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In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

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DOI:

10.3791/64403

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5. Mai 2023

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1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

Zusammenfassung

Die Geninaktivierung ist entscheidend für die Untersuchung der Genfunktion und stellt eine vielversprechende Strategie für die Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten dar. Unter den traditionellen Technologien leidet die RNA-Interferenz unter der teilweisen Aufhebung des Ziels und der Notwendigkeit lebenslanger Behandlungen. Im Gegensatz dazu können künstliche Nukleasen eine stabile Geninaktivierung durch Induktion eines DNA-Doppelstrangbruchs (DSB) bewirken, aber neuere Studien stellen die Sicherheit dieses Ansatzes in Frage. Eine gezielte epigenetische Editierung mittels künstlich hergestellter Transkriptionsrepressoren (ETRs) könnte eine Lösung darstellen, da eine einmalige Verabreichung spezifischer ETR-Kombinationen zu einer dauerhaften Stilllegung führen kann, ohne DNA-Brüche zu induzieren.

ETRs sind Proteine, die eine programmierbare DNA-Bindungsdomäne (DBD) und Effektoren von natürlich vorkommenden Transkriptionsrepressoren enthalten. Insbesondere wurde gezeigt, dass eine Kombination von drei ETRs, die mit der KRAB-Domäne von humanem ZNF10, der katalytischen Domäne von humanem DNMT3A und humanem DNMT3L, ausgestattet sind, vererbbare repressive epigenetische Zustände auf dem ETR-Zielgen induziert. Die Hit-and-Run-Natur dieser Plattform, die fehlende Beeinflussung der DNA-Sequenz des Ziels und die Möglichkeit, bei Bedarf durch DNA-Demethylierung in den repressiven Zustand zurückzukehren, machen das epigenetische Silencing zu einem bahnbrechenden Werkzeug. Ein kritischer Schritt ist die Identifizierung der richtigen Position der ETRs auf dem Zielgen, um das On-Target-Tracking zu maximieren und das Off-Target-Silencing zu minimieren. Die Durchführung dieses Schritts in der endgültigen präklinischen Ex-vivo- oder In-vivo-Umgebung kann umständlich sein.

Ausgehend vom CRISPR/katalytisch toten Cas9-System als paradigmatische DBD für ETRs beschreibt diese Arbeit ein Protokoll, das aus dem In-vitro-Screening von guide-RNAs (gRNAs) besteht, die an die Triple-ETR-Kombination gekoppelt sind, um ein effizientes On-Target-Silencing zu ermöglichen, gefolgt von der Bewertung des genomweiten Spezifitätsprofils von Top-Treffern. Dies ermöglicht es, das anfängliche Repertoire an gRNA-Kandidaten auf eine kurze Liste vielversprechender gRNAs zu reduzieren, deren Komplexität für ihre abschließende Bewertung im therapeutisch relevanten Setting von Interesse geeignet ist.

Einleitung

Die Geninaktivierung spielt traditionell eine Schlüsselrolle bei der Untersuchung der Genfunktion sowohl in Zell- als auch in Tiermodellen. Darüber hinaus wurde sie in den letzten zwei Jahrzehnten mit dem Aufkommen der Gentherapie als potenziell bahnbrechender Ansatz zur Behandlung von Krankheiten vorgeschlagen, die durch Gain-of-Function-Mutationen1, Infektionskrankheiten2 oder Pathologien verursacht werden, bei denen die Stilllegung eines Gens einen erblichen Defekt in einem anderen kompensieren kann3. Schließlich wurde die genetische Inaktivierung von Schlüsselregulatoren der Zellfitness und der funktionellen Kontrolle vorgeschlagen, um die Effizienz von Zellprodukten für die Krebsimmuntherapie4 und die regenerative Medizin5 zu verbessern.

Unter den verschiedenen Technologien zur Geninaktivierung ist eine der vielversprechendsten das gezielte epigenetische Silencing 6,7. Kern dieser Technologie sind die sogenannten Engineered Transcriptional Repressors (ETRs), chimäre Proteine, die aus einer programmierbaren DNA-Bindungsdomäne (DBD) und einer Effektordomäne (ED) mit epigenetischer Repressionsfunktion bestehen. Zinkfingerproteine (ZFPs)8, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs)9 oder CRISPR/dCas910-basierte DBDs können so konzipiert werden, dass sie die ED selektiv an die Promotor-/Enhancer-Sequenz des Zielgens binden, das stillgelegt werden soll. Dort angekommen, übt die ED der ETR ihre Silencing-Aktivität aus, indem sie heterochromatin-induzierende repressive epigenetische Markierungen wie Histonmodifikationen (H3K9 11,12 oder H3K27 13-Methylierung,H3- oder H4-Deacetylierung14) und CpG-DNA-Methylierung 15 auferlegt, je nach verwendeter repressiver Domäne.

Insbesondere inspiriert von den molekularen Prozessen der permanenten transkriptionellen Repression endogener Retroviren, die im Präimplantationsembryoauftreten 16, wurde eine Kombination von drei ETRs generiert, um die folgenden EDs zu nutzen: i) die Krüppel-assoziierte Box (KRAB)-Domäne von humanem ZNF10; ii) die katalytische Domäne der humanen de novo DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A); und iii) die humane DNA-Methyltransferase 3-like (DNMT3L) in voller Länge. KRAB ist eine konservierte repressive Domäne, die von mehreren ZFPs in höheren Wirbeltieren geteilt wird17,18, deren Silencing-Aktivität hauptsächlich auf ihrer Fähigkeit beruht, KAP1 19 zu rekrutieren - ein Gerüstprotein, das dann mit mehreren anderen Heterochromatin-Induktoren20 interagiert - einschließlich des Nukleosomen-Remodeling- und Deacetylierungskomplexes (NuRD) 21, der H3K9-Histon-Methyltransferase SETDB122 und des H3K9-Methylierungslesers HP1 23, 24, unter anderem.

DNMT3A überträgt aktiv Methylgruppen auf die DNA an CpG-Sequenzen25. Die katalytische Aktivität von DNMT3A wird durch seine physikalische Assoziation mit DNMT3L verstärkt, einem embryo- und keimzellbeschränkten Paralog von DNMT3A, dem die katalytische Domäne fehlt, die für den Methylgruppentransfer verantwortlich ist26,27. Die DNA-Methylierung an CpG-reichen Regionen, die als CpG-Inseln (CGIs) bezeichnet werden, die in die Promotor-/Enhancer-Elemente von Säugetiergenen eingebettet sind, ist in der Regel mit Transkriptions-Silencing assoziiert28. Wichtig ist, dass die CpG-Methylierung, sobald sie abgeschieden ist, während der gesamten Mitose durch einen UHRF1-DNMT1-basierten molekularen Komplex stabil vererbt werdenkann 29.

Eine stabile Überexpression der ETRs in der Zielzelle kann problematisch sein, wahrscheinlich aufgrund des zunehmenden Risikos einer Off-Target-Aktivität und der Verdrängung endogener Interaktoren von ihren physiologischen Zielorten im Laufe der Zeit. Die vorübergehende Expression von Einzel-ETR-Einheiten kann jedoch keine langfristige Stilllegung mit hoher Effizienz induzieren30, was ihre therapeutische Anwendung behindert. Daher war ein bahnbrechender Durchbruch auf diesem Gebiet der Nachweis, dass die Kombination der drei KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-basierten ETRs synergistisch wirken und, selbst wenn sie nur vorübergehend zusammen verabreicht werden, die Promotorsequenz des Zielgens H3K9 und die CpG-Methylierung beeinflussen kann. Diese werden dann von der Zelle während der gesamten Mitose abgelesen und vermehrt, was zu einer vererbbaren Stilllegung in mehreren menschlichen und murinen Zelllinien sowie in ex vivo kultivierten Primärzellen führt30.

Bemerkenswert ist, dass die epigenetische Stummschaltung, die durch die ETRs auferlegt wird, bei Bedarf durch gezielte (z. B. Rekrutierung der CRISPR/dCas9-basierten TET1-DNA-Demethylase auf dem stillgelegten Locus) oder pharmakologische (Verabreichung des DNA-Methyltransferase-Inhibitors 5-Aza) DNA-Demethylierung rückgängig gemacht werdenkann 30, ein potenzielles Gegenmittel im Falle von ETR-bedingten unerwünschten Ereignissen. All-in-One-ETRs mit den drei KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-basierten EDs wurden ebenfalls beschrieben und zeigten signifikante Silencing-Effizienzen in Zelllinien31,32 gegenüber der großen Mehrheit der proteinkodierenden Gene. Darüber hinaus berichteten mehrere Studien, in denen die ETRs verwendet wurden, über ein hohes Sicherheitsprofil ohne größere Off-Target-Aktivität in Bezug auf die De-novo-CpG-Methylierung oder die Veränderung der Chromatinzugänglichkeit30,31,32. Vor klinischen Anwendungen wird jedoch eine dedizierte Analyse des Spezifitätsprofils von ETRs empfohlen, die mit einer neu gestalteten DBD ausgestattet sind.

