Methodenartikel

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

DOI:

10.3791/64404

⸱

23. Dezember 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und die Tilapia-Landwirtschaft (Oreochromis spp.) ist die wichtigste Süßwasserfischsorte, die kultiviert wird. Da Aquakulturpraktiken anfällig für mikrobielle Kontamination aus anthropogenen Quellen sind, ist ein umfassender Einsatz von Antibiotika erforderlich, was dazu führt, dass Aquakultursysteme zu einer wichtigen Quelle für antibiotikaresistente und pathogene Bakterien von klinischer Relevanz wie Escherichia coli (E. coli) werden. Hier wurden die antimikrobiellen Resistenz-, Virulenz- und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes, der aus Oreochromis spp. aus Inlandzucht gewonnen wurde, durch Whole-Genom-Sequenzierung (WGS) und In-silico-Analyse aufgeklärt. Antimikrobielle Suszeptibilitätstests (AST) und WGS wurden durchgeführt. Darüber hinaus wurden phylogenetische Gruppe, Serotyp, Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST), erworbene antimikrobielle Resistenz, Virulenz, Plasmid und Prophagengehalt mit verschiedenen verfügbaren Web-Tools bestimmt. Das E. coli-Isolat zeigte nur eine intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und wurde durch WGS-basierte Typisierung als ONT:H21-B1-ST40-Stamm charakterisiert. Obwohl nur ein einziges antimikrobielles Resistenz-assoziiertes Gen nachgewiesen wurde [mdf(A)], wurden mehrere Virulenz-assoziierte Gene (VAGs) aus dem atypischen enteropathogenen E. coli (aEPEC)-Pathotyp identifiziert. Zusätzlich wurde die Ladung von Plasmid-Replicons aus großen Plasmidgruppen und 18 Prophagen-assoziierten Regionen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die WGS-Charakterisierung eines aEPEC-Isolats, das aus einer Fischfarm in Sinaloa, Mexiko, gewonnen wurde, Einblicke in sein pathogenes Potenzial und das mögliche Risiko des Verzehrs roher Aquakulturprodukte für die menschliche Gesundheit ermöglicht. Es ist notwendig, Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zur Untersuchung von Umweltmikroorganismen zu nutzen und einen One-Health-Rahmen zu verabschieden, um zu erfahren, wie Gesundheitsprobleme entstehen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und ihre Produktionspraktiken sollen die steigende Nachfrage nach Nahrungsmitteln für den menschlichen Verzehr befriedigen. Die weltweite Aquakulturproduktion hat sich von 34 Millionen Tonnen (Mt) im Jahr 1997 auf 112 Mt im Jahr 2017 verdreifacht1. Die wichtigsten Artengruppen, die fast 75% der Produktion ausmachten, waren Algen, Karpfen, Muscheln, Wels und Tilapia (Oreochromis spp.) 1. Das Auftreten von Krankheiten, die durch mikrobielle Einheiten verursacht werden, ist jedoch aufgrund der intensiven Fischzucht ....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ANMERKUNG: Der E. coli-Stamm ACM5 wurde durch Verarbeitung und Kultivierung der Fischprobe für die Bestimmung der fäkalcoliformen (FC) gewonnen12. Während der Fischprobenahme zeigten die Fische keine klinischen Anzeichen von Krankheiten, Bakterien- oder Pilzinfektionen, und es herrschte eine Durchschnittstemperatur von 22,3 °C. Nach der Isolierung wurde das E. coli-Isolat biochemischen Tests unterzogen und kryokonserviert in Gehirnherzinfusionsbrühe (BHI) mit DMSO (8% v/v) als Kryoprotektivum.

1. Reaktivierung der gefrorenen E. coli ACM5-Stammkultur

  1. Öffnen Sie aus....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die antimikrobielle Suszeptibilität wurde durch die Scheibendiffusionsmethode bestimmt und durch CLSI-Breakpoint-Kriterien für 12 Antibiotika interpretiert, die sechs verschiedene antimikrobielle Klassen umfassen, dh Aminoglykoside, β-Lactame, Fluorchinolone, Nitrofurane, Phenicole und Folatwegsantagonisten. Das E. coli ACM5 zeigte eine Empfindlichkeit gegenüber allen Antibiotika mit Ausnahme eines β-Lactam-Arzneimittels. Vier β-Lactam-Medikamente wurden getestet: Ampicillin, Carbenicillin, Cephalothin und Cefot.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt eine Anpassung des bakteriellen WGS-Workflows unter Verwendung eines Tischsequenzierers und einer Pipeline zur genomischen Charakterisierung einer pathogenen E. coli-Variante dar. Abhängig von der verwendeten Sequenzierungsplattform können die Durchlaufzeiten (TATs) für nasse Laborverfahren (Bakterienkultur, gDNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung) und die Sequenzanalyse variieren, insbesondere wenn langsam wachsende Bakterien untersucht werden. Nach dem oben beschriebenen .......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

An den Nationalen Rat für Wissenschaft und Technologie von Mexiko (CONACyT durch sein Akronym auf Spanisch) für das Promotionsstipendium an José Antonio Magaña-Lizárraga [Nr. 481143].

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Accublock Mini digitales TrockenbadLabnetD0100Trockenbad für die Inkubation von Röhrchen
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetische Beads in Lösung für die Aufreinigung von DNA-Bibliotheken
DeNovix DS-11DeNovix Inc.UV-Vis-Spektrophotometer zur Überprüfung der Qualität der extrahierten
gDNA-DNA LoBind-RöhrchenEppendorf00301084181,5 mL PCR-Röhrchen für das Pooling von DNA-Bibliotheken
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DMagnetisches Mikroröhrchengestell für die Aufreinigung von DNA-Daten auf Basis von magnetischen Beads
Gramnegative Multibac I.D.Diagnostische Forschung (Mexiko)PT-35Kommerzielle Standard-Antibiotika-Disks für antimikrobielle Empfindlichkeitstests
MiniSeq Mid Output Kit (300 Zyklen)IlluminaFC-420-1004Reagenzienkartdrige für die Paired-End-Sequenzierung (2x150)
MiniSeq System InstrumentIlluminaSY-420-1001Tischsequenzierer für die Sequenzierung der nächsten Generation
MiniSpin-ZentrifugeEppendorf5452000816Standard Zentrifuge für Röhrchen
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1024Reagenzien zur Durchführung von DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung. Enthält Reagenzien aus Box 1 und Box 2 für 24 Proben
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Index-Set A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001DNA-Bibliothekssteuerung für die Sequenzierung
Präzisions-WasserbadLabCare America51221081Wasserbadschüttler für Bakterienkulturen
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Reagenzien für fluoreszenzbasierte DNA-Quantifizierungsassays
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometer für Fluoreszenzassays
Qubit Assay-RöhrchenInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ328560,5 mL PCR-Röhrchen für fluoreszenzbasierte DNA-Quantifizierungsassays
SimpliAmp ThermocyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler für die Amplifikation von DNA-Bibliotheken
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spektrophotometer für bakterielle Suspensionen bei antimikrobiellen Empfindlichkeitstests
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300Kit für die Extraktion genomischer DNA (50 Präparate)

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Schlagwörter

Escherichia ColiWhole Genome SequencingAntimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Verwandte Artikel