Hier wird ein chirurgisches Verfahren zur permanenten Ligatur der linken Koronararterie bei Mäusen vorgestellt. Mit diesem Modell kann die Pathophysiologie und die damit verbundene Entzündungsreaktion nach Myokardinfarkt untersucht werden.
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Methodenartikel
Linke Koronararterienligatur: Ein chirurgisches Mausmodell des Myokardinfarkts
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ischämische Herzkrankheit und anschließender Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten und auf der ganzen Welt. Um die pathophysiologischen Veränderungen nach einem Myokardinfarkt zu erforschen und zukünftige Behandlungen zu entwickeln, sind Forschungsmodelle von MI erforderlich. Die permanente Ligatur der linken Koronararterie (LCA) bei Mäusen ist ein beliebtes Modell zur Untersuchung der Herzfunktion und des ventrikulären Umbaus nach MI. Hier beschreiben wir ein weniger invasives, zuverlässiges und reproduzierbares chirurgisches Maus-MI-Modell durch permanente Ligatur der LCA. Unser chirurgisches Modell besteht aus einer leicht reversiblen Vollnarkose, einer endotrachealen Intubation, die keine Tracheotomie erfordert, und einer Thorakotomie. Elektrokardiographie und Troponinmessung sollten durchgeführt werden, um MI sicherzustellen. Echokardiographie am Tag 28 nach MI erkennt Herzfunktion und Herzinsuffizienzparameter. Der Grad der Herzfibrose kann durch Massons Trichromfärbung und Herz-MRT beurteilt werden. Dieses MI-Modell ist nützlich für die Untersuchung der pathophysiologischen und immunologischen Veränderungen nach MI.
Einleitung
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit, das jedes Jahr 17,9 Millionen Menschenleben fordert, was 31 Prozent der weltweiten Sterblichkeit ausmacht1. Die häufigste Form der kardiovaskulären Anomalie ist die koronare Herzkrankheit, und der Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptmanifestationen der koronaren Herzkrankheit2. MI wird in der Regel durch einen thrombotischen Verschluss einer Koronararterie aufgrund des Bruchs einer anfälligen Plaqueverursacht 3. Die daraus resultierende Ischämie verursacht tiefgreifende ionische und metabolische Veränderungen im betroffenen Myokard sowie eine rasche Abnahme der systolischen Funktion. MI führt zum Absterben von Kardiomyozyten, was zu ventrikulärer Dysfunktion und Herzinsuffizienz führen kann4.
Die Erforschung von MI bei Patienten ist aufgrund der Knappheit von Geweben, die von Patienten mit MI5 gewonnen werden, begrenzt. Daher sind murine Modelle von MI sowohl für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen als auch für die Entwicklung potenzieller therapeutischer Ziele nützlich. Zu den derzeit verfügbaren Mausmodellen für MI gehören irreversible Ischämiemodelle (LCA und Ablationsmethoden) und Reperfusionsmodelle (Ischämie/Reperfusion, I/R)6. Die permanente Ligatur der linken Koronararterie (LCA) bei Mäusen ist die am häufigsten verwendete Methode und imitiert die Pathophysiologie und Immunologie von MI bei Patienten 7,8,9. Permanenter MI kann auch durch Ablationsmethoden induziert werden, die elektrische Schäden oder Kryoverletzungen beinhalten. Ablationsverfahren sind in der Lage, einen Infarkt einheitlicher Größe an der genauen Stelle10 zu erzeugen. Andererseits können Narbenbildung, Infarktmorphologie und molekulare Signalmechanismen zwischen den Ablationsmethoden variieren10,11. Die murine I/R-Methode ist ein weiteres wichtiges MI-Modell, da sie das klinische Szenario der Reperfusionstherapiedarstellt 12. Das I/R-Modell ist mit Herausforderungen wie einer variablen Infarktgröße, Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von Reaktionen auf die Erstverletzung und Reperfusion6 verbunden.
Obwohl LCA-Ligaturmethoden weit verbreitet sind, sind sie mit niedrigen Überlebensraten und postoperativen Schmerzen verbunden13. Dieses Protokoll demonstriert das murine chirurgische MI-Modell der LCA-Ligatur, das die Vorbereitung und Intubation von Mäusen, die LCA-Ligatur, die postoperative Versorgung und die Validierung von MI umfasst. Anstatt eine invasive Tracheotomie14 zu verwenden, verwendet diese Methode eine endotracheale Intubation. Das Tier wird intubiert, indem der Oropharynx mit einem Laryngoskop beleuchtet wird, was den Eingriff einfacher, sicherer und weniger traumatisch macht15. Die Maus wird während des gesamten Eingriffs beatmet und unter Isofluran-Anästhesie gehalten. Darüber hinaus werden die Echokardiographie und die Masson-Trichrom-Färbung durchgeführt, um die Herzfunktion bzw. die Herzfibrose nach MI zu bewerten. Insgesamt bietet diese Methode ein zuverlässiges und reproduzierbares chirurgisches Mausmodell von MI, das zur Untersuchung der Pathophysiologie und Entzündung nach MI verwendet werden kann.
