in der Regel einen ziemlich langen Zeitraum. Es wurde angenommen, dass die aufsteigende Aortenverengung nur eine begrenzte Relevanz für menschliche Erkrankungen hat7.

TAC ist ein zuverlässiges Modell, das die Nachlast erhöht und Herzhypertrophie sowie Herzinsuffizienzinduziert 8. Das TAC-Modell mit offenem Brustkorb wurde erstmals von Rockman et al. beschrieben und in zahlreichen Laboratorien auf der ganzen Welt verwendet9. Dieses klassische TAC-Verfahren verursacht jedoch ein ziemlich großes Trauma bei Mäusen und verändert ihr normales Verhalten, was eine lange Genesungszeit in Anspruch nehmen und die weitere Behandlung stören kann10. Andere modifizierte TAC-Verfahren mit geschlossenem Brustkorb reduzierten zwar einige invasive Schritte, erforderten jedoch mikrochirurgische Fähigkeiten oder mechanische Beatmung10,11.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode mit einem minimalinvasiven Zugang zum Aortenbogen unter Verwendung eines selbst hergestellten Retraktors über einen 3 mm Mittellinienschnitt der Oberkante des Brustbeins. Dieses Modell benötigt keine mikrochirurgischen Fähigkeiten, keine mechanische Beatmung oder das Durchtrennen der Rippen und bietet somit eine schnelle, chirurgische, traumabegrenzte, unkomplizierte und kostengünstige Möglichkeit, eine TAC-Operation durchzuführen.

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Protokoll

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Das aktuelle Protokoll wurde von der Ethikkommission des Tongji-Krankenhauses, des Tongji Medical College, der Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China, genehmigt. Dieses Verfahren wird an männlichen erwachsenen C57/BL6-Mäusen (>10 Wochen alt) durchgeführt. Alle chirurgischen Instrumente wurden vor der Operation durch Autoklavieren sterilisiert.

1. Vorbereitung des chirurgischen Instruments

  1. Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze vor und kneifen Sie die Spitze der Nadel mit einem Nadelhalter ab, um sie abzustumpfen.
  2. Bereiten Sie eine 27-G-Nadel vor und stumpfen Sie sie mit einem Nadelhalter ab. Das Schneiden der Nadelspitze mit einer Augenschere ist eine alternative Möglichkeit, die Nadel abzustumpfen.
  3. Biegen Sie die Spitze der 27 G Nadel um 90°.
    HINWEIS: Diese Nadel wird als Abstandshalter verwendet, um sie mit der Aorta zur Gefäßverengung zu verbinden.
  4. Verwenden Sie einen kommerziell erhältlichen Eisendraht (medizinische Qualität, 0,5 mm Durchmesser, siehe Materialtabelle) und wickeln Sie ihn um die Nadel (Abbildung 1A). Bilden Sie eine kleine Schlinge oder Schlaufe an der abgestumpften Spitze der Nadel (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Dieses wiederverwendbare Instrument fungiert als spezieller selbstgebauter Retraktor und ermöglicht es, in den letzten Schritten Seidennähte unter der Aorta zu führen.
  5. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation (einschließlich des oben genannten speziellen Retraktors), um sie zu sterilisieren.

