Extraktion, Markierung und Reinigung von linienspezifischen Zellen aus humanen Antralfollikeln

Die wichtigsten funktionellen Elemente des menschlichen Eierstocks sind die Follikel, die das Wachstum und die Entwicklung der Eizellen steuern. Protokolle für die Isolierung von Follikelzellen sind im Zusammenhang mit der In-vitro-Fertilisation gut etabliert, aber diese sind nur für die Entnahme von Zellen aus luteinisierten Follikeln zum Zeitpunkt der Eizellentnahme geeignet¹. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Isolierung diskreter Zellpopulationen aus Antralfollikeln in verschiedenen Entwicklungsstadien ermöglicht, die aus nativen Eierstöcken oder xenotransplantiertem Ovarialgewebe entstehen². Obwohl Konsens darüber besteht, dass der Beitrag follikelresidenter Zellen zur Kultivierung der Eizelle von großer Bedeutung ist, haben nur wenige Studien prospektiv die einzigartigen phänotypischen Subtypen identifiziert und extrahiert, die in Follikeln im Antralstadium vorhanden sind. Ein tieferes Verständnis der Differenzierungshierarchie und der Signaltransduktion zwischen spezialisierten Zellen während der verschiedenen Entwicklungsstadien könnte unser Verständnis der Physiologie der Eierstöcke unter homöostatischen und pathologischen Bedingungen erweitern. Darüber hinaus kann die Unterscheidung diskreter zellulärer Subtypen und ihrer molekularen Beiträge zum Follikelwachstum/zur Follikelreifung eine Möglichkeit bieten, ex vivo Surrogate zu erzeugen, die die Ovarialfunktion rekonstruieren, um die Eizellreifung zu fördern und/oder endokrine Dysfunktionen zu behandeln.

Jeder einzelne Zelltyp innerhalb des Eierstocks trägt zur komplexen Funktion des Follikels bei, der effektiv als eigenständiges Miniorgan fungiert, um das Wachstum und die Reifung der darin enthaltenen Eizelle zu fördern. Die Eizelle, das Herzstück des Follikels, ist direkt von einer kontinuierlichen Schicht von Granulosazellen (GCs) umgeben, wobei die Thekazellen (TCs) eine sekundäre Zellschicht bilden, die sich mit der Eizelle und den GCs verbinden, um die follikuläre Einheit zu bilden. Obwohl sie in zwei Gruppen eingeteilt werden, enthalten GCs und TCs zahlreiche Subtypen. GCs werden nach ihrer Position innerhalb des Follikels klassifiziert. GCs, die die Eizelle umgeben, im Gegensatz zu denen, die an die Basalmembran angrenzen, werden als oophore bzw. murale GCs bezeichnet, und diese Subtypen weisen einzigartige transkriptomische Signaturen auf. TCs haben zahlreiche Subtypen, die steroidogene, metabolische und strukturelle Unterstützung bieten. Endothel-, Perivaskulär- und Immunzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung einer normalen Physiologie der Eierstöcke. Das Ovarialstroma dient nicht nur als Substrat für das Follikelwachstum, sondern stellt wahrscheinlich auch eine Quelle für Vorläuferzellen dar, aus denen TCs entstehen. Dieser vielschichtige Komplex von zellulären Subtypen im Eierstock ermöglicht seine Funktion sowohl als endokrines als auch als Fortpflanzungsorgan.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Identifizierung und Reinigung von Granulosa-, Theka-, Stroma-, Endothel- und hämatopoetischen Zellen aus Antralfollikeln vorgestellt. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um diese Eierstockzellen zu isolieren und sie mittels Einzelzellsequenzierung zu analysieren, gefolgt von einer spezifischen Färbung in Follikeln verschiedener Entwicklungsstadien. Das Protokoll bietet eine unkomplizierte Methodik, die replizierbar ist und die hochauflösende Analyse sowohl der Physiologie als auch der Pathologie des Eierstocks ermöglicht.

Alle Verfahren mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei Weill Cornell Medicine genehmigt. Alle Xenotransplantationsexperimente mit Eierstockgewebe wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Beide Eierstöcke wurden von einer 14-jährigen hirntoten Organspenderin isoliert, die keine Radio-/Chemotherapie in der Vorgeschichte und keine dokumentierte Vorgeschichte von endokrinen oder reproduktiven Erkrankungen hatte. Das Komitee des Institutional Review Board (IRB) von Weill Cornell Medicine genehmigte die Entnahme von Gewebe, und die Zustimmung der Familie des Organspenders wurde nach informierter Zustimmung zur Verwendung von Gewebe eingeholt.