Aus klinischer Sicht kann gezieltes epigenetisches Silencing entscheidende Vorteile sowohl für den RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Knockdown33 als auch für die künstliche Nuklease-basierte Genstörungbieten 8. Im Gegensatz zu RNAi kann das gezielte epigenetische Silencing die vollständige Aufhebung seines Ziels pro Zelle induzieren und erfordert keine regelmäßige Behandlung, um ein langfristiges Silencing zu gewährleisten. Im Gegensatz zur Genstörung bleibt die DNA-Sequenz unverändert, wodurch die Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) vermieden wird. DSBs können dann Apoptose und Zellzyklusarrest induzieren, was möglicherweise zu einer Selektion gegen Zellen mit einem funktionellen p53-Signalwegführt 34,35 und, insbesondere in Multiplex-Geneditierungsumgebungen, zu chromosomalen Umlagerungen 35. Darüber hinaus kann die Genstörung durch die Weiterleitung des irreversiblen Mosaikergebnisses der nicht-homologen Endverknüpfungs-vermittelten DNA-DSB-Reparatur36 die In-Frame-Reparatur des Ziels in funktionelle kodierende Sequenzen als eines der Endergebnisse nicht vermeiden und kann im Gegensatz zum epigenetischen Silencing nicht bei Bedarf gelöscht werden.

Schließlich birgt epigenetisches Silencing das Potenzial, das Spektrum der anvisierbaren genetischen Elemente auf Klassen zu erweitern, die vollständig oder zumindest teilweise refraktär gegenüber RNAi und Genstörungen sind, wie z. B. nicht-transkribierte regulatorische Elemente und nicht-kodierende RNAs30,32. Der erste kritische Schritt für jede gezielte epigenetische Silencing-Anwendung besteht darin, ein Panel von ETRs zu entwerfen, das die verschiedenen regulatorischen Sequenzen des Zielgens abdeckt, und die leistungsstärksten zu identifizieren. Die Anzahl der zu testenden ETRs kann entscheidend sein, wenn man den wachsenden Anteil des Genoms bedenkt, auf den die programmierbaren DNA-Bindungstechnologien abzielen, die sich ständig in der Entwicklung befinden37. Das Screening der ETRs direkt auf dem Zelltyp durchzuführen, in dem das Zielgen therapeutisch stillgelegt werden soll, wäre die relevanteste Option. Hochdurchsatz-Screenings können jedoch aufgrund ihres begrenzten Überlebens in Kultur und ihrer oft suboptimalen technischen Kapazität in Primärzellen technisch umständlich sein. Großflächige Bildschirme können in vivo noch undurchführbarer sein.

Eine praktikablere Alternative besteht darin, zunächst ein großes Panel von ETRs in leicht herzustellenden Zelllinien durchzuführen und dann nur die vielversprechendsten in dem therapeutisch relevanten Zelltyp zu validieren. Ein paralleles Problem ist die Auswahl eines geeigneten Messwerts zur Messung der Silencing-Effizienz der ETRs. Die direkte Bewertung der Transkript- oder Proteinspiegel des Zielgens mittels RT-qPCR, Western Blot oder ELISA kann kostspielig und zeitaufwändig sein und möglicherweise nicht ausreichend empfindlich sein, was ihre Anwendung im Hochdurchsatzmaßstab einschränkt. Die Generierung von ad hoc modifizierten Reporterzelllinien, in denen ein Fluorophor unter die transkriptionelle Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des Zielgens gestellt wird, ermöglicht die Nutzung des auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatzes, um epigenetisches Silencing auf Einzelzellebene und mit hoher Durchsatzgeschwindigkeit zu lesen.

Im Anschluss an diese allgemeinen Überlegungen wird in dieser Arbeit ein Protokoll beschrieben, das aus dem in vitro angeordneten Screening von ETRs auf On-Target-Silencing-Effizienz besteht, gefolgt von der Bewertung der genomweiten Off-Target-Aktivität der Top-Hits. Dieser Workflow ermöglicht es, das anfängliche Repertoire an ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste vielversprechender ETRs zu reduzieren, deren Komplexität für ihre endgültige Bewertung in dem therapeutisch relevanten Zelltyp von Interesse geeignet ist.

Unter den verschiedenen programmierbaren DBDs, die zur Generierung von ETRs genutzt werden können, wird sich dieses Protokoll auf die CRISPR/dCas9-basierte Technologie konzentrieren, da es einfach ist, gRNAs zu entwerfen, die den Zielgenpromotor in einem Hochdurchsatzmaßstab umfassen. Der gleiche konzeptionelle Workflow, der im Folgenden beschrieben wird, kann jedoch verwendet werden, um die Effizienz und Spezifität von ETRs zu bewerten, die mit anderen DBDs ausgestattet sind.

Protokoll

1. Entwicklung einer fluoreszenzbasierten Reporterzelllinie zur Überwachung der Transkriptionsaktivität des Zielgens durch Durchflusszytometrie

