Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT), das PhotoACT genannt wird. Das Gerät wurde mit einem Satz herkömmlicher programmierbarer Leuchtdioden (LEDs), einem LCD-Modul (Liquid Crystal Display) und einem Lichtsensor gebaut, der an eine kommerzielle Mikrocontrollerplatine angeschlossen ist. Die kastenbasierte Struktur des Prototyps wurde mit mitteldichten Faserplatten (MDFs) hergestellt. Das interne Kompartiment kann gleichzeitig vier Zellkultur-Multiwell-Mikroplatten zuordnen.

Als Proof of Concept untersuchten wir die zytotoxische Wirkung des Photosensibilisators (PS) Verteporfin gegen die HeLa-Zelllinie in zweidimensionaler (2D) Kultur. HeLa-Zellen wurden 24 h lang mit steigenden Konzentrationen von Verteporfin behandelt. Das arzneimittelhaltige Überstandsmedium wurde verworfen, die adhärenten Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und medikamentenfreies Medium hinzugefügt. In dieser Studie wurde die Wirkung von Verteporfin auf Zellen entweder ohne Lichtexposition oder nach 1-stündiger Lichtexposition anhand von Rot-Grün-Blau (RGB) Werten von 255, 255 und 255 (durchschnittliche Fluenz von 49,1 ± 0,6 J/cm²) untersucht. Nach 24 h wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay beurteilt.

Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von mit Verteporfin behandelten Zellen gegenüber dem Licht des Geräts die zytotoxische Wirkung des Arzneimittels über einen Mechanismus verstärkt, der durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wird. Darüber hinaus wurde die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps validiert, indem die Ergebnisse mit einem kommerziellen PDT-Gerät verglichen wurden. Somit stellt dieser LED-basierte photodynamische Therapieprototyp eine gute Alternative für in vitro Studien der PDT dar.

Einleitung

Unter den tödlichsten nichtübertragbaren Krankheiten ist Krebs eine weltweit häufigste Ursache für vorzeitige Todesfälle. Im Jahr 2020 entfielen fast 10 Millionen Todesfälle, was etwa einem von sechs Todesfällen weltweit entspricht¹. Darüber hinaus stellt das Phänomen der Multidrug-Resistenz (MDR) eine enorme Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, da zugelassene chemotherapeutische Protokolle für diesen klinischen Zustand keine Remissionsstadien erreichen². Krebszellen können durch mehrere Mechanismen eine Resistenz gegen Chemotherapie entwickeln; Die Überexpression einiger ATP-bindender Kassettentransporter (ABC) - ATP-abhängige Effluxpumpen - gilt jedoch als Hauptursache für die MDR-Entwicklung innerhalb einer Tumormikroumgebung³. Neben der MDR verstärken andere Krebskomplikationen wie Rezidive und Metastasen die dringende Notwendigkeit, therapeutische Ansätze zur Bewältigung dieser onkologischen Herausforderung zu entwickeln und zu verbessern.

Die kurative Nutzung von Licht wird seit Jahrhunderten^{praktiziert 4}, und die photodynamische Therapie (PDT) stellt einen klinisch anerkannten Therapieansatz für solide Tumore dar. Die PDT kombiniert die Verabreichung eines Photosensibilisators (PS), gefolgt von Lichtbestrahlung, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, um selektive Zytotoxizität in Tumorzellen auszuüben. Dieser therapeutische Ansatz ist herkömmlichen Methoden wie Operation, Bestrahlung und Chemotherapie überlegen⁵; Es handelt sich um eine minimalinvasive Technik, die eine geringere Zytotoxizität im Bindegewebe aufweist⁶. Die Lichtapplikation und die PS-Akkumulation direkt im Tumor oder seiner Mikroumgebung gewährleisten ein präzises Targeting und folglich geringe, unerwünschte systemische Nebenwirkungen⁷ und die Möglichkeit einer wiederholten Behandlung an derselben Stelle. Darüber hinaus sind die Kosten niedriger als bei anderen Ansätzen. Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften kann die PDT als geeignete Option sowohl für die einzelne, insbesondere bei inoperablen Tumoren, als auch für die adjuvante Krebsbehandlung⁷ angesehen werden und stellt eine Alternative für MDR im Zusammenhang mit der Chemotherapie^{dar 8,9}.