1. Entnahme und Handhabung von Eierstockgewebe

1. Sammeln Sie ganze Eierstöcke und das zugehörige Gewebe und spülen Sie sie in steriler Kochsalzlösung ab.
2. Legen Sie die Eierstöcke mit einer sterilen Pinzette in einen sterilen Behälter. Gießen Sie sterile, gepufferte, kalte Lösung (z. B. Leibovitz's L-15 Medium) in den Behälter. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig mit der Flüssigkeit bedeckt ist.
3. Verschließen Sie den Behälter und verpacken Sie ihn mit sterilen Plastikbeuteln. Transportieren Sie den Behälter auf Eis in einer isolierten Box (z. B. Styropor). Bringen Sie die Proben so schnell wie möglich in das Labor, das die Eierstöcke verarbeitet, vorzugsweise in einer Zeit von nicht mehr als 5 Stunden ^3,4.

2. Verarbeitung des Eierstockgewebes

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Werkzeuge vorbereitet sind, bevor das Gewebe im Labor ankommt, um das ischämische Intervall so weit wie möglich zu verkürzen. Die Puffer können bis zu 1 Woche vor dem Einfrieren zubereitet und bis zur Verwendung gekühlt werden.

1. Vorbereitungen für die Verarbeitung und das Einfrieren der Eierstöcke
   1. Legen Sie sterilisierte chirurgische Werkzeuge in die Biosicherheitswerkbank zur Vorbereitung der Gewebeverarbeitung: ein Skalpell mit der Nummer 21; ein Skalpell mit der Nummer 11; scharfe, fein gebogene Schere; eine lange Pinzette (~150 mm Länge); und zwei mittlere Pinzetten (~110 mm Länge).
   2. Bereiten Sie 100 ml Gewebeverarbeitungsmedium vor (siehe Materialtabelle): Leibovitz-Medium L-15 mit antibiotisch-antimykotischer Lösung und filtriert mit einem 0,2-μm-Filter. Bewahren Sie das Medium gekühlt auf.
   3. Beschriften Sie die Kryogefäße, geben Sie 1,5 ml Gefrierlösung (siehe Materialtabelle) in jede Durchstechflasche und lagern Sie sie bei 4 °C.
   4. Halten Sie eine 6-Well-Platte zur Verfügung.
2. Bei Ankunft des Gewebes
   1. Besprühen Sie den Behälter mit 70%iger Ethanollösung, wischen Sie ihn gründlich ab und stellen Sie ihn in die Biosicherheitswerkbank.
   2. Öffnen Sie den Behälter mit sterilen Handschuhen. Legen Sie den Eierstock in eine sterile Petrischale und gießen Sie gekühltes Medium (aus Schritt 2.1.2) ein, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen. Stellen Sie sicher, dass der Eierstock halb in das Medium eingetaucht ist.
   3. Entfernen Sie alle Nähte oder anderes Material und präparieren Sie das restliche umgebende Gewebe vom Eierstock weg.

3. Isolierung der Antralfollikel

1. Identifizieren Sie einzelne Follikel für die Isolierung. Schließen Sie bei der Auswahl gesunder Follikel blutgefüllte, dunkle oder unsymmetrische Follikel aus, da diese wahrscheinlich atretisch sind.
2. Isolieren Sie die ausgewählten Antralfollikel mit Skalpellen aus dem gesamten Eierstock und halten Sie das Antrum intakt, indem Sie das kortikale Gewebe, das den Follikel umgibt, herausschneiden.
3. Platzieren Sie jeden herausgeschnittenen intakten Antralfollikel in einer Vertiefung der 6-Well-Platte. Verwenden Sie bei Bedarf zu beschreibenden Zwecken ein Lineal, das unter der Schale platziert wird, um den Follikeldurchmesser zu bestimmen.
4. Halbieren Sie mit einem Skalpell den intakten Antralfollikel, um Zugang zur Antralhöhle zu erhalten, und fügen Sie 4 ml enzymatisches Zellablösungsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 5% CO₂ und 37 °C für 10 min.
5. Wiederholen Sie die Entnahme zusätzlicher Antralfollikel nach Bedarf.