  1. Identifizieren Sie Zelllinien, die das Zielgen exprimieren, das stillgelegt werden soll. Durchsuchen Sie das Zielgen, das im Human Protein Atlas38 stillgelegt werden soll, und navigieren Sie durch den Abschnitt "Zelllinie", um diejenigen Linien zu identifizieren, die für das interessierende somatische Gewebe repräsentativ sind (z. B. eine Leberzelllinie, wenn die endgültigen Ziele Leberhepatozyten sind). Alternativ können Sie eine öffentlich zugängliche RNA-Sequenzierungsdatenbank (RNA-Seq) (z. B. NCBI GEO) abfragen.
  2. Priorisieren Sie unter den Kandidaten Zelllinien, für die effiziente transiente Genübertragungsprotokolle verfügbar sind, die für die ETR-Verabreichung von entscheidender Bedeutung sind.
    HINWEIS: Unter den verschiedenen Modalitäten stellt die Nukleofektion eine der besten Optionen dar, da sie eine hohe Transfektionseffizienz gewährleistet. Hier wurden humane Erythroleukämie-K-562-Zellen ausgewählt, um eine Zelllinie zu erzeugen, die die Transkriptionsaktivität des Beta-2-Mikroglobulin (B2M)-Gens meldet (im Folgenden alsB2M-TdTomato-K-562-Zellen bezeichnet).
  3. Priorisieren Sie die Kandidaten weiter, um Zelllinien zu vermeiden, in denen das Zielgen für die Zelllebensfähigkeit essentiell ist, da dies die Aufrechterhaltung von Zellen mit stabiler Stilllegung des Zielgens in Kultur beeinträchtigt. Um ein Gefühl für die Wesentlichkeit des Zielgens für den Zelltyp der Wahl zu bekommen, wird eine genetische Störungskontrolle erzeugt, indem die Zellen mit Cas9-Nuklease und einer gRNA transfiziert werden, die auf eines der ersten kodierenden Exons des Gens abzielt.
    ANMERKUNG: Genetische Störungen sind per Definition ein stabiles Ereignis; Die Gegenselektion von gestörten Zellen im Laufe der Zeit deutet darauf hin, dass das Zielgen für die Physiologie der ausgewählten Zelle essentiell ist.
    1. Identifizieren Sie die Ziel-Spleiß-Isoform, die bevorzugt in der ausgewählten Zelllinie verwendet wird (die Isoform NM_004048.4 des B2M-Gens wird in diesem Protokoll anvisiert).
    2. Identifizierung einer gRNA, die effektiv und spezifisch im ersten kodierenden Exon der Zielisoform schneiden kann (z. B. Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, ein gültiges und benutzerfreundliches Online-gRNA-Auswahlwerkzeug).
    3. Bei K-562-Zellen werden 1 μg spCas9-kodierendes Plasmid (hCas9; siehe Materialtabelle) und 250 ng gRNA-kodierendes Plasmid (phU6-gRNA; siehe Materialtabelle) pro 5 × 105 Zellen durch Nukleofektion (gemäß den Anweisungen des Herstellers) transfektiert.
    4. Kultivieren Sie die Zellen (K-562-Zellen bei 37 °C unter 5 % CO2 in RPMI-1640, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum [FBS], L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin [100 U/ml]) und überwachen Sie den Grad der Genstörung im Laufe der Zeit unter Verwendung eines Mutationsnachweis-Kits (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers).
  4. Klonen Sie eine Donorvorlage für die homologe Rekombinations-vermittelte Integration eines fluoreszierenden Reporters unter der transkriptionellen Kontrolle des Zielgens von Interesse (Abbildung 1).
    1. Identifizieren Sie die Region des Zielgens, in die die Fluorophor-Expressionskassette integriert werden soll.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, auf transkriptionell relevante Elemente wie CpG-Inseln und Regionen abzuzielen, die für die H3K27-Acetylierung angereichert sind (Marker für aktive Promotoren und Enhancer). Die Veränderung dieser regulatorischen Elemente (die möglicherweise wichtig sind, um von den ETRs angegriffen zu werden, um epigenetisches Silencing zu instruieren) macht die Reporterzelllinie weniger prädiktiv für die physiologische Regulation des Zielgens.
      1. Wenn das Zielgen nicht für ein sezerniertes Protein kodiert, fusionieren Sie den Reporter über ein selbstspaltendes 2A-Peptid mit dem letzten Codon des Zielgens, um die Funktionalität des Zielgens aufrechtzuerhalten.
      2. Wenn das Zielgen für ein sezerniertes Protein kodiert, wird der Reporter in einer intronischen Region des Zielgens platziert, um eine mögliche Sekretion des Reporters zu vermeiden. Die erzwungene Integration des Reporters in das gespleißte Transkript durch eine Spleißakzeptorstelle (SA) und die anschließende Translation durch eine interne Ribosomen-Eintrittssequenz (IRES) beeinträchtigt die Funktionalität des Zielgens.
    2. Verwenden Sie Chopchop, um den gRNA-Schnitt in der Zielregion auszuwählen (hier wird eine gRNA ausgewählt, die auf die Sequenz 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ des ersten Introns des B2M-Gens abzielt).
    3. Entwerfen Sie eine Spenderschablone für die gRNA-Schnittstelle, bestehend aus: i) einem linken Homologiearm (n Basenpaare [bp], die der Region direkt stromaufwärts der gRNA-Schnittstelle entsprechen); ii) eine promotorfreie Transgenexpressionskassette (im hier gezeigten Fall ein SA-3X-Stop-Codon-IRES-tdTomato-BGH-Poly(A), das das Spleißen mit dem ersten Intron des B2M-Gens begünstigt); und iii) ein rechter Homologiearm (n bp, der der Region stromabwärts der gRNA-Schnittstelle entspricht).
      HINWEIS: Die Länge der Homologiearme, die notwendig sind, um eine homologe Rekombination effektiv zu induzieren, kann zwischen verschiedenen Zelltypen variieren (100-500 bp ist ein geeigneter Bereich für K-562-Zellen).
  5. Das CRISPR/Cas9-Nukleasesystem und die Donor-Vorlage werden in die Zielzelllinie eingebracht. Für K-562-Zellen transfektieren Sie 1 μg spCas9-kodierendes Plasmid (hCas9; siehe Materialtabelle), 250 ng gRNA-kodierendes Plasmid (phU6-gRNA; siehe Materialtabelle) und 1 μg Donor-Template-kodierendes Plasmid pro 5 × 105 Zellen durch Nukleofektion (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
  6. Kultivieren Sie die Zellen mindestens 14 Tage lang (für K-562-Zellen) und überwachen Sie die Expressionsniveaus des fluoreszierenden Reporters im Laufe der Zeit mit einem Durchflusszytometer (aktivieren Sie den Phycoerythrin (PE)-Kanal, um die Fluoreszenzintensität des tdTomato-Reporters zu messen, und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Durchführung der Durchflusszytometrie).
    HINWEIS: Das Donor-Template - insbesondere wenn es auf Plasmid basiert - kann kryptische Promotorsequenzen enthalten, die zur Expression des fluoreszierenden Reporters aus nicht integrierten Donorkopien führen. Die Kultivierung der Zellen ermöglicht es, diese nicht integrierten Kopien durch Zellteilung zu verdünnen und schließlich die Expression des Reporters nur aus den im Zielgenom integrierten Spenderkopien aufrechtzuerhalten.
  7. Klonen Sie reporterpositive Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) auf Einzelzellebene. Aktivieren Sie für dieses Protokoll den PE-Kanal, um die Fluoreszenzintensität des tdTomato-Reporters zu messen, und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um einzelne tdTomato-positive K-562-Zellen pro Well einer 96-Well-Platte zu sortieren.
  8. Nach der Zellexpansion in Kultur (typischerweise 20-30 Tage für K-562-Zellen) werden Reporter-positive Klone mittels PCR gescreent, um einen Klon auszuwählen, der eine bi-allelische Integration der Reporterkassette innerhalb des Zielortes aufweist.
    HINWEIS: Dies maximiert die Reporterexpression und erleichtert die weitere Auflösung zwischen Reporter-exprimierenden und Reporter-stillgelegten Zellen durch Durchflusszytometrie nach ETR-Behandlung.
    1. Extrahieren Sie genomische DNA aus 1 ×10 5 Zellen pro reporterpositivem Klon mit einem DNA-Extraktionskit (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    2. Amplifikation der B2M-Zielregion mit vorwärts (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') und umgekehrten (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') Primern gemäß den Anweisungen des PCR-Amplifikationskits. Die Annealing-Temperatur für dieses Primerpaar beträgt 47,7 °C mit Taq-basierten DNA-Polymerasen und 0,5 μM Primer-Konzentrationen.
    3. Analysieren Sie das PCR-Produkt mit einer 1%igen Agarose-Gelelektrophorese (gemäß den Anweisungen des Herstellers). Screen für Klone, die die Bande zeigen, die mit der Integration der tdTomato in den B2M-Ziellocus (3.413 bp) zusammenhängt, ohne die Bande, die mit dem Wildtyp-Ziellocus verwandt ist (1.027 bp).

2. Design von gRNAs für die CRISPR/dCas 9-basierte epigenetische Stummschaltung des Zielgens

  1. Durchsuchen Sie das Zielgen im UCSC-Genombrowser40 und extrahieren Sie die Nukleotidsequenz von Regionen, die möglicherweise seine Transkriptionsaktivität regulieren, wie z. B. CpG-Inseln und Stellen, die für die H3K27-Acetylierung angereichert sind (Marker für aktive Promotoren und Enhancer).
    HINWEIS: Laut einer aktuellen Studie ist die beste Zielregion ein 1-Kilobasen-Fenster (kb), das auf der Transkriptionsstartstelle des Zielgens32 zentriert ist.
  2. Fügen Sie die ausgewählten Sequenzen in das Online-Tool von Chopchop ein und wählen Sie die Repression als Zweck der abzurufenden gRNAs aus. Warten Sie, bis Chopchop eine Liste von gRNAs bereitstellt, die auf der interessierenden genetischen Sequenz abgebildet und nach einer Punktzahl aufgelistet sind, die sowohl die Anzahl der Off-Target-Übereinstimmungen als auch die prognostizierte On-Target-Effizienz berücksichtigt (Abbildung 2).
  3. Wählen Sie mindestens 10 gRNAs pro Zielsequenz aus. Versuchen Sie, wenn möglich, gRNAs auszuwählen, die sich über die gesamte zu untersuchende Region erstrecken, ohne vollständige Übereinstimmungen mit anderen intragenischen Sequenzen im gesamten Genom.

