In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Die epigenetische Silencing-Technologie, die wir entwickelt haben, gehört zu einer größeren Arena von Technologien, die Gen-Silencing-Technologien sind. Bevor wir anfingen, den Bedarf an epigenetischem Silencing zu entwickeln, gab es zwei Alternativen auf diesem Gebiet. Das eine ist der Gen-Knock-down durch RNA-Interferenz und das andere war die Genstörung durch künstliche Nukleasen.

Und die Genstörung durch künstliche Nukleasen funktioniert auf DNA-Ebene. Sie haben also Ihr Zielgen, das Sie inaktivieren möchten, und Sie liefern der Zelle einige künstliche Nukleasen, die einen doppelten Fadenbruch induzieren. Diese Art von doppeltem String-Break kann die Degenerationssumme, die Frameshift-Mutation, durchführen, die schließlich entweder eine Degeneration des nicht-funktionellen Proteins oder gleichzeitig eine transkriptionelle Degradation verursacht.

Epigenetisches Silencing funktioniert also, indem es die Zelle, sogenannte manipulierte Transkriptionsrepressoren, abgibt. Dabei handelt es sich um einige kleine Proteine, die in der Lage sind, an Ihre Ziel-DNA zu binden und sich dann nur an Ihr Zielgen, den sogenannten epigenetischen Marx, zu binden. Dabei handelt es sich um eine chemische Modifikation, die, sobald sie sich auf der DNA abgelagert hat, zu einer Chromatinverdichtung führen kann.

Die Chromatinverdichtung führt dann zu einer Transkriptionshemmung, so dass Sie die Expression Ihres Zielgens nicht mehr haben. Und sehr wichtig ist, dass diese Art von transkriptionsunterdrückendem Zustand von den Zellen über einen längeren Zeitraum vereint werden kann. Um Zelllinien zu identifizieren, die das Zielgen exprimieren, das stillgelegt werden soll, durchsuchen Sie das Zielgen im Human Protein Atlas und navigieren Sie durch den Abschnitt Zelllinie, um Zelllinien zu identifizieren, die für das interessierende somatische Gewebe repräsentativ sind.

Priorisieren Sie aus den identifizierten Zelllinien diejenigen, für die effiziente transiente Genübertragungsprotokolle verfügbar sind. Öffnen Sie als Nächstes einen Genbetrachter und identifizieren Sie die Region des Zielgens, um die Fluorophor-Expressionskassette zu integrieren. Verwenden Sie dann CHOPCHOP, um GNRA zu identifizieren und auszuwählen, das in der Zielregion im ersten Intron des Beta-2M-Gens schneidet.

Als Nächstes entwerfen Sie eine Spenderschablone für die GNRA-Schnittstelle, bestehend aus einem linken Homologiearm, einer promotorfreien Transgenexpressionskassette und einem rechten Homologiearm. Verabreichen Sie das CRISPR-Cas9-Nukleasesystem und die Spendervorlage gemäß den Anweisungen des Herstellers durch Nukleofektion in die K-562-Zelllinie. Kultivieren Sie die K-562-Zellen mindestens 14 Tage lang.

Überwachen Sie die Expressionsniveaus des fluoreszierenden Reporters im Laufe der Zeit mit einem Durchflusszytometer. Aktivieren Sie den FICO-Etherin-Kanal, um die Fluoreszenzintensität des tdTomato-Reporters zu messen. Durchsuchen Sie das Zielgen im UCSC Genome Browser und extrahieren Sie die Nukleotidsequenz von Regionen, die möglicherweise seine Transkriptionsaktivität regulieren, wie z. B. CpG-Inseln und Stellen, die für die H3K27-Acetylierung angereichert sind.

Fügen Sie die ausgewählten Sequenzen in das CHOPCHOP-Online-Tool ein und wählen Sie die Repression als Zweck der abzurufenden GNRAs aus. CHOPCHOP wird eine Liste von GNRAs bereitstellen, die auf der genetischen Sequenz von Interesse abgebildet und nach einer Punktzahl aufgelistet werden, wobei die Anzahl der Übereinstimmungen außerhalb des Ziels und die prognostizierte On-Target-Effizienz berücksichtigt werden. Wählen Sie mindestens 10 GNRAs pro Zielsequenz aus.

Versuchen Sie, GNRAs auszuwählen, die sich über die gesamte Region erstrecken und integriert werden sollen, ohne dass es zu vollständigen Übereinstimmungen mit anderen intergenen Sequenzen im gesamten Genom kommt. Nach der Transformation der Plasmide, die für das ETRS kodieren, in chemisch kompetente E.coli-Zellen werden die Kolonien durch Restriktionsenzymverdau und Sanger-Sequenzierung auf das Vorhandensein des ETR-tragenden Plasmids untersucht. Um die GNRAs innerhalb des phU6-GNRA-Rückgrats zu klonen, müssen zunächst Oligos mit molekularbiologischer Designsoftware generiert werden.