Der erste Bericht, der eine hohe objektive Ansprechrate unter Verwendung der PDT zeigte, wurde 1975 in einem Maus- und Rattenmodell¹⁰ beschrieben. Seitdem wurden Studien mit PDT mit positiven Ergebnissen⁷ sowohl in vivo als auch in vitro mit menschlichen Tumorzelllinien in 2D-Zellkultur^{durchgeführt 11,12}. Unter Berücksichtigung der breiten Anwendbarkeit klinisch zugelassener PS, unabhängig von ihren spezifischen Akkumulationswegen und Wellenlängenbereichen der Absorptionspeaks, ist der allgemeine Prozess wie folgt: (i) PS-Aufnahme, (ii) Spitzenwert der PS-Konzentration am Tumor oder seiner Mikroumgebung, (iii) Lichtanwendung, (iv) PS-Licht-Wechselwirkung, (v) Übertragung von PS-angeregter Energie entweder auf Gewebesubstrat oder umgebende Sauerstoffmoleküle, (vi) ROS-Produktion mit Singulett-Sauerstoff oder Superoxid-Anion, (vii) Tumorzelltod durch im Wesentlichen Nekrose oder Apoptose (direkter Tod), Autophagie (zytoprotektiver Mechanismus), Gewebeischämie (Gefäßschäden), Immunmodulation oder eine Überlappung dieser Mechanismen⁷. In diesem letzten Stadium hängt die Aktivierung eines spezifischen Zelltodwegs von vielen Faktoren ab, wie Zelleigenschaften, experimentellem Design und vor allem PS-intrazellulärer Lokalisation und PDT-bedingten gezielten Schäden¹³.

Verteporfin ist ein PS der zweiten Generation, das von Zulassungsbehörden für den klinischen Einsatz in Norwegen und China zur Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration⁷ zugelassen wurde. Nach Dosisabgabe wurde berichtet, dass sich dieses Prodrug teilweise in Mitochondrien^{anreichert 14} und zelluläre Proteintyrosinphosphorylierung und DNA-Fragmentierung induziert, was zu einer Tumorzellapoptose^{führt 15,16}. Nach 24-stündiger Inkubation zur Verteporfin-Internalisierung wird ein PDT-Protokoll unter Verwendung eines Wellenlängenaufbaus von 690 nm empfohlen, um eine effektive elektromagnetische Strahlungsübertragung auf benachbarte Moleküle ^7,17 zu erreichen.

Was die Lichtquelle für PDT betrifft, so sind die klassischen Diodenlasersysteme in der Regel teuer, technisch kompliziert, überdimensioniert und daher nicht portabel^18,19. Aufgrund seines Single-Wellenlängen-Profils, das auch in LED-basierten PDT-Geräten beobachtet werden kann, macht die Nachfrage nach unabhängigen Einheiten für jede Photosensibilisator-Anwendung den Einsatz von Diodenlasersystemen noch komplexer und wirtschaftlich nicht realisierbar^20,21. Daher gilt die Verwendung von LED-Maschinen als die vielversprechendste Alternative, um nicht nur Kosten 22 und Wartungsprobleme zu lösen, sondern auch eine hohe Leistung und weniger schädliche²³ und eine breitere Beleuchtungsfähigkeit^24,25,26,27 bereitzustellen.

Trotz des potenziellen Beitrags, den LED-basierte Geräte zu PDT-Experimenten leisten können²⁸, weisen die meisten kommerziellen Optionen immer noch Nachteile auf, wie mangelnde Portabilität, hohe Kosten und komplexe Bauprojekte und Betrieb²⁹. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug für In-vitro-PDT-Assays anzubieten. Dieses Dokument beschreibt PhotoACT, ein selbst gebautes LED-basiertes PDT-Gerät, das kostengünstig, benutzerfreundlich und tragbar ist. Als Machbarkeitsnachweis wird gezeigt, dass dieses Gerät die Zytotoxizität von Verteporfin in einem 2D-Zellkulturmodell verbessert und daher als Forschungswerkzeug in PDT-Experimenten verwendet werden kann.

Protokoll

HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .

1. Geräteaufbau

1. Sägen Sie 3 mm dicke mitteldichte Faserplatten (MDF), um Teile mit den in Abbildung 1A gezeigten Abmessungen zu erhalten.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Vektordatei (Supplemental File 1) für CNC-Schneiden.
2. Bauen Sie zwei Boxen mit den folgenden Abmessungen (Länge x Breite x Höhe): 330 mm x 235 mm x 225 mm für die größeren Boxen und 300 mm x 220 mm x 150 m für die kleineren Boxen (Abbildung 1B).
3. Bohren Sie die Rückseite des größeren Kartons, um einen Zylinderanschluss zu installieren. Bohren Sie die Oberseite des größeren Kastens und die Ober- und Unterseite des kleineren Kastens, um einen Durchgang für elektrische Kabel zu schaffen (Abbildung 1C).
4. Bemalen Sie alle Innenflächen mit schwarzer Tinte, um einen homogenen Lichteinfall zu erzielen (Abbildung 1D).
5. Bringen Sie parallel drei LED-Bänder mit jeweils 10 LEDs an der oberen Innenfläche des kleineren Kastens an (Abbildung 1E).
6. Installieren Sie einen Helligkeitssensor in der Mitte der unteren Innenfläche des kleineren Gehäuses (Abbildung 1F).
7. Drucken Sie die Struktur der Steuereinheit (Abbildung 1G) mit der 3D-Druckdatei (Zusatzdatei 2).
8. Installieren Sie alle Komponenten (Netzschalter, Potentiometer, Zeit-/Start-Touchpad, LEDs, Helligkeitssensor, LCD, Summer und Netzteil) an den Anschlüssen einer ESP32-Steuerplatine, die im Inneren der Steuereinheit montiert ist (Abbildung 2).
9. Laden Sie den Programmiercode hoch (Zusatzdatei 3, Zusatzdatei 4 und Zusatzdatei 5), und führen Sie einen Test durch, um zu überprüfen, ob alle Verbindungen funktionieren (Abbildung 1H).
10. Montieren Sie die Boxen und befestigen Sie sie, um Lücken und folglich externe Lichtinterferenzen und emittierte Lichtverluste zu vermeiden. Befestigen Sie die montierte Steuereinheit am Bohrbereich oben am Prototyp (Abbildung 1I).
11. Befestigen Sie eine Haustür aus dem gleichen Material und den Abmessungen 330 mm x 225 mm (Länge x Breite) an der größeren Box mit zwei kleinen Scharnieren. Befestigen Sie außerdem Klettbänder seitlich an der größeren Box, um den Prototypverschluss zu verstärken (Abbildung 1J). Installieren Sie einen Griff, um die Fronttür des Geräts zu manipulieren.
12. Befestigen Sie vier Gummifußpolster an der Unterseite des Prototyps, um mehr Stabilität während des Betriebs zu gewährleisten (Abbildung 1K).

2. Zelllinien: Kultivierung, Aussaat und Behandlung

1. Chemikalien
   1. Das Porphyrin wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Konzentration von 100 mM zu erreichen.
      ACHTUNG: DMSO muss vorsichtig gehandhabt werden (Handhabung mit persönlicher Schutzausrüstung und in einem belüfteten Bereich). Manipulieren Sie sowohl Stamm- als auch verdünnte Lösungen sorgfältig, um übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden.
2. Zelllinien
   1. Kultivieren Sie die HeLa-Zelllinie in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) Low-Glucose-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Gentamicin.
   2. Die Kulturkolben werden in einem 5%CO2-Zellkulturinkubator bei 37 °C aufbewahrt.
   3. Verwalten und inspizieren Sie die Zellen, bis sie 80% -90% Konfluenz erreichen.
3. Aussaatprozess
   1. Das Kulturmedium aus dem Kolben nehmen.
   2. Waschen Sie die Zelleinschicht mit PBS.
   3. Die konfluente Zellkultur mit Trypsin-EDTA (0,5%) 1x für 5 min bei 37 °C ablösen. Stoppen Sie die Wirkung von Trypsin, indem Sie die Zellen mit Kulturmedium resuspendieren, das mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Gentamicin ergänzt wird.
   4. Zählen Sie die resuspendierten Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie sie in eine 96-Well-Platte bei 2,0 × 10⁴ Zellen / Well.
   5. Bereiten Sie zwei Platten für dunkle und helle Bedingungen vor.
   6. Inkubieren Sie die Platten für 24 h zur Zellbefestigung.
4. Behandlungsablauf
   1. Entfernen Sie das Medium von beiden 96-Well-Platten.
   2. Behandeln Sie die Zellen mit 100 μL steigender Konzentrationen von Verteporfin (0,045 bis 24 μM, serielle Verdünnung).
   3. Inkubieren Sie die Zellen mit einer medikamentösen Behandlung für 24 Stunden, um die Internalisierung von Verteporfin zu ermöglichen.
   4. Nach 24 h verwerfen Sie das Medium, das das Arzneimittel enthält, waschen Sie die Monoschicht der Zellen mit PBS (100 μL) und fügen Sie ein arzneimittelfreies Medium (100 μL) hinzu.
   5. Bedecken Sie eine Mikroplatte mit Aluminiumfolie, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen, und inkubieren Sie sie für 24 Stunden. Diese Platte liefert Kontrolldaten für PDT-Ergebnisse (dunkler Zustand). Die andere Mikroplatte wird für die Lichtexpositionsbedingungen im Gerät verwendet.