3. Angeordnete transiente Verabreichung von CRISPR/dCas 9-basierten ETRs in der Reporterzelllinie

  1. Wählen Sie unter den Transgen-Verabreichungssystemen, über die zuvor für die Zielzelllinie berichtet wurde, diejenigen aus, die nur eine vorübergehende Transgenexpression ermöglichen, die Verabreichungseffizienz maximieren und die Toxizität im Zusammenhang mit der Zellmanipulation minimieren. Im Falle von K-562-Zellen ist sowohl die Plasmid- als auch die mRNA-Nukleofektion sehr zu empfehlen, wobei die Plasmidherstellung eine technisch einfachere und kostengünstigere Alternative darstellt.
  2. Klonen Sie sowohl die in Abschnitt 2 ausgewählten gRNAs als auch CRISPR/dCas9-basierte ETRs im Transgen-Verabreichungssystem Ihrer Wahl. In den folgenden Schritten finden Sie ein Protokoll zum Klonieren der ETRs in Plasmid-DNAs.
    HINWEIS: Plasmide, die separat für dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A und dCas9:DNMT3L30 kodieren, sind auf Addgene nicht verfügbar. Sie wurden kloniert, indem der VP160-Transaktivator aus dem Plasmid pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (siehe Materialtabelle) entweder durch die KRAB-, DNMT3A- oder DNMT3L-Domänenkodierungssequenz30 ersetzt wurde. Eine Plasmid-Kodierung für eine All-in-One-ETR mit der Bezeichnung CRISPRoff-v2.132 ist verfügbar (siehe Materialtabelle).
    1. Plasmide, die für die ETRs kodieren, in chemisch kompetente E. coli-Zellen transformieren (gemäß den Anweisungen des Herstellers). Screenen Sie die Kolonien auf das Vorhandensein des ETR-tragenden Plasmids durch Restriktionsenzymverdau und Sanger-Sequenzierung und wählen Sie schließlich eine der positiven Kolonien für die Plasmid-DNA-Midiprep-Produktion aus (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    2. Klonen Sie die gRNAs im phU6-gRNA-Rückgrat (Abbildung 3).
      1. Mit Hilfe einer molekularbiologischen Designsoftware wird eine 5'-CACCG-3'-Sequenz stromaufwärts des Protospacers (die erste variable 20 Nukleotide [nt] der ausgewählten gRNA) angehängt, um ein 25 nt langes Oligo in silico zu erzeugen, das als SGfw bezeichnet wird.
      2. In ähnlicher Weise wird eine 5'-AAAC-3'-Sequenz stromaufwärts des umgekehrten Komplements des Protospacers der ausgewählten gRNA und eine 5'-C-3' stromabwärts davon angehängt, um ein 25 nt langes Oligo zu erzeugen, das als SGrv bezeichnet wird.
      3. Bestellen Sie sowohl die SGfw- als auch die SGrv-Sequenz als salzfreie einzelsträngige DNA-Oligos, die in Wasser bei 100 μM resuspendiert werden.
      4. 1 μl von jedem Oligo zu 2 μl Annealing-Puffer (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) und 16 μl Wasser hinzufügen.
      5. Führen Sie das Oligoglühen durch, indem Sie die Lösung in einen Thermocycler geben, der so programmiert ist, dass er 10 Minuten lang bei 95 °C beginnt. Anschließend über 45 min allmählich auf 25 °C abkühlen lassen.
      6. Verdünnen Sie 1 μl der geglühten Oligos mit 99 μl nukleasefreiem Wasser und ligieren Sie dann 1 μl dieser Verdünnung mit 50 ng phU6-gRNA-Plasmid, das zuvor mit dem BsaI-Restriktionsenzym verdaut wurde (befolgen Sie die Anweisungen der BsaI- und Ligase-Kit-Anbieter für das Aufschluss- und Ligaturverfahren).
      7. Transformieren Sie 20 μl chemisch kompetente E. coli-Zellen mit 2 μl des Ligationsprodukts (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das Transformationsverfahren).
      8. Wählen Sie mehrere Kolonien für die Plasmid-DNA-Miniprep-Produktion aus (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers) und kontrollieren Sie die erfolgreiche Klonierung des Protospacers durch Sanger-Sequenzierung mit dem folgenden Primer, der zum U6-Promotor 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3' passt.
      9. Wählen Sie eine der positiven Kolonien für die Herstellung von Plasmid-DNA Midiprep (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
  3. Verabreichung der ausgewählten gRNAs und CRISPR/dCas9-basierten ETRs in der Reporterzelllinie in Array (eine spezifische gRNA pro Bedingung) (Abbildung 3).
    HINWEIS: Als repräsentativer Fall wird der Arbeitsablauf für die Nukleofektion von Plasmiden, die für dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L und gRNAs kodieren, die auf die B2M-CpG-Insel in B2M-TdTomato-K-562-Zellen abzielen, in den folgenden Schritten gezeigt.
    1. Bereiten Sie separate Röhrchen vor, die jeweils 500 ng der dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- und dCas9:DNMT3L-kodierenden Plasmide enthalten, die sich jedoch für die zu testende gRNA unterscheiden (125 ng eines gRNA-kodierenden Plasmids pro Röhrchen). Fügen Sie eine gRNA- und ETR-freie Nukleofektionserkrankung als simulierte Probe hinzu. Führen Sie das Screening mit mindestens drei technischen Replikaten pro Probe durch.
    2. Pelletieren Sie 5 ×10 5 B2M TdTomato K-562 Zellen pro Röhrchen und nukleofektieren Sie sie mit der Plasmidmischung (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl zuvor erwärmtem RPMI-1640 Säugetierzellkulturmedium und legen Sie sie zurück in den Inkubator.

4. Analyse der Transkriptionsaktivität des Zielgens im Zeitverlauf

  1. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um den Prozentsatz der stillgelegten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung der ETRs zu messen (Abbildung 4). Verwenden Sie Wildtyp-Zellen (WT-Zellen), die nicht die Fluorophor-kodierende Sequenz tragen, um den Schwellenwert für reporternegative Zellen festzulegen. Verwenden Sie die simulierte Probe, um das Gate für reporterpositive Zellen festzulegen.
    HINWEIS: Wie in Schritt 1.3 vorgeschlagen, schließen Sie eine genetische Störungskontrolle in das Experiment ein. Dies kann nützlich sein, um sowohl die Effizienz der CRISPR-Verabreichung als auch die Fitness von Zellen zu überwachen, denen das Zielgen entzogen wurde. Der Verlust sowohl des transkriptionellen Silencings als auch der genetischen Störung im Laufe der Zeit kann auf die Wesentlichkeit des Zielgens im Zelltyp der Wahl zurückgeführt werden. Beziehen Sie sowohl kurze (Tag 3, Tag 7, Tag 10) als auch langfristige (Tag 21, Tag 35) Zeitpunkte ein, um einen Hinweis auf die akute und langfristige Effizienz der Stilllegung zu erhalten.
  2. Identifizieren Sie die drei wichtigsten gRNAs in Bezug auf die langfristige Silencing-Effizienz. Verwenden Sie FACS, um die reporternegative Subpopulation auszuwählen, die in diesen Stichproben stabil gehalten wird. Führen Sie außerdem eine FACS der probebehandelten Massenproben durch, um sie unter der gleichen Behandlung wie die Testproben zu halten, um einen ordnungsgemäßen Vergleich in den nachfolgenden Analysen zu ermöglichen.

