Methodenartikel

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

DOI:

10.3791/64404

⸱

23. Dezember 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und die Tilapia-Landwirtschaft (Oreochromis spp.) ist die wichtigste Süßwasserfischsorte, die kultiviert wird. Da Aquakulturpraktiken anfällig für mikrobielle Kontamination aus anthropogenen Quellen sind, ist ein umfassender Einsatz von Antibiotika erforderlich, was dazu führt, dass Aquakultursysteme zu einer wichtigen Quelle für antibiotikaresistente und pathogene Bakterien von klinischer Relevanz wie Escherichia coli (E. coli) werden. Hier wurden die antimikrobiellen Resistenz-, Virulenz- und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes, der aus Oreochromis spp. aus Inlandzucht gewonnen wurde, durch Whole-Genom-Sequenzierung (WGS) und In-silico-Analyse aufgeklärt. Antimikrobielle Suszeptibilitätstests (AST) und WGS wurden durchgeführt. Darüber hinaus wurden phylogenetische Gruppe, Serotyp, Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST), erworbene antimikrobielle Resistenz, Virulenz, Plasmid und Prophagengehalt mit verschiedenen verfügbaren Web-Tools bestimmt. Das E. coli-Isolat zeigte nur eine intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und wurde durch WGS-basierte Typisierung als ONT:H21-B1-ST40-Stamm charakterisiert. Obwohl nur ein einziges antimikrobielles Resistenz-assoziiertes Gen nachgewiesen wurde [mdf(A)], wurden mehrere Virulenz-assoziierte Gene (VAGs) aus dem atypischen enteropathogenen E. coli (aEPEC)-Pathotyp identifiziert. Zusätzlich wurde die Ladung von Plasmid-Replicons aus großen Plasmidgruppen und 18 Prophagen-assoziierten Regionen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die WGS-Charakterisierung eines aEPEC-Isolats, das aus einer Fischfarm in Sinaloa, Mexiko, gewonnen wurde, Einblicke in sein pathogenes Potenzial und das mögliche Risiko des Verzehrs roher Aquakulturprodukte für die menschliche Gesundheit ermöglicht. Es ist notwendig, Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zur Untersuchung von Umweltmikroorganismen zu nutzen und einen One-Health-Rahmen zu verabschieden, um zu erfahren, wie Gesundheitsprobleme entstehen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und ihre Produktionspraktiken sollen die steigende Nachfrage nach Nahrungsmitteln für den menschlichen Verzehr befriedigen. Die weltweite Aquakulturproduktion hat sich von 34 Millionen Tonnen (Mt) im Jahr 1997 auf 112 Mt im Jahr 2017 verdreifacht1. Die wichtigsten Artengruppen, die fast 75% der Produktion ausmachten, waren Algen, Karpfen, Muscheln, Wels und Tilapia (Oreochromis spp.) 1. Das Auftreten von Krankheiten, die durch mikrobielle Einheiten verursacht werden, ist jedoch aufgrund der intensiven Fischzucht unvermeidlich, was zu potenziellen wirtschaftlichen Verlusten führt2.

Der Einsatz von Antibiotika in der Fischzucht ist bekannt für die Vorbeugung und Behandlung bakterieller Infektionen, dem wichtigsten limitierenden Faktor für die Produktivität 3,4. Dennoch reichern sich Restantibiotika in Aquakultursedimenten und im Wasser an, üben Selektionsdruck aus und verändern die fischassoziierten und die ansässigen Bakteriengemeinschaften 5,6,7,8. Folglich dient die Aquakulturumgebung als Reservoir für antimikrobielle Resistenzgene (ARGs) und das weitere Auftreten und die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien (ARB) im umgebenden Milieu9. Zusätzlich zu den bakteriellen Krankheitserregern, die häufig die Fischzuchtpraktiken beeinflussen, werden häufig Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie angetroffen, darunter humanpathogene Stämme von Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. und Salmonella spp.10. E. coli ist der häufigste Mikroorganismus, der aus Fischmehl und Wasser in der Fischzucht isoliert wird 11,12,13,14,15.

E. coli ist ein vielseitiges gramnegatives Bakterium, das den Magen-Darm-Trakt von Säugetieren und Vögeln als kommensales Mitglied ihrer Darmmikrobiota bewohnt. E. coli besitzt jedoch eine sehr anpassungsfähige Fähigkeit, sich in verschiedenen Umweltnischen wie Boden, Sedimenten, Nahrung und Wasser zu besiedeln und zu persistieren16. Aufgrund des Gengewinns und -verlusts durch das Phänomen des horizontalen Gentransfers (HGT) hat sich E. coli schnell zu einem gut angepassten antibiotikaresistenten Erreger entwickelt, der in der Lage ist, ein breites Spektrum von Krankheiten bei Mensch und Tier zu verursachen17,18. Basierend auf dem isolierten Ursprung werden pathogene Varianten als intestinale pathogene E. coli (InPEC) oder extraintestinale pathogene E. coli (ExPEC) definiert. Darüber hinaus werden InPEC und ExPEC in genau definierte Pathotypen nach Krankheitsmanifestation, genetischem Hintergrund, phänotypischen Merkmalen und Virulenzfaktoren (VFs) unterteilt16,17,19.