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Protokoll
Das vorliegende Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh geprüft und genehmigt. Für diese Experimente wurden acht (schein n = 4 und MI n = 4) 1-jährige weibliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 24-30 g verwendet. Ungefähr 100% und mindestens 80% der Mäuse überlebten in den ersten 24 Stunden bzw. 28 Tagen.
1. Vorbereitung und endotracheale Intubation der Mäuse
- Einen Perlensterilisator (siehe Materialtabelle) auf 250 °C vorheizen und autoklavierte chirurgische Instrumente für einige Minuten hineinlegen.
- Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff für 5 min.
- Stellen Sie die Anästhesietiefe in der Maus sicher, indem Sie die Reaktion auf ein festes Zeheneinklemmen überprüfen.
- Wiegen Sie die Maus, um die Dosierung des präoperativen Analgetikums Buprenorphin (0,1 mg/kg) abzuschätzen. Injizieren Sie das Medikament intraperitonial.
- Schneiden Sie das Fell auf der linken Seite des Brustkorbs mit einem Elektrorasierer ab.
- Desinfizieren Sie die Operationsstelle danach dreimal mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein geneigtes Brett. Befestigen Sie den Kopf und die Gliedmaßen der Maus mit einem Gummiband, das an den oberen Schneidezähnen bzw. dem Klebeband befestigt ist. Tragen Sie steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
- Öffnen Sie den Kiefer und ziehen Sie die Zunge vorsichtig aus der Mundhöhle.
- Identifizieren Sie die Öffnung des Kehlkopfes, indem Sie den Oropharynx mit einem Laryngoskop beleuchten (siehe Materialtabelle).
- Schneiden Sie ca. 0,5 cm von einer 24 G Katheternadel ab und führen Sie die stumpfe Nadel in den Kunststoffschild ein. Richten Sie die stumpfe Nadel mit dem Kunststoffschild in die Luftröhre. Nehmen Sie die Nadel heraus und lassen Sie den Kunststoffschild in der Luftröhre.
- Stellen Sie das Beatmungsgerät (siehe Materialtabelle) auf eine Atemfrequenz von 137 Schlägen pro Minute (optimiert für die in dieser Studie verwendeten Mäuse) und ein Atemzugvolumen von 0,18 cm³ ein. Verbinden Sie die Beatmungsschläuche mit dem Katheterschild und bestätigen Sie die korrekte Intubation, indem Sie nach einer synchronisierten Brustbewegung mit dem Beatmungsgerät suchen.
- Trennen Sie den Beatmungsschlauch vom Katheterschild und legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein vorgewärmtes, temperaturgesteuertes Operationsbrett. Schließen Sie die Maus wieder an das Beatmungsgerät an.
2. Permanente Ligatur der linken Koronararterie
- Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod und 70% Alkohol. Tragen Sie ein steriles Tuch mit einem viertelgroßen Loch in der Mitte auf, um die Operationsstelle zu sichern. Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen (1,5-2 cm) kutanen Querschnitt entlang der Linie zwischen dem linken Brustmuskel major und dem kleinen Muskel.
HINWEIS: Für den Einschnitt wurde eine Schere verwendet, da sie die erforderliche Kontrolle über die Tiefe und Richtung des Schnitts bietet. - Trennen Sie die darunter liegenden Brustmuskeln mit einer Pinzette und einer Sezierschere. Die Muskeln wurden mit Hilfe von Retraktoren, die an Gummibändern befestigt waren, getrennt.
- Machen Sie einen Einschnitt in den dritten Interkostalraum mit einer Mikroschere, die dem natürlichen Winkel des Brustkorbs folgt. In dieser Phase ist äußerste Vorsicht geboten, um Verletzungen von Herz und Lunge zu vermeiden.
- Dehnen Sie die Rippen vorsichtig mit Retraktoren auseinander, um den linken Ventrikel freizulegen. Bewegen Sie das Perikardfett beiseite und lokalisieren Sie die Ökobilanz, die vom Rand des linken Vorhofs zur Herzspitze verläuft.