5. Evaluierung der Spezifität der ETR-Behandlung mittels RNA-seq und methylierter DNA-Immunpräzipitation (MeDIP)-seq

  1. Verwenden Sie RNA-seq, um eine mögliche genomweite transkriptionelle Deregulation bei der ETR-Verabreichung zu bewerten.
    1. Extrahieren Sie sowohl für die von Reportern stillgelegte Subpopulation der Proben, die mit den drei leistungsstärksten gRNAs behandelt wurden, als auch für die simulierten Zellen die RNA mit kommerziell erhältlichen Kits. Beurteilen Sie die Qualität und Konzentration der RNA unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits.
    2. Führen Sie RNA-Fragmentierung, Retrotranskription und Bibliotheksvorbereitung mit handelsüblichen Kits für die Herstellung von RNA-seq-Bibliotheken durch (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    3. Führen Sie die Quantifizierung und Qualitätskontrolle von Bibliotheken mit Qualitätskontrollinstrumenten durch, die mit Next-Generation-Sequencing und digitaler Elektrophorese kompatibel sind.
    4. Sequenzbibliotheken auf einem Sequenzer der nächsten Generation gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit einem 100-bp-Paired-End-Protokoll und dem Ziel von durchschnittlich 45 Mio. Lesevorgängen pro Probe.
    5. Richten Sie gelesene Tags auf das entsprechende Referenzgenom aus und quantifizieren Sie die Transkriptexpression. Führen Sie ein Alignment der tdTomato-Sequenz durch und quantifizieren Sie sie separat.
      HINWEIS: Hier wird der STAR-Aligner (v 2.3.0)43 mit Standardparametern verwendet, der an das Rsubread-Paket44 gekoppelt ist.
    6. Führen Sie eine Analyse der RNA-seq-Daten gemäß den veröffentlichten Best Practicesdurch 45.
      HINWEIS: Hier wird das R/Bioconductor-Paket edgeR46 verwendet, bei dem ein Filter von mindestens einer Anzahl pro Million (cpm) in mindestens drei Proben angewendet wird, um niedrig exprimierte Gene zu verwerfen. Alternativ kann die Funktion filterByExpr in edgeR verwendet werden.
    7. Evaluierung der differentiellen Genexpression unter Verwendung eines negativen binomialen verallgemeinerten logarithmisch-linearen Modells, das edgeR (function glmFit)47 implementiert. Legen Sie einen Schwellenwert von 0,01 für angepasste p-Werte fest (Benjamini-Hochberg [BH]-Korrektur), um differentiell regulierte Gene beizubehalten.
  2. Evaluierung einer eventuellen Off-Target-CpG-Methylierungsaktivität der ETRs mittels MeDIP-seq.
    1. Extrahieren Sie sowohl für die mit den drei besten gRNAs behandelte Subpopulation der mit Reportern stillgelegten Subpopulation der Proben als auch für die simulierten Zellen genomische DNA mit handelsüblichen Kits (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    2. Beschallung von 500 ng genomischer DNA mit einem Ultraschallgerät und den folgenden Parametern: Zoll: 20 %; PIP: 175; Zyklen pro Burst: 200; Dauer: 40 s.
    3. Bereiten Sie Sequenzierungsbibliotheken mit den handelsüblichen Kits für MeDIP-seq vor (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    4. Nach dem Schritt der Adapterligation werden die Bibliotheken durch fluorometrischen Assay quantifiziert und die Ligationseffizienz mittels qPCR unter Verwendung handelsüblicher Bibliotheksquantifizierungskits (gemäß den Anweisungen des Herstellers) überprüft.
    5. Erhalten Sie Bibliothekspools, indem Sie zufällig ausgewählte Bibliotheken mischen, um technische Verzerrungen zu reduzieren. Verwenden Sie für jede Bibliothek eine gleiche Bibliotheksmenge (ng), um die Pools auszugleichen. Zu jedem Pool wird die im Kit enthaltene methylierte und unmethylierte Spike-in-Kontroll-DNA hinzugefügt. Bewahren Sie zu Kontrollzwecken ein Volumen von 10 % der Bibliothek auf, das als "Input" gekennzeichnet und nicht immunpräzipitiert ist. Die restlichen 90 % der Bibliothek werden mit dem monoklonalen Antikörper gegen 5-Methylcytosin immunpräzipitiert, der im MeDIP-seq-Kit enthalten ist.
    6. Reinigen Sie angereicherte Bibliotheken und Eingabebibliotheken unter Verwendung der Kits für die Aufreinigung des 5-Methylcytosin-Immunpräzipitationsprodukts gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    7. Bewerten Sie die Anreicherungseffizienz, indem Sie eine quantitative Echtzeit-PCR des internen Spikes in den Kontrollen unter Verwendung der mit dem Kit gelieferten Primer durchführen. Berechnen Sie für jede Immunpräzipitation (IP) die Anreicherungsspezifität aus der Gewinnung von methylierter und unmethylierter DNA unter Verwendung der Zyklusschwellenwerte (Ct) von MeDIP und der aus der qPCR-Reaktion erhaltenen Eingangsfraktionen (siehe Gleichungen 1 und 2):
      figure-protocol-1 (1)
      figure-protocol-2 (2)
      HINWEIS: Betrachten Sie IP-Bibliotheken als erfolgreich, wenn die Spezifitätswerte ≥0,95 betragen.
    8. Amplifizieren Sie die Bibliotheken mit MeDIP-seq-Bibliotheksvorbereitungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers und führen Sie eine Quantifizierungs- und Bibliotheksgrößenverteilungsanalyse des Produkts durch.
    9. Führen Sie die Bibliothekssequenzierung auf Sequenzern der nächsten Generation durch. Verwenden Sie die Paired-End-Sequenzierung mit einer Leselänge von 100 bp und einem Durchschnitt von 30 Mio. Lesevorgängen pro Probe.
    10. Richten Sie die Sequenzierungs-Read-Tags mit bwa (v 0.7.5 oder höher)48 auf das entsprechende Referenzgenom (z. B. hg38) aus und identifizieren Sie dann Peaks mit MACS (v 2.0.10 oder höher)49, was die Identifizierung breiter Peaks ermöglicht (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Erstellen Sie einen gemeinsamen Satz von Regionen aus verschiedenen Stichproben mit dem Multiintersection-Tool50 von BEDTools, indem Sie die Clustering-Option aktivieren.
    12. Berechnen Sie die Abdeckung pro Stichprobe über die endgültige Regionsliste mit dem Multicov von BEDTools, wobei doppelte Lesevorgänge verworfen werden.
    13. Führen Sie eine Analyse der Matrixanzahl mit edgeR durch. Wenden Sie einen Filter von mindestens einer Anzahl pro Million (cpm) auf mindestens drei Proben an, um niedrig angereicherte Bereiche zu verwerfen.
      HINWEIS: Alternativ kann die Funktion filterByExpr in edgeR verwendet werden.
    14. Identifizieren Sie die differentielle Methylierung, indem Sie das in edgeR implementierte verallgemeinerte logarithmlineare Modell (Funktion glmFit) übernehmen und mit der bedingten Quantilnormalisierung51 normalisieren, um den regionsweisen GC-Gehalt zu korrigieren. Wählen Sie differentiell methylierte Regionen aus, indem Sie einen Schwellenwert von 0,01 auf BH-adjustierte p-Werte anwenden. Führen Sie die Analyse der wiederholten Sequenzen wie folgt durch.
      HINWEIS: Die vollständige Liste der Optionen und Parameter (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html) finden Sie im edgeR-Benutzerhandbuch.
      1. Filtern Sie MeDIP-seq-Ergebnisse nach einem nominalen p-Wert <0,01 und erstellen Sie zwei Gruppen von Regionen: Wählen Sie Regionen mit logFC >1 im ersten Satz und Regionen mit logFC <-1 im zweiten Satz aus.
      2. Rufen Sie die RepeatMmasker-Annotation für das ausgewählte Genom als Bettdatei ab, und zählen Sie die Anzahl der Elemente in jedem Satz. Konvertieren Sie die Anzahl als Verhältnis zur Anzahl der Regionen für jedes Dataset.
      3. Extrahieren Sie das Verhältnis des Methyloms, das jede Klasse von Wiederholungen überlappt, und führen Sie einen Chi-Quadrat-Test durch, um eine signifikante Anreicherung zu erkennen.
  3. Es wird untersucht, ob differentiell transkribierte oder differentiell methylierte Regionen zwischen ETR- und Mock-behandelten Proben einer in silico vorhergesagten Off-Target-gRNA-Bindung entsprechen.
    1. Verwenden Sie die CRISPR-Designsuite52 als Off-Target-Werkzeug zur Vorhersage der gRNA-Bindung.
    2. Schauen Sie sich für jede vermeintliche Off-Target-Region die nächstgelegene Transkriptionsstartstelle (TSS) und die nächstgelegene methylierte Region an. Betrachten Sie als echten Off-Target-Effekt eine Region, die entweder mit einem Gen assoziiert ist, das mit FDR <0,01 reguliert wird und einen Abstand zu TSS von weniger als 10 Kb aufweist, oder eine methylierte Region, die mit FDR <0,01 reguliert wird und eine Entfernung von weniger als 1 Kb aufweist.
    3. Identifizieren Sie die Anzahl und die Merkmale der Regionen, die transkriptionell verändert oder übermethyliert sind, in Proben, die mit jeder der drei leistungsstärksten gRNAs behandelt wurden, im Vergleich zu simulierten Proben (Abbildung 5), um die spezifischste unter den gRNAs zu identifizieren. Ordnen Sie die potenziellen Auswirkungen einer Off-Target-Stelle auf die Physiologie der Zielzellen in der folgenden Reihenfolge ein (von den am stärksten betroffenen bis zu den weniger belastenden):
      i) Intragenisches, regulatorisch regionenphysiologisch exprimiertes Gen
      ii) Intragenisches, exonisches Region-physiologisch exprimiertes Gen
      iii) Intragenisches, intronisch regionenphysiologisch exprimiertes Gen
      iv) Intragenisches, regulatorisches Region-nicht exprimiertes Gen
      v) Intragene, exonische Region - nicht exprimiertes Gen
      vi) Intragenisches, intronisches Region-nicht exprimiertes Gen
      vii) Intergene Region

Ergebnisse

Nach Abgabe eines Donor-Templates für die homologe Rekombinations-vermittelte Integration des fluoreszierenden Reporters in den Ziellocus gekoppelt mit dem CRISPR/Cas9-System (z. B. durch Plasmidnukleofektion im Fall von K-562-Zellen) erscheinen in der behandelten Probe reporterpositive Zellen (Abbildung 1, unten). Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie erneut die Genauigkeit des Designs und der Klonierung sowohl der Donor-Vorlage als auch der CRISPR/Cas9-Reagenzien. Wenn dies bestätigt wird, versuchen Sie, die Dosen der Reagenzien und das Verabreichungsprotokoll selbst zu optimieren.