3. Gerätebetrieb

1. Schließen Sie das PDT-Gerät an die Steckdose an und schalten Sie es durch Drücken des Netzschalters ein.
2. Legen Sie die andere Mikroplatte (Lichtbedingung) in das PDT-Gerät und schließen Sie das Gerät, indem Sie die Haustür mit den Klettbändern befestigen.
3. Verwenden Sie die Potentiometer, um die RGB-Konfiguration anzupassen (hier ein RGB 255, 255, 255-Experiment ) und die Farbe der Lichtemission einzustellen.
   HINWEIS: Jede RGB-Kombination hat ein spezifisches Emissionsspektrum, das für Experimente mit verschiedenen Photosensibilisatoren und folglich unterschiedliche Absorptionskurven angepasst werden muss.
4. Drücken Sie das (+)/(-) Touchpad, um die Zeitkonfiguration anzupassen (hier ein 60-minütiges Experiment) und die Dauer des Assays einzustellen.
   HINWEIS: Die Zeitkonfiguration in Verbindung mit dem Bestrahlungsstärkewert bestimmt die Fluenz des Prozesses - die im Assay angewendete Lichtdosis.
5. Überprüfen Sie die Setup-Informationen am Display.
6. Drücken Sie die Taste Start , um den Assay zu starten. Stellen Sie sicher, dass zu Beginn des Assays ein Signalton zu hören ist.
7. Beobachten Sie im Verlauf des Experiments Echtzeitinformationen auf dem Display, wie Bestrahlungsstärke und verbleibende Zeit.
8. Öffnen Sie während des PDT-Tests nicht die Frontklappe und ändern Sie keine Konfiguration.
9. Warten Sie am Ende des Assays auf einen Summer mit vier Signaltönen und darauf, dass das elektronische System alle LEDs ausgeschaltet hat. Beachten Sie die Meldung Beendet und die endgültige Menge an Energie, die während des Experiments aufgewendet wurde - Fluence - im Display.
   HINWEIS: Der Fluence-Endwert wird anhand von Gleichung (1) berechnet:
   (1)
   Dabei ist F gleich J/cm 2 und I gleich mW/cm 2 oder mJ/s·cm ². Der Bestrahlungsstärkewert berücksichtigt die Potenz der LEDs (emittierende Quelle) und die gleichmäßig bestrahlte Fläche der Dunkelkammer (660 cm 2) (Gleichung [2]):
   (2)
   Der theoretische Bestrahlungsstärkewert wird während des gesamten PDT-Assays auf dem Gerätedisplay angezeigt. Verwenden Sie am Ende des Vorgangs Gleichung (3), um die Fluenz zu berechnen:
   Fluenz (F) = Bestrahlungsstärke (I, konstanter Wert) × Betriebszeit(en ) (3)

4. Zelllebensfähigkeitstest

1. Nach dem PDT-Test die Mikroplatte, die Licht ausgesetzt wurde, abdecken und 24 h inkubieren.
2. Nach der Inkubationszeit das Kulturmedium von beiden Platten entfernen, die Monoschicht der Zellen mit PBS (100 μL) waschen und MTT-Lösung (0,5 mg / ml, 100 μL) hinzufügen. Inkubieren Sie beide Platten - dunkle und helle Bedingungen - für 4 Stunden, um die Bildung von Formazankristallen zu ermöglichen.
3. Entfernen Sie die MTT-Lösung vorsichtig und lösen Sie die violetten Kristalle mit einer DMSO/Ethanol-Lösung (1:1) auf.
4. Nach vollständiger Auflösung der Kristalle wird die Absorptionsmessung mit einem Mikrotiterplattenleser bei 595 nm durchgeführt.
   HINWEIS: Das Gerät kann in anderen wichtigen Experimenten verwendet werden, wie dem ROS-vermittelten Zelltod, der durch Photosensibilisatoren nach Lichtexposition durch Durchflusszytometrie³⁰ ausgelöst wird.