2. Tierische Vorbereitung

  1. Anästhesieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natriumlösung (50 mg/kg, siehe Materialtabelle) entsprechend dem Körpergewicht. 100 μl 0,5% Lidocain werden subkutan lokal in den Operationsbereich injiziert.
  2. Vergewissern Sie sich, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie den Zeh der Maus mit der Spitze der Pinzette einklemmen.
  3. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
  4. Entfernen Sie die Haare aus dem Hals und der oberen Brust mit einer Enthaarungscreme oder einer Haarschneidemaschine.
  5. Desinfizieren Sie den unbehaarten Bereich mit drei abwechselnden Peelings aus Jod und 70% Ethanol in konzentrischen Kreisen, die sich nach außen bewegen.
  6. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen Tuch bedeckt ist, wobei der Kopf auf den Bediener zeigt. Fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband und Schneidezähnen mit einer 4-0-Naht (Abbildung 2A).
  7. Führen Sie eine rektale Sonde ein (siehe Materialtabelle), um die Körpertemperatur während der Operation zu überwachen. Halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Vorgangs bei 37 °C.
  8. Ziehen Sie ein Paar sterile Handschuhe an.
    HINWEIS: Berühren Sie nach dem Anlegen der sterilen Handschuhe keine anderen nicht sterilisierten Bereiche oder Gegenstände.
  9. Schneiden Sie mit einer sterilisierten Augenschere ein Loch (1-1,5 cm Durchmesser) in ein neues steriles Einwegtuch. Legen Sie das sterile Tuch über die Maus und stellen Sie sicher, dass das unbehaarte Operationsfeld durch das Loch sichtbar ist.
    HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es dem Bediener, das Berühren anderer nicht sterilisierter Bereiche zu vermeiden, was zur Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der Operation beiträgt.

3. Verengung der Queraorta

  1. Machen Sie einen 1,5 cm langen vertikalen Hautschnitt in Höhe der suprasternalen Kerbe (Abbildung 2B) mit Skalpellklinge. Erweitern Sie den Hautschnitt bis auf die Höhe des Brustbeinwinkels.
    HINWEIS: Die suprasternale Kerbe ist eine Kerbe, die sich am oberen Rand des Manubrium sterni befindet. Es handelt sich um ein Oberflächensymbol, das beim Entfernen von Maushaaren erkannt werden kann (Abbildung 2B). Der Sternumwinkel ist das Gelenk zwischen manubrium sterni und corpora sterni. Wenn das Brustbein freigelegt ist, zeigt es sich als horizontale weiße Linie auf dem Brustbein auf der gleichen Höhe der Costa Secunda (Abbildung 2C).
  2. Trennen Sie vorsichtig die Haut und die oberflächlichen Faszien und legen Sie die Luftröhre und das proximale Brustbein frei. Machen Sie vorsichtig einen 3-4 mm langen Mittellinienschnitt zum Brustbein, beginnend von der Oberkante bis zum Brustbeinwinkel (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Der Schnitt darf den Brustbeinwinkel nicht überschreiten, da die Gefahr besteht, dass bei der Maus ein akuter Pneumothorax entsteht.
  3. Heben Sie das Brustbein vorsichtig mit einer Pinzette und den darunter liegenden Thymus und Arcus aortae an. Verwenden Sie vorsichtig eine gerade Pinzette und präzieren Sie das Zielgefäß und das Gewebe um es herum unverblümt.
  4. Halten Sie den zuvor selbst hergestellten Retraktor (Schritt 1.4) fest, der eine Drahtschlinge am Ende der rechten Hand des Benutzers enthielt.
  5. Führen Sie die Schlinge des selbstgebauten Retraktors vorsichtig unter die Aorta zwischen der linken Arteria carotis communis und dem Ursprung der rechten Arteria innominate (Abbildung 2E).
  6. Führen Sie den selbstgebauten Retraktor in die linke Hand, um die rechte Hand für andere Instrumente zu schonen.
  7. Führen Sie mit einer mikroskopisch kleinen Pinzette in der rechten Hand eine 7-0-Seidennaht durch die Schlaufe der Schlinge am Ende und ziehen Sie den Retraktor heraus. Dies ermöglicht es, die Seidennaht für die weitere Ligatur um die Arterie herum zu belassen (Abbildung 2F).
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig und ziehen Sie den Aortenbogen nicht zu sehr aus seiner ursprünglichen Position.
  8. Platzieren Sie eine 27-G-Nadel parallel zur Aorta und binden Sie die Naht um die Nadel und die Aorta (Abbildung 2G, H).
    HINWEIS: Das Scheinverfahren sollte das gleiche sein, außer dass es keine Aortenligatur gibt.
  9. Halten Sie die 27-G-Nadel mit einer Augenzange und einer weiteren Pinzette fest, die den Knoten hält, der an der 27-G-Nadel und der Aorta befestigt ist. Ziehen Sie die 27-G-Nadel schnell, aber vorsichtig aus der Ligatur heraus (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Der Knoten darf nicht zu fest sein, sonst ist es nicht einfach, die Nadel herauszuziehen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Nadel herausziehen, wenn die Aorta reißt.
  10. Vernähen Sie die Haut mit synthetischem 4-0-Monofilament-Naht in einem unterbrochenen Nahtmuster (Abbildung 2I).