Sobald die Reporterzelllinie erhalten ist, wählen Sie Promotor-/Enhancer-Sequenzen des Zielgens aus und entwerfen Sie ein Panel passender gRNAs. Verwenden Sie In-silico-Vorhersagetools wie Chopchop, um die gRNA-Sequenzen zu identifizieren und sie in Bezug auf die vorhergesagte Effizienz und Spezifität zu bewerten (Abbildung 2). Wenn keine gRNAs gewonnen werden, kontrollieren Sie das Vorhandensein des kanonischen Cas9-Protospacer-Nachbarmotivs (PAM) (5'-NGG-3') in der Zielsequenz. Wenn keine PAM-Sequenzen vorhanden sind, sollten Sie entweder auf ETRs umsteigen, die auf alternativen PAM-unabhängigen Cas9-Varianten basieren (es wurden noch keine ETRs mit diesen Varianten veröffentlicht) oder auf alternative DNA-Bindungsdomänenplattformen wie ZFPs53 oder TALEs30 umsteigen. Wenn jedoch nur gRNAs mit geringer vorhergesagter Wirksamkeit/Spezifität gewonnen werden, sollten Sie entweder 1) diese minderwertigen gRNAs testen oder 2) die Ziel-DNA-Sequenz erweitern, um nach besseren gRNAs zu suchen. Nach der vorübergehenden Verabreichung der dreifachen ETR-Kombination (oder CRISPRoff; v2.1) zusammen mit gRNAs werden longitudinale Durchflusszytometrie-Analysen für die Expression des fluoreszierenden Reporters durchgeführt, wobei bei akuten Analysen häufig ein Höhepunkt der Reporterrepression beobachtet wird, der dann aufgrund der mitotischen Verdünnung der ETR-kodierenden Plasmide im Laufe der Zeit zumindest teilweise resorbiert wird (Abbildung 4C). Wenn die ETRs/gRNA-Kombination die CpG-Methylierung effektiv auf dem Zielort ablagert, kommt es in einem beträchtlichen Teil der behandelten Zellen zu einer dauerhaften Unterdrückung des Reporters (Abbildung 4C). Verschiedene gRNAs können eine unterschiedliche Langzeit-Silencing-Effizienz aufweisen (Abbildung 4B,C).

Für genomweite Spezifitätsbewertungen verwenden Sie MeDIP-seq, um die unterschiedlich methylierten Regionen zwischen Zellen zu identifizieren, in denen das Ziel langfristig stillgelegte und unbehandelte Zellen waren. Im Idealfall induziert eine hochspezifische gRNA nur einen Peak der de novo CpG-Methylierung an der Zielstelle (Abbildung 5). Wenn nicht, kann man in Betracht ziehen, die Off-Target-Aktivität der gRNAs zu charakterisieren, die in der On-Target-Effizienzliste an einer niedrigeren Position stehen.

figure-results-1
Abbildung 1: Integration eines tdTomato-Reporters unter die regulatorischen Elemente des humanen B2M-Gens durch homologiegesteuerte Reparatur. Oben: Schematische Darstellung der Strategie zur Integration eines tdTomato-Fluoreszenzreporters in das erste Intron des humanen B2M-Gens durch CRISPR/Cas9-induzierte homologiegerichtete Reparatur. Unten: repräsentative Punktdiagramme von K-562-Zellen vor und nach der Integration des tdTomato-Reporters in das erste Intron des B2M-Gens . Abkürzungen: HA = Homologiearm; HDR = Homologie-gerichtete Reparatur; IRES = interne Ribosomeneintrittsstelle; pa = BGH poly(A); SA = Standort des Spleißakzeptors; WT = Wildtyp; 3XSTOP = drei Tandem-Stopp-Codons. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: In-silico-Identifizierung von gRNAs, die auf die CpG-Insel des B2M-Gens abzielen, eingestuft nach vorhergesagter Effizienz und Spezifität. Die Ausgabeschnittstelle von Chopchop zeigt gRNAs, die auf die CpG-Insel abzielen, die in die Promotorsequenz des B2M-Gens eingebettet ist, und wird sowohl für die Anzahl der Off-Target-Sequenzen mit 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) oder 3 (MM3) Fehlanpassungen als auch für die vorhergesagte On-Target-Effizienz eingestuft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Klonierung und Array-Nukleofektion von gRNAs für dCas9 ETR-vermitteltes epigenetisches Silencing. Oben: Oligo-vermittelte Protospacer-Klonierung in einem humanen U6-gRNA-exprimierenden Plasmid. Unten: Array-Screening von B2M-Targeting-gRNAs für CRISPR/dCas9-basiertes epigenetisches Silencing durch Plasmidnukleofektion in K-562 B 2M/tdTomato-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Screening auf gRNAs, die effektiv eine langfristige Stilllegung des B2M-Gens induzieren. (A) Oben: Schematische Darstellung des B2M-tdTomato-Gens im vergrößerten Bereich, die relative Reihenfolge und Orientierung der Bindung von dCas9-basierten ETRs, die mit gRNAs komplexiert sind. Unten: repräsentative Punktdiagramme vonB2M tdTomato K-562-Zellen entweder vor (links) oder nach (rechts) ETR-Silencing. Analysen 30 Tage nach der Transfektion mit Plasmiden, die für die gRNAs und die dreifache Kombination dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L kodieren. (B) Silencing-Aktivität der angezeigten gRNAs (entweder in Pools oder als einzelne gRNAs), die auf die CpG-Insel von B2M abzielen (rote Pfeile im oberen Schema zeigen die Orientierung der gRNAs an) in K-562 B2M tdTomato Zellen am Tag 30 nach der Transfektion. Die Daten zeigen den prozentualen Anteil tdTomato-negativer Zellen (Mittelwert ± SEM; n = vier unabhängige Transfektionen für jede Behandlungsbedingung). (C) Zeitverlaufsanalyse von B2MtdTomato K-562-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden, die die Dreifach-ETR-Kombination exprimieren, und den indizierten B2M-CpG-Insel-Targeting-gRNAs oder Mock (gRNA- und ETR-freie Transfektion). Die Daten zeigen den prozentualen Anteil an tdTomato-negativen Zellen (Mittelwert ± SEM; n = drei unabhängige Transfektionen für jede Behandlungsbedingung). Unveröffentlichte Daten. Die Panels A und B wurden von Amabile et al.30 übernommen. Abkürzungen: CGI = CpG-Insel; IRES = interne Ribosomeneintrittsstelle; pa = BGH poly(A); SA = Standort des Spleißakzeptors; SD = Spleißspenderstelle; TSS = Startstelle der Transkription; UT = nicht transfiziert; 3XSTOP = 3 Tandem-Stopp-Codons. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Genomweite Analyse der ETR-Spezifität mittels RNA-seq und mittels MeDIP-seq. Links: Vergleich der Expressionsniveaus in simuliert behandeltenB2M tdTomato K-562 Zellen und Zellen, die mit der dreifachen Kombination dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR und mit einer gRNA behandelt wurden, die auf die CpG-Insel des B2M-Gens abzielt. Die Werte werden in log2 der Lesevorgänge pro Kilobase pro Million (RPKM) der zugeordneten Lesevorgänge ausgedrückt. Schwarze Punkte stellen Gene dar, die unter allen Bedingungen auf vergleichbarem Niveau exprimiert werden. gelbe Kreise stellen Gene dar, die unter einem FDR <0,01 unterschiedlich reguliert werden; Der rote Kreis steht für das B2M-IRES-tdTomato-Transkript. Oben rechts: Circos-Diagramm mit MeDIP-seq-Profilen des gesamten Genoms von nachgeahmten B2M-tdTomato-K-562-Zellen (blau) oder Zellen, die mit der dreifachen Kombination dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR und mit einer gRNA behandelt wurden, die auf die CpG-Insel (CGI) des B2M-Gens abzielt (grün). Unten rechts: Der Methylierungsstatus desB2M-tdTomato-Locus in den angegebenen Proben ist dargestellt. In jedem Pileup werden drei Replikate dargestellt. Die Anhäufung von ausgerichteten Reads wurde mithilfe eines Gaußschen Fensters geglättet. Diese Abbildung wurde von Amabile et al.30 übernommen. Abkürzung: TSS = Transkriptionsstartstelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Gezieltes epigenetisches Silencing kann eine vielversprechende Lösung zur Behandlung von Erkrankungen darstellen, die von einer dauerhaften Geninaktivierung profitieren können, einschließlich Krankheiten, die durch Gain-of-Function-Mutationen1 verursacht werden, Infektionskrankheiten2 und Pathologien, bei denen die Stilllegung eines Gens entweder einen erblichen Defekt in einem anderen Gen kompensieren kann3 oder das volle Potenzial adoptiver Zelltherapien freisetzenkann 4. 5. Anmelden Durch die Wirkung auf Chromatinebene und die Autovermehrung durch die Zelle 7,30,32 kann epigenetisches Silencing toxische Veränderungen (z. B. chromosomale Umlagerungen) der DNA-Sequenz des Zielgens und partielles, vorübergehendes Silencing des Ziels vermeiden, die Einschränkungen der künstlichen Nuklease-basierten Genstörung8,34,35 bzw. RNAi-basierter Knockdown 33 sind.

