Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT), das PhotoACT genannt wird. Das Gerät wurde mit einem Satz herkömmlicher programmierbarer Leuchtdioden (LEDs), einem LCD-Modul (Liquid Crystal Display) und einem Lichtsensor gebaut, der an eine kommerzielle Mikrocontrollerplatine angeschlossen ist. Die kastenbasierte Struktur des Prototyps wurde mit mitteldichten Faserplatten (MDFs) hergestellt. Das interne Kompartiment kann gleichzeitig vier Zellkultur-Multiwell-Mikroplatten zuordnen.
Als Proof of Concept untersuchten wir die zytotoxische Wirkung des Photosensibilisators (PS) Verteporfin gegen die HeLa-Zelllinie in zweidimensionaler (2D) Kultur. HeLa-Zellen wurden 24 h lang mit steigenden Konzentrationen von Verteporfin behandelt. Das arzneimittelhaltige Überstandsmedium wurde verworfen, die adhärenten Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und medikamentenfreies Medium hinzugefügt. In dieser Studie wurde die Wirkung von Verteporfin auf Zellen entweder ohne Lichtexposition oder nach 1-stündiger Lichtexposition anhand von Rot-Grün-Blau (RGB) Werten von 255, 255 und 255 (durchschnittliche Fluenz von 49,1 ± 0,6 J/cm2) untersucht. Nach 24 h wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay beurteilt.
Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von mit Verteporfin behandelten Zellen gegenüber dem Licht des Geräts die zytotoxische Wirkung des Arzneimittels über einen Mechanismus verstärkt, der durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wird. Darüber hinaus wurde die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps validiert, indem die Ergebnisse mit einem kommerziellen PDT-Gerät verglichen wurden. Somit stellt dieser LED-basierte photodynamische Therapieprototyp eine gute Alternative für in vitro Studien der PDT dar.
Einleitung
Unter den tödlichsten nichtübertragbaren Krankheiten ist Krebs eine weltweit häufigste Ursache für vorzeitige Todesfälle. Im Jahr 2020 entfielen fast 10 Millionen Todesfälle, was etwa einem von sechs Todesfällen weltweit entspricht1. Darüber hinaus stellt das Phänomen der Multidrug-Resistenz (MDR) eine enorme Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, da zugelassene chemotherapeutische Protokolle für diesen klinischen Zustand keine Remissionsstadien erreichen2. Krebszellen können durch mehrere Mechanismen eine Resistenz gegen Chemotherapie entwickeln; Die Überexpression einiger ATP-bindender Kassettentransporter (ABC)....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Geräteaufbau
- Sägen Sie 3 mm dicke mitteldichte Faserplatten (MDF), um Teile mit den in Abbildung 1A gezeigten Abmessungen zu erhalten.
HINWEIS: Verwenden Sie die Vektordatei (Supplemental File 1) für CNC-Schneiden. - Bauen Sie zwei Boxen mit den folgenden Abmessungen (Länge x Breite x Höhe): 330 mm x 235 mm x 225 mm für die größeren Boxen und 300 mm x 220 mm x 150 m für die kleineren Boxen (
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Das letzte PDT-Gerät mit dem Namen PhotoACT enthielt eine dunkle Kammer zur Zuweisung von bis zu vier Multiwell-Mikrotiterplatten, wobei die obere Innenfläche mit einem Satz von 30 gestreuten LEDs ausgestattet war, die so programmiert waren, dass sie unterschiedliche Spektren sichtbaren Lichts emittieren (Abbildung 3 und Zusatzdatei 6). Das Gerät bestand aus zwei zugehörigen Boxen: einer internen Box, die als dunkle Kammer für die PDT-Assays konzipiert war, und einer externe.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das endgültige PhotoACT-Gerät war bequem mit kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Komponenten zu Gesamtkosten von weniger als 50 US-Dollar zu konstruieren. Weitere Vorteile sind ein geringer Wartungsaufwand, die Fähigkeit, mehrere Arten von Kulturplatten zu bestrahlen, die gleichzeitige Verwendung von bis zu vier Einheiten pro Assay, ein geringes Gewicht (2 kg)/Größe (44 cm3), das Portabilität, genaue und reproduzierbare Bestrahlung (Daten nicht gezeigt) ermöglicht, und eine benutzerfreundliche und einfac.