Traditionelle Kultur- und molekulare Techniken für pathogene E. coli-Stämme haben den schnellen Nachweis und die Identifizierung verschiedener Pathotypen ermöglicht. Sie können jedoch zeitaufwendig und mühsam sein und erfordern häufig eine hohe technische Schulung19. Darüber hinaus kann aufgrund der Komplexität ihres genetischen Hintergrunds keine einzige Methode verwendet werden, um alle pathogenen Varianten von E. coli zuverlässig zu untersuchen. Derzeit wurden diese Nachteile mit dem Aufkommen von Hochdurchsatzsequenzierungstechnologien (HTS) überwunden. Whole-Genome Sequencing (WGS) -Ansätze und bioinformatische Werkzeuge haben die Erforschung mikrobieller DNA kostengünstig und in großem Maßstab verbessert und die eingehende Charakterisierung von Mikroben in einem einzigen Durchgang erleichtert, einschließlich eng verwandter pathogener Varianten20,21,22. Abhängig von den biologischen Fragestellungen können mehrere bioinformatische Werkzeuge, Algorithmen und Datenbanken verwendet werden, um Datenanalysen durchzuführen. Wenn das Hauptziel beispielsweise darin besteht, das Vorhandensein von ARGs, VFs und Plasmiden zu bewerten, können Tools wie ResFinder, VirulenceFinder und PlasmidFinder zusammen mit den zugehörigen Datenbanken ein guter Ausgangspunkt sein. Carriço et al.22 gaben einen detaillierten Überblick über die verschiedenen Bioinformatik-Software und zugehörigen Datenbanken, die für die mikrobielle WGS-Analyse eingesetzt werden, von der Vorverarbeitung von Rohdaten bis zur phylogenetischen Inferenz.

Mehrere Studien haben den breiten Nutzen von WGS für die Genomabfrage in Bezug auf antimikrobielle Resistenzattribute, pathogenes Potenzial und die Verfolgung der Entstehung und evolutionären Beziehungen klinisch relevanter Varianten von E. coli aus verschiedenen Ursprüngen gezeigt23,24,25,26 . WGS hat die Identifizierung molekularer Mechanismen ermöglicht, die der phänotypischen Resistenz gegen Antibiotika zugrunde liegen, einschließlich dieser seltenen oder komplexen Resistenzmechanismen. Dies geschieht durch den Nachweis erworbener ARG-Varianten, neuartiger Mutationen in Wirkstoffzielgenen oder Promotorregionen27,28. Darüber hinaus bietet WGS das Potenzial, antimikrobielle Resistenzprofile abzuleiten, ohne dass Vorkenntnisse über den Resistenzphänotyp eines Bakterienstamms erforderlichsind 29. Alternativ hat WGS die Charakterisierung der mobilen genetischen Elemente (MGEs) ermöglicht, die sowohl antimikrobielle Resistenz- als auch Virulenzmerkmale aufweisen, was die bakterielle Genomevolution bestehender Krankheitserreger vorangetrieben hat. Zum Beispiel führte die Anwendung von WGS während der Untersuchung des deutschen E. coli-Ausbruchs im Jahr 2011 zur Aufdeckung der einzigartigen genomischen Merkmale eines scheinbar neuartigen E. coli-Pathotyps; Interessanterweise stammten diese Ausbruchsstämme aus der enteroaggregativen E. coli (EAEC) -Gruppe, die den Prophagen, der das Shiga-Toxin kodiert, aus dem enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) Pathotyp30 erwarb.

Diese Arbeit stellt eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS mit einem Tischsequenzer vor. Darüber hinaus wird eine Bioinformatik-Pipeline mit webbasierten Werkzeugen bereitgestellt, um die resultierenden Sequenzen zu analysieren und Forscher mit begrenzter oder keiner bioinformatischen Expertise weiter zu unterstützen. Die beschriebenen Methoden ermöglichten die Aufklärung der antimikrobiellen Resistenz, Virulenz und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes ACM5, der 2011 aus Oreochromis spp. aus Binnenzucht in Sinaloa, Mexikoisoliert wurde 12.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ANMERKUNG: Der E. coli-Stamm ACM5 wurde durch Verarbeitung und Kultivierung der Fischprobe für die Bestimmung der fäkalcoliformen (FC) gewonnen12. Während der Fischprobenahme zeigten die Fische keine klinischen Anzeichen von Krankheiten, Bakterien- oder Pilzinfektionen, und es herrschte eine Durchschnittstemperatur von 22,3 °C. Nach der Isolierung wurde das E. coli-Isolat biochemischen Tests unterzogen und kryokonserviert in Gehirnherzinfusionsbrühe (BHI) mit DMSO (8% v/v) als Kryoprotektivum.

1. Reaktivierung der gefrorenen E. coli ACM5-Stammkultur

  1. Öffnen Sie aus dem gefrorenen Bakterienfond das Röhrchen und verwenden Sie eine sterile Schlaufe, eine Pipettenspitze oder einen Zahnstocher, um die Oberfläche der gefrorenen Bakterienkultur abzukratzen.
  2. Die Bakterien auf eine Luria-Bertani (LB) Agarplatte streifen und bei 37 ± 2 °C 24 h inkubieren.