Einer der wichtigsten vorbereitenden Schritte in jedem epigenetischen Silencing-Protokoll besteht darin, die richtige Position auf dem Zielgen zu identifizieren, um die ETRs zu steuern, die die repressiven epigenetischen Markierungen hinterlassen, die notwendig sind, um die Transkriptionsaktivität des Ziels auszuschalten. Unterschiedliche transkriptionelle Startstellen-proximale und -distale regulatorische Elemente können zusammenwirken, um die Transkriptionsleistung eines gegebenen menschlichen Genszu unterstützen 54. Darüber hinaus können dank der wachsenden Anzahl programmierbarer DNA-Bindungstechnologien nun unterschiedliche Zielorte pro spezifischem regulatorischem Element identifiziert werden6. Daher können Protokolle, wie das hier beschriebene in gentechnisch veränderten Zelllinien, verwendet werden, um einzelne Zielorte und/oder genomische Regionen zu nominieren, die für ETR-vermitteltes epigenetisches Silencing zugänglich sind, bevor man sich auf die umständliche und zeitaufwändige Bewertung der besten Kandidaten in der endgültigen therapeutischen Umgebung einlässt. Einige kritische Aspekte des Protokolls werden im Folgenden näher beschrieben.

Entwicklung einer Reporterzelllinie, die das endgültige therapeutische Ziel vorhersagt
Trotz der ständigen Optimierung der Cell-Engineering-Protokolle, die hier erforderlich sind, um die für den Fluoreszenzreporter kodierende Kassette in das Zielgen einzufügen und die ETRs zu liefern, kann nicht davon ausgegangen werden, dass sie bereits für die Zelllinie verfügbar sind, die dem endgültigen therapeutischen Ziel am ähnlichsten ist. In diesem Fall können verschiedene Minderungsstrategien angewendet werden: a) Nutzung von Optimierungskits, die von Anbietern zur Verfügung gestellt werden, um das Transfektionsprotokoll für die Zielzelllinie intern zu optimieren; b) Wechsel zu anderen Zelllinien, die immer noch dieses Zielgen exprimieren, aber zu anderen Geweben als dem endgültigen therapeutischen Ziel gehören - für die die technischen Protokolle umfassend optimiert wurden. Falls diese Optionen nicht verfügbar sind, kann man in Betracht ziehen, auf primäre Zelltypen oder Organoide umzusteigen, die das endgültige Ziel darstellen. Als generelle Überlegung sowohl für präklinische Studien als auch für therapeutische Anwendungen des ETR-basierten epigenetischen Silencings sollten Szenarien, in denen das Zielgen für den Zielzelltyp essentiell ist, verworfen werden. Die vollständige, langfristige Stilllegung eines essentiellen Gens, das durch die ETRs auferlegt wird, führt im Laufe der Zeit zu einer Gegenselektion der Zielzellen (und möglicherweise zu einer Toxizität der Behandlung). Alternative Technologien, die eine partielle Target-Abrogation ermöglichen, wie RNAi33, werden in diesen Fällen bevorzugt.

Evaluierung der zielgerichteten Silencing-Aktivität der ETRs
ETRs, die auf der Kombination von KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-Effektordomänen basieren, haben sich als wirksam gegen die große Mehrheit der proteinkodierenden Gene erwiesen, mit einem breiten permissiven Zielfenster von etwa 1 Kilobase lang, das auf der Transkriptionsstartstelle zentriertist 32. Um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie ein gut durchgeführtes epigenetisches Silencing-Experiment aussieht, werden hier die technischen Details und Ergebnisse der Stummschaltung des B2M-Gens in K-562-Zellen vorgestellt. Dies kann als eine wichtige Positivkontrolle angesehen werden, die nicht nur von Forschern, die mit K-562-Zellen arbeiten, einbezogen werden sollte, sondern auch von denen, die sich zum ersten Mal der ETR-basierten Technologie nähern. Wie im Protokoll angegeben, wird eine künstliche Nuklease (z. B. CRISPR/Cas9)-basierte Genstörung als zusätzliche Kontrolle sowohl der Effizienz der Genübertragung in dem interessierenden Zelltyp als auch des Phänotyps von Zellen, denen das Zielgen entzogen wurde, empfohlen. Wenn nach dem anfänglichen Screening der zu koppelnden gRNAs mit den CRISPR/dCas9-basierten ETRs keine der getesteten gRNAs in der Lage ist, das Zielgen dauerhaft zum Schweigen zu bringen, sollte man in der folgenden Reihenfolge in Betracht ziehen: 1) Erhöhung der Menge der abgegebenen gRNAs und ETRs; 2) Testpools der Top-gRNAs auf der Suche nach synergistischen Effekten zwischen ihnen. Wenn ein langfristiges Silencing immer noch nicht erreicht ist, sollte man Folgendes in Betracht ziehen: 3) das Testen zusätzlicher gRNAs, die möglicherweise auf Stellen abzielen, die für die Anweisung des epigenetischen Silencings relevanter sind; 4) Umstellung auf ZFP8- oder TALE9-basierte DBD-Plattformen, die möglicherweise eine verbesserte Bindungskapazität an das Zielchromatin aufweisen; 5) Umschaltung von transient auf stabil – z.B. Integration der viralen vektorbasierten Expression der ETRs (entweder der gRNA oder der dCas9-Fusionskonstrukte oder beides bei Anwendung der CRISPR/dCas9-Technologie). Da unsere Gruppe die gemeinsame Bereitstellung der drei separaten ETRs30 entwickelt hat und über solide Erfahrungen damit verfügt, basieren das Protokoll und die hier gezeigten Ergebnisse auf diesem Ansatz. Ein ähnlicher konzeptioneller Arbeitsablauf kann jedoch wahrscheinlich für ein All-in-One-CRISPR-basiertes System32 angewendet werden.

