Extraktion, Markierung und Reinigung von linienspezifischen Zellen aus humanen Antralfollikeln

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle für die Identifizierung und Reinigung von Ovarialzellen aus Antralfollikeln vor. Wir erarbeiten Methoden zur Verarbeitung ganzer Eierstöcke für die Kryokonservierung von kortikalen Streifen bei gleichzeitiger Entnahme intakter Antralfollikel, die enzymatisch behandelt werden, um mehrere follikelresidente Zelltypen freizusetzen, darunter Granulosa-, Theka-, Endothel-, hämatopoetische und Stromazellen.

Zusammenfassung

Die Aktivierung, das Wachstum, die Entwicklung und die Reifung von Eizellen ist ein komplexer Prozess, der nicht nur zwischen mehreren Zelltypen des Eierstocks, sondern auch über mehrere Kontrollpunkte innerhalb des Hypothalamus-/Hypophysen-/Eierstockkreislaufs koordiniert wird. Innerhalb des Eierstocks wachsen mehrere spezialisierte Zelltypen in enger Verbindung mit der Eizelle innerhalb der Eierstockfollikel. Die Biologie dieser Zellen ist in den späteren Stadien gut beschrieben, wenn sie leicht als Nebenprodukte von assistierten Reproduktionsbehandlungen wiederhergestellt werden können. Die eingehende Analyse kleiner Antralfollikel, die direkt aus dem Eierstock isoliert wurden, wird jedoch aufgrund des Mangels an menschlichem Eierstockgewebe und des eingeschränkten Zugangs zum Eierstock bei Patientinnen, die sich einer assistierten Reproduktionsbehandlung unterziehen, in der Regel nicht durchgeführt.

Diese Methoden zur Aufbereitung ganzer Eierstöcke für die Kryokonservierung kortikaler Streifen bei gleichzeitiger Identifizierung/Isolierung von Ovarialzellen ermöglichen die hochauflösende Analyse der frühen Stadien der Antralfollikelentwicklung. Wir demonstrieren Protokolle zur Isolierung diskreter Zelltypen durch enzymatische Behandlung von Antralfollikeln und Trennung der Granulosa-, Theka-, Endothel-, hämatopoetischen und Stromazellen. Die Isolierung von Zellen aus den Antralfollikeln in verschiedenen Größen und Entwicklungsstadien ermöglicht die umfassende Analyse der zellulären und molekularen Mechanismen, die das Follikelwachstum und die Physiologie der Eierstöcke antreiben, und bietet eine Quelle lebensfähiger Zellen, die in vitro kultiviert werden können, um die Mikroumgebung der Follikel zu rekapitulieren.

Einleitung

Die wichtigsten funktionellen Elemente des menschlichen Eierstocks sind die Follikel, die das Wachstum und die Entwicklung der Eizellen steuern. Protokolle für die Isolierung von Follikelzellen sind im Zusammenhang mit der In-vitro-Fertilisation gut etabliert, aber diese sind nur für die Entnahme von Zellen aus luteinisierten Follikeln zum Zeitpunkt der Eizellentnahme geeignet¹. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Isolierung diskreter Zellpopulationen aus Antralfollikeln in verschiedenen Entwicklungsstadien ermöglicht, die aus nativen Eierstöcken oder xenotransplantiertem Ovarialgewebe entstehen². Obwohl....

Protokoll

Alle Verfahren mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei Weill Cornell Medicine genehmigt. Alle Xenotransplantationsexperimente mit Eierstockgewebe wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Beide Eierstöcke wurden von einer 14-jährigen hirntoten Organspenderin isoliert, die keine Radio-/Chemotherapie in der Vorgeschichte und keine dokumentierte Vorgeschichte von endokrinen oder reproduktiven Erkrankungen hatte. Das Komitee des Institutional Review Board (IRB) von Weill Cornell Medicine genehmigte die Entnahme von Gewebe, und die Zustimmung der Familie des Organspenders wurde nach info....

Ergebnisse

Wir isolierten Follikel von der Oberfläche des Eierstocks und behandelten sie enzymatisch, um die GCs sowie die Theka- und Stromazellen, die die Antralhöhle umgeben, zu isolieren. Die Zellen wurden entnommen und die Zellfraktionen aus den Antralfollikeln (Durchmesser zwischen 0,5 mm und 4 mm) mittels FACS auf eine Reinheit von >95 % sortiert (Abbildung 1).

Um einzigartige Zellfraktionen in den humanen Antralfollikeln zu markieren und zu reinigen, kombinierten w.......

Diskussion

Eine bessere Auflösung der zellulären Vielfalt innerhalb der Eierstockfollikel ist aus mehreren Gründen klinisch wichtig. Bei der Anwendung des obigen Protokolls auf die Isolierung der einzigartigen phänotypischen Subtypen, die sich in den Follikeln des Antralstadiums befinden, sollten mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Erstens ist die Gesundheit und Lebensfähigkeit des Eierstockgewebes, aus dem der Antralfollikel gewonnen wird, entscheidend für die Qualität der Zellen und den Erfolg nachgelagerter Anwendungen. Dies.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemikalien, Reagenzien
Antibiotikum-Antimykotikum 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062
	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Kollagenase aus  Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, Pulver	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethylsulfoxid
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzym-Zellablösungs-Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviert	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt Lösung	Thermo Fisher Scientific	14175079	kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot
Leibovitz s L-15 mittel	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Kochsalzqualität	Biologisch	114-055-101
Saccharose	Millipore Sigma	S 1888
Gefriermedium (100 mL, filtriert durch einen 0,2-Mikron-Filter)
- 69,64 mL L-15
17,66 ml von fötalen Rindern
- 3,42 g Saccharose
- 10,65 ml DMSO
- 1 ml Antibiotikum - Antimykotikum
Lab Plasticware and Supplies
6 Well Clear Flat Bottom Unbehandelt	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µ m	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Kryofläschchen	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1,8 mL
Petrischale, T x H 150 mm x 25 mm;	Millipore Sigma		CLS430599 60EA
Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappverschluss für das Zellsieb, 5 mL	Fisher Scientific	352235	Corning, Falcon
Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 0,22 & Mikro; m	Corning	431154
Antikörper
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R& D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Chirurgische Instrumente
lange Pinzette (~150 mm Länge)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
mittlere Pinzette (~110 mm Länge)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
Nummer 21 Skalpell	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
Skalpell Nummer 11	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
scharfe, fein gebogene Schere	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer	BD
LSM 710 META Konfokalmikroskop	Zeiss