4. Nachsorge

  1. Legen Sie die Maus auf ein warmes Pad (siehe Materialtabelle) und warten Sie, bis sie wiederbelebt wird. Im Allgemeinen belebt sich die Maus in etwa 60 Minuten.
    HINWEIS: Das Tier darf nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis es das Bewusstsein für das Hauptliegegebiet wiedererlangt hat.
  2. Injizieren Sie subkutan 0,5 ml warme Kochsalzlösung und überwachen Sie die Flüssigkeitshomöostase der Tiere.
    HINWEIS: Dieser Schritt verhindert die Dehydration und den hypovolämischen Kreislaufstatus der Tiere.
  3. Tragen Sie 3 Tage lang täglich Erythromycinsalbe auf die Wundoberfläche auf.
  4. Zur postoperativen Schmerzbehandlung 1 mg/l Buprenorphin-Lokalanästhetikum parenteral an die Inzisionsstelle verabreichen (siehe Materialtabelle).
  5. Überwachen Sie die Maus postoperativ auf Anzeichen einer Infektion und Beeinträchtigung (Unterernährung, gebeugte Haltung und gekräuseltes Fell).
    HINWEIS: Tiere, die operiert wurden, werden erst dann in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn sie vollständig genesen sind.

5. Ultraschall-Bildgebung

  1. Bestätigung der erfolgreichen Ligatur der Queraorta durch Berechnung der Blutflussgeschwindigkeit über ein Ultraschall-Bildgebungssystem12,13 (24 MHz, siehe Materialtabelle) 28 Tage nach der Operation.
    1. Betäuben Sie das Tier mit 4,5% Isofluran in 20% sauerstoffangereicherter Luft und halten Sie es mit 0,5% Isofluran in 20% sauerstoffangereicherter Luft.
    2. Legen Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie ihre Extremitäten mit Klebeband an der Elektrode.
    3. Entfernen Sie mit einer Enthaarungscreme die Brusthaare und tragen Sie ein Ultraschall-Haftvermittler auf die Brust auf.
    4. Kippen Sie die Plattform so weit wie möglich nach links. Während Sie die Sonde in der vertikalen Position halten, senken Sie sie allmählich entlang der rechten parasternalen Linie auf der Brust ab, wobei die Kerbe auf das Kinn des Tieres zeigt.
    5. Stellen Sie im B-Modus des Instruments die X- und Y-Achse ein, bis der Aortenbogen und die Einschnürungsstelle deutlich sichtbar sind.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pulswellen-Doppler , um in den Pulswellenmodus zu wechseln.
    7. Stellen Sie das gestrichelte Cursor-Probenvolumenfeld distal auf die verengte Stelle ein und suchen Sie den stenotischen Strahl mit der höchsten Geschwindigkeit.
    8. Klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Pulswellen-Doppler , um die Wellenform des Aortenflusses zu erhalten und die Spitzengeschwindigkeit zu messen. Berechnen Sie die Blutflussgeschwindigkeit entsprechend dem Peak der Wellenmuster (Abbildung 3A, B).
    9. Schalten Sie den Imager in den B-Modus. Legen Sie die Plattform in horizontaler Position ab. Drehen Sie die Sonde um 30° nach links parasternaler Linie.
    10. Passen Sie die X- und Y-Achse an, um eine kurze Achsenansicht zu erhalten. Drücken Sie den M-Modus, um die Indikatorlinie anzuzeigen, und klicken Sie auf Cine Store, um das Bild für die spätere Messung der Herzwanddicke, der Kammerabmessungen und der Ejektionsfraktion zu speichern.
      HINWEIS: Die Formel zur Berechnung der Ejektionsfraktion: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). Die Formel zur Berechnung des Herzzeitvolumens: Schlagvolumen * Herzfrequenz (beim ersten gezeichneten Bild) / 1000. Die meisten Indizes wie Ejektionsfraktion und Herzzeitvolumen können automatisch über die Software des Ultraschall-Bildgebungssystems gemessen werden. LV Vol;d: diastolisches Volumen des linken Ventrikels. LV Vol;s: systolisches Volumen des linken Ventrikels.