4. Isolierung follikelresidenter Zellen

1. Nach der Inkubation werden 4 ml des verfügbaren Mediums mit 20 % FBS hinzugefügt und durch wiederholtes, kräftiges Pipettieren des Mediums über die halbierten Follikel mit einer P1.000-Mikropipette gespült.
2. Fangen Sie das Medium auf und leiten Sie es durch einen 100-μm-Filter.
3. Den filtrierten Überstand bei 300 × g und 4 °C für 3 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet (angereichert mit GCs) auf Eis für die Markierung und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) auf.
4. Das verbleibende Gewebe wird in eine Mischung aus Kollagenase (100 U/ml) und Dispase (1 U/ml) gegeben, die in einer ausgewogenen Kochsalzlösung (z. B. Hanks) verdünnt ist, und 30 Minuten lang bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert, wobei das Gewebe durch Verreibung und kräftiges Pipettieren (d. h. 10-15 Durchgänge durch die Pipettenspitze) zweimal nach 10 Minuten und 20 Minuten mechanisch aufgebrochen wird.
5. Gewinnen Sie Medien, die das Gewebe enthalten, spülen Sie es durch Pipettieren durch eine P1.000-Mikropipettenspitze und seihen Sie es durch einen 100-μm-Filter.
6. Bei 300 × g und 4 °C 3 min zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und legen Sie das Zellpellet (angereichert mit TCs und Stromazellen) auf Eis zur Markierung und FACS beiseite.

5. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

1. Die Zellpellets werden in Blockierlösung (PBS + 0,1 % FBS) resuspendiert und 10 min bei 4 °C inkubiert.
2. Bei 300 × g und 4 °C 3 min zentrifugieren und den Überstand absaugen.
3. Resuspendieren Sie die Zellpellets in einer Blockierungslösung, die direkt konjugierte Antikörper enthält (siehe Tabelle 1 für geeignete Antikörperkombinationen zur Identifizierung von GCs und TCs), und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.
4. Waschen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g und 4 °C für 3 min. Resuspendieren Sie die Zellen in FACS-Puffer, der 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und lassen Sie die Zellsuspension durch ein FACS-Instrument laufen, um eine kleine Population der Zellen (500-1.000) unter Verwendung der Fluoreszenzintensität von Fluorophor-konjugierten Antikörpern für das Gating zu erfassen.
5. Verwenden Sie für die Identifizierung eindeutiger Subpopulationen die folgenden Gating-Strategien:
   1. Zeichnen Sie für die Aufreinigung von GCs ein Tor um die CD45+-Zellen (Abbildung 1B) und schließen Sie diese Population aus der CD99⁺-Population aus (Abbildung 1A und Abbildung 1C). Anschließend wird die verbleibende CD99+-Fraktion weiter in PVRL^{+/-Fraktionen} unterteilt (Abbildung 1A und Abbildung 1C).
   2. Für die Aufreinigung von TCs und Stroma wird die gesamte ENG+ (Abbildung 1A) oder ^CD55+ (Abbildung 1D) Population eingeteilt, um die CD34+ Endothelfraktion auszuschließen (Abbildung 1E) und die steroidogenen (ANPEP⁺) und nicht-steroidogenen (ANPEP^-) Zellen zu unterscheiden. Achten Sie darauf, das Durchscheinen zwischen Fluorophoren, die in den Emissionsspektren nahe beieinander liegen, zu kompensieren.
6. Um die Reinheit der sortierten Zellfraktion zu validieren, lassen Sie 5 % des gesamten erfassten Volumens durch das FACS-Gerät laufen und stellen Sie sicher, dass die Zellen die erwarteten Gates bestücken und mit einer Reinheit von >95 % vorhanden sind.

6. Verarbeitung des kortikalen Gewebes der Eierstöcke

1. Schneiden Sie den Rest des Eierstocks in zwei Hälften und entfernen Sie das Mark mit einer gebogenen feinen Schere und einem Skalpell, wobei Sie darauf achten sollten, dass die Eierstockrinde nicht beschädigt wird.
2. Setzen Sie die Verarbeitung und Verdünnung der Eierstockrinde durch sanftes Schaben fort, bis ein minimales Mark übrig bleibt. Stellen Sie sicher, dass Sie die erforderliche Mindestkraft verwenden.
   HINWEIS: Die Dicke des kortikalen Gewebes sollte zwischen 1 mm und 1,5 mm liegen.
3. Teilen Sie das kortikale Gewebe in 2-3 mm breite Streifen entlang der Länge des Eierstocks.