- Pass ein 8-0 Nylonnaht unter der Ökobilanz mit Hilfe eines Nadelhalters. Ligate die LCA mit einem Doppelknoten, gefolgt von einem zweiten Knoten (ein modifizierter Chirurgenknoten).
HINWEIS: Das Blanchieren des unteren linken Ventrikels bestätigt eine erfolgreiche LCA-Ligatur. Darüber hinaus werden Troponinmessungen, EKG-Überwachung (ST-Hebung), Echo-/In-vivo-Herz-gesteuerte MRT oder Mikro-CT-Bilder empfohlen, um die vergleichbaren MI-Läsionen zu bestätigen. - Entfernen Sie die Retraktoren und führen Sie eine 22-G-Katheternadel in die Brusthöhle ein. Entfernen Sie die Nadel und lassen Sie die Spitze des Kunststoffschildes in der Brusthöhle. Schließen Sie den Brustkorb mit einer 4-0-Nylonnaht.
- Schließen Sie eine Spritze an die 22-G-Kunststoffabschirmung an und entfernen Sie langsam überschüssige Luft, die in der Brusthöhle eingeschlossen ist, indem Sie vorsichtig auf die Brust drücken, um einen negativen Luftdruck herzustellen. Entfernen Sie das Plastikschild.
- Verschließen Sie die Haut mit einer 4-0 Nylonnaht.
- Schalten Sie die Isofluranzufuhr aus. In diesem Stadium befindet sich die Maus am Beatmungsgerät und liefert Sauerstoff.
3. Nachsorge
- Schalten Sie das Beatmungsgerät aus, sobald die Spontanatmung einsetzt.
HINWEIS: Das Verfahren dauert etwa 30-35 Minuten pro Tier von der Vorbereitung der Mäuse bis zu diesem Schritt. - Halten Sie die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie, bis sie wach ist. Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis es genug Bewusstsein wiedererlangt hat, um das Brustbein aufrechtzuerhalten.
- Legen Sie das Tier nach der Operation in einen separaten Käfig und bringen Sie es erst dann mit anderen Tieren in den ursprünglichen Käfig zurück, wenn es sich vollständig erholt hat.
- Überwachen Sie die Maus täglich auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden.
- Setzen Sie die intraperitoneale Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 6-8 Stunden für weitere 2 Tage nach der Operation fort.
4. Echokardiographische Auswertung
HINWEIS: Eine Echokardiographie wurde durchgeführt, um die Parameter der Herzinsuffizienz am Tag 28 nach MI zu bewerten.
- Anästhesieren Sie die Mäuse 28 Tage nach der Operation mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff, tragen Sie steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen auf und entfernen Sie die Brusthaare mit einer Haarentfernungscreme. Desinfizieren Sie den Brustbereich dreimal mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
- Befestigen Sie die anästhesierten Mäuse auf der Bildgebungsplattform (siehe Materialtabelle) in Rückenlage und halten Sie während des gesamten Eingriffs ein konstantes Anästhesieniveau aufrecht, indem Sie einen Nasenkonus verwenden, der mit dem Anästhesiesystem verbunden ist (1%-2% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff).
- Kleben Sie die vier Pfoten mit Elektrodengel auf die EKG-Elektroden (siehe Materialtabelle). Überwachen Sie die Temperatur des Tieres, indem Sie eine rektale Sonde einführen (siehe Materialtabelle).
- Tragen Sie das Scan-Gel (siehe Materialtabelle) auf den Brustkorb auf, platzieren Sie den Schallkopf senkrecht, senken Sie ihn auf die parasternale Linie (parallel zum Thorax) ab und drehen Sie ihn um 35° gegen den Uhrzeigersinn, um die parasternale Längsachse des linken Ventrikels zu erhalten.
- Tippen Sie in der Bildgebungssoftware auf die Schaltfläche B-Modus-Bildgebung (siehe Materialtabelle), um eine vollständige Ansicht des Herzens mit langer Achse zu erhalten. Passen Sie die Größe und Helligkeit des Anschnitts an und speichern Sie die Bilder mit " Clip speichern " oder " Rahmen speichern" für spätere Messungen16.
- Wechseln Sie in den M-Modus (Bewegungsmodus) und platzieren Sie die M-Mode-Achse auf Höhe des Papillarmuskels. Passen Sie die Gate-Größe an und tippen Sie auf die Schaltfläche Start im M-Modus. Speichern Sie die Bilder mit "Clip speichern" oder "Rahmenspeichern 16,17".