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Ergebnisse

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Nach erfolgreicher TAC-Operation wurde eine Drucküberlastung mit einem Ultraschall-Bildgebungssystem festgestellt. Vier Wochen nach der Operation entwickeln Mäuse eine verminderte Herzfunktion. In der vorliegenden Studie wurde die Wirksamkeit der TAC-Chirurgie über die Ejektionsfraktion (EF), die fraktionierte Verkürzung (FS), die linksventrikuläre Masse (LV-Masse) und den linksventrikulären Innendurchmesser (LVID) von Mäusen validiert, die sich nach 4 Wochen einer TAC-Operation unterzogen hatten. EF war bei TAC...

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Diskussion

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Die Induktion einer anhaltenden Drucküberlastung kann allmählich zu Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz führen. Dieses Modell wurde in zahlreichen Labors auf der ganzen Welt verwendet14,15,16. Das Protokoll bot eine verbesserte TAC-Methode, die keine mikrochirurgischen Fähigkeiten oder mechanische Beatmung erfordert.

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist das Führen von Seidennähten unter de...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklärten, dass es keine Interessenkonflikte gebe.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (NSFC 81822002) finanziert. Wir danken allen Mitgliedern, die an dieser Arbeit teilgenommen haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-0 nicht resorbierbares NahtmaterialJinhuanHM403Wird zum Nähen der Haut
verwendet 5 mL SpritzeHaifuda Technology Co., Ltd.BD-309628Wird zur Herstellung von Schlingen mit Retraktor
7-0 nicht resorbierbarem Nahtverwendet JinhuanHM701Wird für die Aortenligatur
verwendet TiertemperaturmonitorKaerwenFT3400Wird zur Überwachung der Körpertemperatur
verwendet Buprenorphin SigmaB-044Zur postoperativen Schmerzbehandlung
Enthaarungscreme VeetN/AWird zur Entfernung von Körperhaaren aus dem Operationsbereich verwendet
HeizkissenXiaochuangxinN/A Wirdzur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur
verwendet IbuprofenMCEHY-78131Wird zur postoperativen Schmerzbehandlung
verwendet Eisendraht (0,5 mm)Qing YuanEisendraht #26Wird zur Herstellung von Schlingen mit Retraktor
Mikroskopische PinzetteRWDF12006-10Wird zum Eindringen und Trennen des Gewebes verwendet, um den Operationsraum zu öffnen
NadelhalterRWDF12005-10Wird verwendet, um die Spitze der Gauge-Nadel abzuklemmen und abzustumpfen
Ophthalmische PinzetteRWDF14012-10 Wird zum Halten von Haut und anderen Geweben verwendet
Ophthalmische SchereRWDS11001-08Wird für den Schnitt von Mäusen
Pentobarbital-NatriumSigmaP3761Wird für die Mausanästhesie
verwendet Sterile OperationsmatteHale & herzhaftes211002Wird für die Platzierung von Tieren während der Operation
verwendet Ultraschall-BildgebungssystemFujifilm visualsonicsvevo1100Wird zur Messung der Blutflussgeschwindigkeit, der linksventrikulären Wanddicke und der Ejektionsfraktion verwendet, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100
verwendet verwendet

Referenzen

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