7. Langsames Einfrieren von Eierstockgewebe

1. Vorbereitung zum Einfrieren
   1. Legen Sie einen kortikalen Streifen in jede gekühlte kryogene Durchstechflasche mit Gefrierlösung.
   2. Die kryogenen Durchstechflaschen mit den kortikalen Streifen auf einer rotierenden Platte 20 min bei 4 °C schütteln.
2. Langsames Einfrieren des Eierstockgewebes⁵
   1. Legen Sie die Kryogefäße, die Eierstockgewebe enthalten, in einen programmierbaren Gefrierschrank, der auf 0 °C eingestellt ist.
   2. Mit einer Geschwindigkeit von 2 °C/min bis −7 °C abkühlen lassen.
   3. Halten Sie die Kryogefäße 10 Minuten lang auf dieser Temperatur.
   4. Keimen Sie die Eiskristallbildung an, indem Sie jedes Kryogefäß mit einer Wattestäbchenspitze berühren, die kurz in flüssigen Stickstoff (LN₂) getaucht wurde.
   5. Mit einer Geschwindigkeit von 0,3 °C/min abkühlen, bis die Probentemperatur −40 °C erreicht.
   6. Erhöhen Sie die Abkühlgeschwindigkeit auf 10 °C/min, bis die Probentemperatur −140 °C erreicht.
   7. Übertragen Sie die Kryoflaschen zur Lagerung in LN₂.

Wir isolierten Follikel von der Oberfläche des Eierstocks und behandelten sie enzymatisch, um die GCs sowie die Theka- und Stromazellen, die die Antralhöhle umgeben, zu isolieren. Die Zellen wurden entnommen und die Zellfraktionen aus den Antralfollikeln (Durchmesser zwischen 0,5 mm und 4 mm) mittels FACS auf eine Reinheit von >95 % sortiert (Abbildung 1).

Um einzigartige Zellfraktionen in den humanen Antralfollikeln zu markieren und zu reinigen, kombinierten wir den enzymatischen Aufschluss mit der durchflusszytometrischen Sortierung. Wir haben bereits Oberflächenproteine identifiziert, die spezifisch follikelresidente Fraktionenmarkieren 2. Wir haben gezeigt, dass CD99 (rot in Abbildung 1A) spezifisch GCs markiert und PVRL1 (gelb in Abbildung 1A) zunehmend im oophorösen GC-Kompartiment lokalisiert ist, wenn die Antralfollikel an Größe2 zunehmen. Wir haben auch gezeigt, dass Antikörper gegen Endoglin (ENG, grün in Abbildung 1A) oder CD55 (Abbildung 1D) spezifisch alle Stroma und TCs abgrenzen und dass Alaninaminopeptidase (ANPEP, Abbildung 1E) spezifisch von androgenen TCs exprimiert wird 2,6.

Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen CD99 markiert, um GCs zu identifizieren, und Antikörper gegen CD45 wurden verwendet, um hämatopoetische Zellen auszuschließen (Abbildung 1B,C). Antikörper gegen PVRL1 ermöglichten die Aufteilung der GC-Population in oophoröse und murale Kompartimente (Abbildung 1C). Nach enzymatischem Aufschluss mit Kollagenase/Dispase ermöglichten die mit Antikörpern gegen CD55 (oder alternativ ENG), CD34 und ANPEP markierten Zellpräparate die Erfassung aller Stroma/TCs (CD55+) und/oder androgenen TCs (ANPEP+) unter Ausschluss der Endothelzellen (CD34+) aus den TC-Populationen (Abbildung 1D,E). Mit Hilfe dieses Panels und eines schrittweisen enzymatischen Dissoziationsprotokolls markierten und gereinigten wir hämatopoetische, endotheliale, granulosafarbene (oophore und murale) und thekafarbene (stromale und androgene) Zellen aus den Antralfollikeln frisch resezierter Eierstöcke.

Abbildung 1: Markierung und Aufreinigung von linienspezifischen Zellen aus humanen Antralfollikeln. (A) Repräsentative Schliffbild, die GC (CD99+ PVRL+/-) und TC (ENG+) Kompartimente innerhalb menschlicher Follikel im Antralstadium zeigt; Weiße Strichfelder werden nach rechts vergrößert. (B-E) Repräsentative Sortierdiagramme, die GCs als CD45-CD99+ PVRL1+/- Zellen (a und b) sowie generische (CD34- CD55+) und androgene (CD34- CD55+ ANPEP+) TCs (C,D) identifizieren. Gated Populationen werden zwischen (B,C) und (D,E) geteilt; Ungefärbte Kontrollen sind links in (B-E) dargestellt. Maßstabsbalken = (A) 100 μm. Abkürzungen: GC = Granulosazelle; TC = Thekazelle; PVRL = Nektin; ANPEP = Alanin-Aminopeptidase; Nuc = Kerne; SSC = seitliche Streuung; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Liste der Antikörper, die zur Identifizierung von GCs, TCs und ovariellem Stroma verwendet werden können. Abkürzungen: GC = Granulosazelle; TC = Thekazelle.

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.