Hängen Sie eine Sequenz von fünf Nukleotiden stromaufwärts des Proto-Spacers an und markieren Sie dieses 25 Nukleotid lange Oligo. In ähnlicher Weise wird eine Fünf-Nukleotid-Sequenz des umgekehrten Komplements des Proto-Spacers und ein Cytosin stromabwärts davon angehängt, um ein 25 Nukleotid langes Oligo zu erzeugen und es zu markieren. Lassen Sie diese Oligos als salzfreie einzelsträngige DNA-Oligos synthetisieren, die in Wasser bei 100 Mikromolaren resuspendiert werden.

Von jedem Oligo wird ein Mikroliter zu zwei Mikrolitern Glühpuffer und 16 Mikrolitern Wasser gegeben. Führen Sie das Oligoglühen durch, indem Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einen Thermocycler geben. Anschließend über 45 Minuten schrittweise auf 25 Grad Celsius abkühlen lassen.

Verdünnen Sie einen Mikroliter der geglühten Oligos mit 99 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Dann wird ein Mikroliter dieser Verdünnung mit 50 Nanogramm phU6 GNRA-Plasmid ligiert, das zuvor mit dem Bsa1-Restriktionsenzym verdaut wurde. Transformation von 20 Mikrolitern chemisch kompetenter E.coli-Zellen mit zwei Mikrolitern des Ligationsprodukts.

Wählen Sie mehrere Kolonien für die Plasmid-DNA-Produktion aus und bestätigen Sie die erfolgreiche Klonierung des Proto-Spacers durch Sanger-Sequenzierung. Um die auf GNRAs und CRISPR dCas9 basierenden DTRs in der Reporterzelllinie in Array zu verabreichen, werden zunächst separate Röhrchen mit 500 Nanogramm von jedem der Plasmide vorbereitet und 125 Nanogramm verschiedener GNRA-kodierender Plasmide hinzugefügt, die getestet werden sollen. Fügen Sie eine GNRA- und ETR-freie Nukleofektionsbedingung als simulierte Probe hinzu.

Bereiten Sie mindestens drei technische Replikate pro Probe vor. Pelletieren Sie fünfmal 10 bis die fünfte Beta-2M tdTomato K-562-Zelle pro Röhrchen und nukleoffektieren Sie sie mit der Plasmidmischung. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikroliter zuvor erwärmtem RPMI 1640 Säugetierzellkulturmedium und legen Sie sie in den Inkubator.

Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um den Prozentsatz der stillgelegten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung der ETRs zu messen. Verwenden Sie Wildtyp-Zellen ohne die Flora-4-Beschichtungssequenz. Zum Festlegen des Schwellenwerts für Reporter-negative Zellen.

Verwenden Sie die simuliert behandelte Probe, um das Gate für Reporter-positive Zellen festzulegen. Identifizieren Sie die drei wichtigsten GNRAs in Bezug auf die langfristige Stillstandseffizienz. Verwenden Sie Fakten, um die Reporter-negativen Subpopulationen auszuwählen, die in diesen Stichproben stabil gehalten werden.

Führen Sie auch die Fakten der simulierten Proben unter der gleichen Behandlung durch, um einen ordnungsgemäßen Vergleich in nachfolgenden Analysen zu ermöglichen. Ein tdTomato-Fluoreszenzreporter wurde durch CRISPR-Cas9-induzierte tomologiegesteuerte Reparatur in das erste Intron des humanen Beta-2M-Gens integriert. Reporter-positive K-562-Zellen erscheinen nach der Integration in der behandelten Probe.

Nach der vorübergehenden Verabreichung der Dreifach-ETR-Kombination wurde zusammen mit GNRAs eine longitudinale Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt, um die Expression des Fluoreszenzreporters zu beurteilen. Bei akuten Analysen wurde ein Peak in der Reporterrepression beobachtet, die aufgrund der mitotischen Verdünnung der ETR-kodierenden Plasmide im Laufe der Zeit teilweise resorbiert wurde. Die effektive Ablagerung der CpG-Methylierung auf dem Ziellocus durch die GNRA-Kombination des ETR zeigte sich durch permanente Unterdrückung des Reporters in einem beträchtlichen Teil der behandelten Zellen.

Unterschiedliche GNRAs zeigten eine unterschiedliche Langzeit-Silencing-Effizienz. Einer der wichtigsten Schritte auf dem Weg zu einem dauerhaften und effizienten Epigenom-Silencing ist die Identifizierung einer effektiven einzelnen gRNA. Um dies für jede Art von Anwendung zu tun, muss mit der Identifizierung der am besten reagierenden Sequenzen begonnen werden, einschließlich Promotor und Antwort an allen anderen Stellen für Transkriptionsregulatoren.

Sobald identifiziert wurde, welche Region am reaktionsfähigsten und effektivsten sein könnte, sollte jeder eine andere Art von Einzel-gRNA-Test als Einzel- oder Kombinationstest mit Einzel-gRNA entwickeln. Eine der offensichtlichsten Anwendungen der Epigenom-Editierung ist sicherlich die präklinische Translation in jede funktionelle Mutation, bei der das Ausschalten dieses Gens nützlich sein könnte, um bestimmte Krankheiten zu heilen. Alternativ sollten wir trotzdem bedenken, dass die Fähigkeit, die epigenetische Regulation eines bestimmten Promotors spezifisch zu verändern, ein sehr nützliches Werkzeug sowohl für die klinische als auch für die translationale Grundlagenforschung sein könnte.