- Da der Bilderfassungsprozess im 4D-Modus automatisiert ist, überprüfen Sie, ob die EKG- und Atmungssignale aktiv sind (Abbildung 1), bevor Sie die Daten erfassen.
- Beginnen Sie mit der Erfassung der Daten im B-Modus. Öffnen Sie das 4D-Scanfeld und starten Sie den 3D-Motor. Stellen Sie die Bildparameter im 4D Scan-Bedienfeld ein und tippen Sie auf die Schaltfläche Scannen , um den Scanvorgang zu starten. Nachdem Sie die Bilder in der 2D-Ansicht überprüft haben, laden Sie die Bilder mit der Schaltfläche In 4D laden in den 4D-Modus .
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die repräsentativen aktiven EKG- und Atmungssignale während der echokardiographischen Auswertung von Scheinmäusen (Abbildung 1A) und MI (Abbildung 1B). Die Überprüfung der aktiven EKG- und Atmungssignale ist wichtig, bevor die echokardiographischen Daten erfasst werden. Abbildung 2 zeigt die echokardiographische Messung von Herzfunktionsparametern nach 28 Tagen nach d...
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Diskussion
Das murine Modell von MI gewinnt in kardiovaskulären Forschungslabors an Popularität, und diese Studie beschreibt ein reproduzierbares und klinisch relevantes MI-Modell. Dieses Protokoll verbessert den LCA-Ligationsprozess in mehrfacher Hinsicht. Zunächst wird der Einsatz von injizierbaren präoperativen Anästhetika wie Xylazin/Ketamin oder Natrium-Pentobarbital14,15 vermieden. Es wurde nur eine Isofluran-Anästhesie verwendet, die dazu beiträgt, die Überlebensrate...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Health (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 und R01DK129339), den AHA Transformational Project Award (19TPA34910142), den AHA Innovative Project Award (19IPLOI34760566) und den ALA Innovation Project Award (IA-629694) (an PD) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 22 G Katheternadel | Exel INT | 26741 | Thorakozentese |
| 24 G Katheternadel | Exel INT | 26746 | Endotracheale Intubation |
| 4-0 Nylon-Naht | Covetrus | 29263 | Naht von Muskeln und Haut |
| 8-0 Nylon-Naht | S& T | 3192 | Ligatur von |
| Vet equip | VE-6047 | Anästhesieunterstützung | |
| Tierphysiologiemonitor | Fujifilm | VEVO 3100 | Überwachen Sie Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körpertemperatur |
| Betadin-Lösung | PBS Tiergesundheit | 11205 | Antispetikum |
| Buprenorphin | Covetrus | 55175 | Analgetikum |
| Präpariermikroskop | OMANO | OM2300S-V7 | Binokular |
| Elektrorasierer | Wahl | 79300-1001M | |
| Rasierelektrodengel | Parker Laboratories | W60698L | Elektrisch leitfähiges |
| Gel Ethanol | Decon Laboratories | 22-032-601 | |
| Desinfektionszange | FST | 11065-07 | Edelstahl |
| Gaze Curity | CAR-6339-PK | Sterile | |
| Wärmelampe | Satco | S4998 | Postoperative Pflege |
| Heizkissen | Kent scientific | Surgi-M | Temperaturregelung |
| Hot Bead Sterilisator | Germinator 500 | 11503 | Sterilisation von chirurgischen |
| Instrumenten Isofluran | Covetrus | 29405 | Anästhesie |
| Masson’ s trichrome Färbeset | Thermoscientific | 87019 | Messung von Herzfibrose |
| Mikronadelhalter | FST | 12500-12 | Edelstahl |
| Mikroschere | FST | 15000-02 | Edelstahl |
| Augensalbe | Dechra | Puralube Vet | Steriles Augengleitmittel |
| Scanning Gel | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Wässriges Ultraschall-Übertragungsgel |
| Schere | FST | 14060-11 | |
| Edelstahl-Laryngoskop für Kleintiere | Penn-Century | Modell LS-2-M | Beleuchtung des Oropharynx |
| Beatmungsgerät für Kleintiere | Harvard-Gerät | 557058 | Beatmungsgerät Unterstützung für Beatmungsgeräte |
| Operationsleuchte | Cole Parmer | 41723 | Beleuchtung Breite (Zoll): 7 |
| Vevo 3100 Plattform für präklinische Bildgebung | Fujifilm | VEVO 3100 | Echokardiographie |
| VevoLAB Software | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Datenanalyse für Echokardiographie |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