Ergebnisse

Das letzte PDT-Gerät mit dem Namen PhotoACT enthielt eine dunkle Kammer zur Zuweisung von bis zu vier Multiwell-Mikrotiterplatten, wobei die obere Innenfläche mit einem Satz von 30 gestreuten LEDs ausgestattet war, die so programmiert waren, dass sie unterschiedliche Spektren sichtbaren Lichts emittieren (Abbildung 3 und Zusatzdatei 6). Das Gerät bestand aus zwei zugehörigen Boxen: einer internen Box, die als dunkle Kammer für die PDT-Assays konzipiert war, und einer externe...

Diskussion

Das endgültige PhotoACT-Gerät war bequem mit kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Komponenten zu Gesamtkosten von weniger als 50 US-Dollar zu konstruieren. Weitere Vorteile sind ein geringer Wartungsaufwand, die Fähigkeit, mehrere Arten von Kulturplatten zu bestrahlen, die gleichzeitige Verwendung von bis zu vier Einheiten pro Assay, ein geringes Gewicht (2 kg)/Größe (44 cm³), das Portabilität, genaue und reproduzierbare Bestrahlung (Daten nicht gezeigt) ermöglicht, und eine benutzerfreundliche und einfac...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 % Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Dissoziationsreagenz für Säugetierzellkulturen
3D-Drucker	Flashforge		Finder Modell
96-Well-Platten			Unsterile Oberflächenplatten aus Polystyrol und hochbindenden Oberflächen mit flachem Boden für 2D-Zellkulturen
Arduino
Helligkeitssensor			TSL2561 Modell mit 0,1-40.000+ Lux Nachweiswerten und I2C-Schnittstelle
Tasten
Summer
Zellkulturkolben			Steriler, rechteckiger Bodenkolben aus Polystyrol mit Gewebekultur (TC)-behandelter Oberfläche, abgeschrägtem Hals und Entlüftungskappe (Größen)
Zentrifugenröhrchen			Sterile Polypropylen-Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15/50 mL für die Zellkulturverdünnung im Aussaatschritt des Assays
CO2 Inkubator
Controller-Platine			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ist ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugetierzellen.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethylsulfoxid, ≥ 99,5 % (GC), geeignet für Pflanzenzellkulturen
Fötales Rinderserum	Gibco	12657029	FBS bietet das beste Preis-Leistungs-Verhältnis, indem es ein konsistentes Zellwachstum über die Zeit und die Passagen hinweg gewährleistet.
Gentamicin (50 mg/ml)	Gibco	15750060	Wasserlösliches Antibiotikum, das ursprünglich vom Pilz gereinigt wurde  Mikromonospora purpurea. Gentamicin wirkt, indem es die Kontamination von Zellkulturen verhindert
Hämozytometer			Neubauer gemusterte Kammer für die Zellzählung im Aussaatschritt des Assays
Inverses Labormikroskop	Leica		DM IL LED
Laminar-Flow-Haubenkabine			zum Schutz der Arbeitsumgebung vor Verunreinigungen, indem ein konstanter, unidirektionaler Strom von HEPA-gefilterter Luft über das Werkstück aufrechterhalten wird Fläche. Wird in mehreren Schritten der Zellkultivierung und -behandlung verwendet
LCD-Display
, LED, RGB, WS2812			5050, RGB, SMD-Modell mit eingebautem Prozessor. Klebeband mit 30 LEDs, 1 Meter Länge und 9 Watt
MDF-Faserplatten			3 mm Dicke mitteldichte
Faserplatten Mikrozentrifugenröhrchen			Steril, Polypropylenröhrchen mit Sicherheitsdeckel und 1,5/2,0 ml Fassungsvermögen. Praktische Werkzeuge für die Manipulation kleiner Volumina im Behandlungsschritt des Assays
Mikroplatten-Reader	ThermoFischer		Multiskan FC Mikroplatten-Photometer für die Detektion eines breiten Wellenlängenbereichs der Extinktion (340-850 nm). Das Gerät wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der MTT-Inkubation zu bewerten.
MTT-Reagenz	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Wird für Zellviabilitätsassays
verwendet Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 Mikrofon			Nicht-elektronisch, einkanalig, 1-10 μ
P1000 Mikropipette			, einkanalig, 10-1000 μ
P200 Mikropipette			, einkanalig, 20-200 μ
PDT-Ausrüstung	LumaCare		Modell LC-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4	Gibco	10010031	Ausgewogene Salzformulierung zum Waschen von Zellen während der Kultivierung und Assay-Verfahren
Potentiometer
Tipps			Unsteril, universelle Passform, 10/200/1000 μ L maximale Volumina
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥ 94% (HPLC)