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Arthur Henrique Gomes de Oliveira und Lucas Julian Cruz Gomes für die Unterstützung bei den Dreharbeiten. Dieses Projekt wurde vom brasilianischen Forschungsrat (CNPq, Förderkennzeichen 400953/2016-1-404286/2021-6) und der Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003) unterstützt. Diese Studie wurde auch teilweise von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 % Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Dissoziationsreagenz für Säugetierzellkulturen |
| 3D-Drucker | Flashforge | Finder Modell | |
| 96-Well-Platten | Unsterile Oberflächenplatten aus Polystyrol und hochbindenden Oberflächen mit flachem Boden für 2D-Zellkulturen | ||
| Arduino | |||
| Helligkeitssensor | TSL2561 Modell mit 0,1-40.000+ Lux Nachweiswerten und I2C-Schnittstelle | ||
| Tasten | |||
| Summer | |||
| Zellkulturkolben | Steriler, rechteckiger Bodenkolben aus Polystyrol mit Gewebekultur (TC)-behandelter Oberfläche, abgeschrägtem Hals und Entlüftungskappe (Größen) | ||
| Zentrifugenröhrchen | Sterile Polypropylen-Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15/50 mL für die Zellkulturverdünnung im Aussaatschritt des Assays | ||
| CO2 Inkubator | |||
| Controller-Platine | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ist ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugetierzellen. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethylsulfoxid, ≥ 99,5 % (GC), geeignet für Pflanzenzellkulturen |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 12657029 | FBS bietet das beste Preis-Leistungs-Verhältnis, indem es ein konsistentes Zellwachstum über die Zeit und die Passagen hinweg gewährleistet. |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750060 | Wasserlösliches Antibiotikum, das ursprünglich vom Pilz gereinigt wurde Mikromonospora purpurea. Gentamicin wirkt, indem es die Kontamination von Zellkulturen verhindert |
| Hämozytometer | Neubauer gemusterte Kammer für die Zellzählung im Aussaatschritt des Assays | ||
| Inverses Labormikroskop | Leica | DM IL LED | |
| Laminar-Flow-Haubenkabine | zum Schutz der Arbeitsumgebung vor Verunreinigungen, indem ein konstanter, unidirektionaler Strom von HEPA-gefilterter Luft über das Werkstück aufrechterhalten wird Fläche. Wird in mehreren Schritten der Zellkultivierung und -behandlung verwendet | ||
| LCD-Display | |||
| , LED, RGB, WS2812 | 5050, RGB, SMD-Modell mit eingebautem Prozessor. Klebeband mit 30 LEDs, 1 Meter Länge und 9 Watt | ||
| MDF-Faserplatten | 3 mm Dicke mitteldichte | ||
| Faserplatten Mikrozentrifugenröhrchen | Steril, Polypropylenröhrchen mit Sicherheitsdeckel und 1,5/2,0 ml Fassungsvermögen. Praktische Werkzeuge für die Manipulation kleiner Volumina im Behandlungsschritt des Assays | ||
| Mikroplatten-Reader | ThermoFischer | Multiskan FC Mikroplatten-Photometer für die Detektion eines breiten Wellenlängenbereichs der Extinktion (340-850 nm). Das Gerät wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der MTT-Inkubation zu bewerten. | |
| MTT-Reagenz | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Wird für Zellviabilitätsassays |
| verwendet Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 Mikrofon | Nicht-elektronisch, einkanalig, 1-10 μ | ||
| P1000 Mikropipette | , einkanalig, 10-1000 μ | ||
| P200 Mikropipette | , einkanalig, 20-200 μ | ||
| PDT-Ausrüstung | LumaCare | Modell LC-122 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 | Gibco | 10010031 | Ausgewogene Salzformulierung zum Waschen von Zellen während der Kultivierung und Assay-Verfahren |
| Potentiometer | |||
| Tipps | Unsteril, universelle Passform, 10/200/1000 μ L maximale Volumina | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥ 94% (HPLC) |
Referenzen
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent tran....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