Evaluierung der Off-Target-Aktivität der ETRs
Mehrere Studien haben vorläufige Indikationen für die Spezifität von ETRs gezeigt, die auf der Kombination von KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-Effektordomänen basieren30,31,32. Wenn jedoch keine der getesteten gRNAs ein zufriedenstellendes Spezifitätsprofil in Bezug auf die Transkriptionsregulation und/oder die De-novo-DNA-Methylierung aufweist, kann man zwei sich nicht gegenseitig ausschließende Strategien verfolgen: a) Verkürzung der Verweilzeit der ETRs in der Zelle (und damit ihrer potenziellen Off-Target-Aktivität), indem entweder die Dosen der ETRs verringert oder alternative Verabreichungssysteme getestet werden. Im Vergleich zu Plasmiden wird beispielsweise erwartet, dass sowohl die mRNA- als auch die Proteinabgabe die Zellexpositionszeit gegenüber den ETRs und damit die Wahrscheinlichkeit einer Off-Target-Aktivität verringern55; b) Umschalten auf neuere Cas9-Varianten, die optimiert sind, um die Off-Target-Bindung der Plattform56 zu reduzieren, oder auf alternative ZFP8- oder TALE9-basierte DNA-Bindungstechnologien. Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass im Vergleich zu simulierten Proben die On-Target- und die Off-Target-Aktivität des Gen-Silencings nicht nur durch die Bindung der DBD an ihre Zielsequenz beeinflusst werden, sondern auch durch die potenzielle Fähigkeit der epigenetischen Effektordomänen, durch ihre natürlichen, endogenen Cofaktoren an andere Loci rekrutiert zu werden. Daher kann eine Verkürzung der Verweilzeit der ETRs in der Zielzelle nicht nur die Wahrscheinlichkeit einer Bindung der DBD an Off-Target-Stellen verringern, sondern auch die Wahrscheinlichkeit, dass die ETRs mit endogenen Cofaktoren interagieren, mit potenziellen Vorteilen in Bezug auf Spezifität und Nachteilen in Bezug auf die On-Target-Aktivität. Schließlich können im Vergleich zu simulierten Proben einige der transkriptionellen und weniger wahrscheinlichen CpG-Methylierungsveränderungen, die in stillgelegten Zellen gemessen wurden, einfach durch den Entzug des Zielgens abgeleitet werden. Diese werden nicht als Off-Targets der Silencing-Technologie betrachtet. Um sie zu identifizieren, sollte man auch die Genstörung durch künstliche Nuklease in das experimentelle Panel einbeziehen 8,9,10. Biologische Veränderungen, die auf den funktionellen Verlust des Zielgens zurückzuführen sind, werden zwischen epigenetischem Silencing und dieser alternativen Technologie geteilt.

Offenlegungen

AL ist Mitbegründer, Quoteninhaber und Berater von Chroma Medicine, Inc.

Danksagungen

Die Autoren danken Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica und Deborah Cipria für die Zusammenarbeit bei der Entwicklung der epigenetischen Silencing-Technologie im Laufe der Jahre. Dejan Lazarevic und Francesca Giannese für die kritische Überprüfung der im Protokoll beschriebenen RNA-seq- und MeDIP-seq-Analysen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an A.L. von der Telethon Foundation (TIGET Grant Nr. F1) und dem EU Horizon 2020 Programm (UPGRADE) unterstützt. Die Illustrationen wurden mit BioRender.com erstellt.

BEITRAG DER AUTOREN
A.M., M.A.C., F.G. und A.C. trugen zur Gestaltung des Protokolls und zum Schreiben des Manuskripts bei; S.V., I.M. und D.C. entwarfen die bioinformatischen Abschnitte des Protokolls und überarbeiteten das Manuskript; A.M. und A.L. entwarfen das Protokoll, konzipierten und schrieben das Manuskript mit dem Input aller Autoren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4200 TapeStation SystemAgilentG2991BADNA-Quantifizierung
4D-Nucleofector X UnitLonza Bioscience AAF-1003XNukleofektion
B2M zur Stummschaltung von gRNA #1   Lombardos Labor GCAATCAGGACAAGGCCCGCGen-Silencing
B2M-Silencing gRNA #2  Lombardos Labor GGGGTAGGAGAGACTCACGCGen-Silencing
B2M-Silencing gRNA #3  Lombardos Labor GAGTCCAGGGCTGGATCTCGGen-Silencing
BD FACSAria Fusion DurchflusszytometerBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusionFluoreszenzaktivierte Zellsortierung
BedtoolsBedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Verarbeitung genomischer Intervalle
bwaIh3https://github.com/lh3/bwaAusrichtung des MeDIP-seq lautet
Chopchop Das Labor von Valen http://chopchop.cbu.uib.no/gRNA-Auswahlsoftware
Corning  RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x mit L-GlutaminCorning10-040-CVZellkultur
cqnBioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.htmlRegionweise Normalisierung durch GC-Gehalt
CRISPR Design SuiteZhangs Laborhttps://zlab.bio/resources-2Off-Target-gRNA-Bindungsvorhersage 
CRISPRoff-v2.1 PlasmidAddgen 167981Gen-Silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Durchflusszytometer Beckman CoulterC01161Durchflusszytometrie
Spender-Template-Sequenz für die Integration von tdTomato in das erste Intron des B2M-Gens  Lombardos Labor 

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Gentechnik
E220 Fokussierter UltraschallgerätCovaris500239DNA-Beschallung
edgeRBioleiterhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.htmlDifferentielle Abundanztests
EnGen Mutation Detection KitNEBE3321Quantifizierung von Genstörungen
Fötales RinderserumSigma-AldrichF2442Zellkultur
FlowjoBD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjoDatenanalysesoftware
für DurchflusszytometrieGel Loading Dye, Purple (6x)NEBB7024SDNA-Gel-Loading
Go Taq G2 Hot Start DNA-PolymerasePromegaM7401PCR-Amplifikation
gRNA-Sequenz für die dTomato-Integration im ersten Intron des B2M-Gens  Lombardos Labor AGGCTACTAGCCCCATCAAGGentechnik
hCas9 PlasmidAddgen 41815Gentechnik
Hochempfindliche D1000 ReagenzienAgilent5067-5585DNA-Quantifizierung
Hohe Empfindlichkeit D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584DNA-Quantifizierung
Hochempfindliche RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA-Quantifizierung
Hochempfindliche RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581RNA-Quantifizierung
Hochempfindlicher RNA-ScreenTape-ProbenpufferAgilent5067-5580RNA-Quantifizierung
IPure-KitDiagenodeC03010011 Aufreinigung des Immunpräzipitationsprodukts 5-Methylcytosin
K-562-ZellenATCCCCL-243Cell Engineering
KAPA Library Quantification KitRocheKK4824Vorbereitung der MeDIP-Seq-Bibliotheken
MACS2Taoliuhttps://github.com/macs3-project/MACSIdentifizierung von methylangereicherten Regionen
MagMeDIP-KitDiagenodeC02010020 5-Methylcytosin-Immunpräzipitation
NextFlex Methylseq Kit 1 Bioo Scientific5118-01Vorbereitung von MeDIP-Seq-Bibliotheken
NextSeq 500 / NovaSeq 6000IlluminaSY-415-1002 / 20012850Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi Kit für Plasmid-DNA in TransfektionsqualitätMacherey-nagel740410.50Midiprep Plasmidvorbereitung
One Shot TOP10 Chemisch kompetente Zellen ThermoFisherC404010Plasmidtransformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression PlasmidAddgen 48240Genaktivierung
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB-Plasmid  Lombardos Labor auf Anfrage erhältlich (lombardo.angelo@hsr.it)Gen-Silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB-PlasmidLombardos Labor auf Anfrage erhältlich (lombardo.angelo@hsr.it)Gen-Silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB-Plasmid  Lombardos Labor auf Anfrage erhältlich (lombardo.angelo@hsr.it)Gen-Silencing
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781Zellkultur
phU6.sgRNA PlasmidAddgen 53188Gentechnik
PowerPac Basic Power SupplyBiorad1645050Agarose-Gelelektrophorese
Primer Vorwärtssequenz zur Überprüfung der tdTomato-Integration im ersten Intron des B2M-Gens  Lombardos Labor GTATTTGCTGGTTATGTTAGGentechnik
Primer-Reverse-Sequenz zur Überprüfung der tdTomato-Integration im ersten Intron des B2M-Gens  Lombardos Labor AATGGTTGAGTTGGACGentechnik
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen51304DNA-Extraktion
QubitThermo FisherQ33238DNA-Quantifizierung
Qubit dsDNA HS (hohe Empfindlichkeit) Assay KitThermo FisherQ32851DNA-Quantifizierung
Qubit RNA HS (hohe Empfindlichkeit) Assay KitThermo FisherQ32852RNA-Quantifizierung
RestriktionsenzymeNEBDNA-Verdau
RNeasy Mini Bausatz Qiagen74106RNA-Extraktion
RsubreadBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.htmlQuantifizierung der Genexpression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT)Lonza Bioscience V4XC-2032Nukleofektion
SnapGeneDotmaticsDesignsoftware für Molekularbiologie
STARAlexander Dobinhttps://github.com/alexdobin/STARAusrichtung der RNA-seq-Reads
T100 Thermal CyclerBiorad1861096 PCR-Amplifikation
T4-DNA-LigasePromegaM1801DNA-Ligation
TAE BufferFisher wissenschaftlicheBP1332500Agarose-Gelelektrophorese
TruSeq Stranded Total RNA Kit Vorbereitung der Illumina20020597RNA-Seq-Bibliothek
UltraPure AgaroseThermoFisher16500500Agarose-Gel 
https://www.snapgene.com/

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