2. Bestimmung der antibakteriellen Empfindlichkeit

HINWEIS: Die hier beschriebene antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung entspricht der Scheibendiffusionsmethode auf der Grundlage der Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922 Stamm ist für Qualitätskontrollzwecke erforderlich.

  1. Inokulumpräparation mittels Koloniesuspensionsmethode
    1. Von der LB-Platte, die in Schritt 1.2 inkubiert wurde, streifen Sie eine oder zwei Kolonien auf eine Mueller-Hinton (MH) Agarplatte und inkubieren Sie bei 37 ± 2 °C für 18-24 h.
    2. Verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um zwei oder drei Kolonien aus dem frisch subkultivierten E. coli-Isolat auf MH-Agarplatte zu entnehmen und sie in 3 ml steriler MH-Brühe oder 0,85% (w / v) Kochsalzlösung zu resuspendieren, wobei gründlich durch Wirbeln gemischt wird, um eine einheitliche Bakteriensuspension zu erhalten.
    3. Stellen Sie die Bakteriensuspension mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) auf eine Trübung ein, die mit einem 0,5-MacFarland-Standard vergleichbar ist (entspricht etwa 1-2 x 108 Zellen/ml). Wenn die Bakteriensuspension zu leicht oder zu schwer ist, fügen Sie je nach Bedarf weitere E. coli-Kolonien oder MH-Brühe hinzu . Verwenden Sie das vorbereitete Inokulum innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung.
  2. Beimpfung der Testagarplatten
    1. Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in die angepasste Bakteriensuspension. Drehen Sie den Tupfer mehrmals und drücken Sie ihn fest auf die Innenwand des Röhrchens, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Tupfer zu entfernen.
    2. Beimpfen Sie eine MH-Agarplatte, indem Sie den Tupfer 3x über die gesamte Agaroberfläche streifen und die Platte jedes Mal um 60° drehen. Tupfen Sie auch den Rand des Agars ab, um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu gewährleisten.
    3. Lassen Sie den Petrischalendeckel 3-5 min stehen, damit die Feuchtigkeit verdunsten kann.
  3. Aufbringen der antimikrobiellen Scheibe auf beimpfte Agarplatten
    1. Verteilen Sie sie gleichmäßig und drücken Sie jede antimikrobielle Scheibe (siehe Materialtabelle) auf die Oberfläche der beimpften Agarplatten, um einen vollständigen Kontakt zu gewährleisten. Die Platten innerhalb von 15 min nach dem Auftragen der Scheibe umdrehen und bei 35 ± 2 °C für 16-18 h inkubieren.
      HINWEIS: In Petrischalen von 150 mm bzw. 100 mm dürfen maximal 12 bzw. sechs Scheiben verwendet werden.
  4. Messen Sie nach der Inkubation die Zone der Hemmungsgrößen mit einem Vernier-Messschieber und interpretieren Sie die resultierenden Durchmesser gemäß den CLSI-Breakpoint-Kriterien (M100 - Tabelle 2A)32.

3. Extraktion und Quantifizierung genomischer DNA (gDNA)

  1. Genomische DNA-Extraktion
    1. Resuspendieren Sie eine Schleife frisch kultivierter E . coli-Kolonien in 5 ml LB-Brühe und inkubieren Sie über Nacht in einem Schüttelinkubator (180 U/min) bei 37 ± 2 °C.
    2. Zentrifugieren Sie die Bakteriensuspension bei 3.500 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    3. Extrahieren Sie gDNA gemäß den Richtlinien für DNA-Extraktionskits (siehe Materialtabelle).
    4. Überprüfen Sie die Reinheit der gDNA, indem Sie die optische Dichte bei 260/280 nm (Verhältnis: >1,8) und 260/230 nm (Verhältnis: 2,0-2,2) mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer messen. Führen Sie eine 0,8% ige Agarose-Gelelektrophorese durch, um die gDNA-Integrität zu überprüfen.
  2. Genomische DNA-Quantifizierung
    HINWEIS: Verwenden Sie nur dünnwandige, klare 0,5-ml-PCR-Röhrchen, die vom Hersteller des Fluoreszenztest-Kits zugelassen sind (siehe Materialtabelle).
    1. Richten Sie die erforderliche Anzahl von Röhrchen für Proben und Assay-Standards ein. Bereiten Sie die funktionierende Assaylösung vor, indem Sie die im Kit enthaltenen Komponenten A und B gemäß den Anweisungen des Herstellers mischen.
    2. Bereiten Sie die Assay-Standards vor, indem Sie 190 μL der Arbeitslösung und 10 μL jedes Standards in das entsprechende Röhrchen geben (zwei Standards sind erforderlich).
    3. 198 μL der Arbeitslösung und 2 μL der DNA-Probe in das entsprechende Röhrchen geben. Kräftig mischen, indem Sie alle Röhren 5 s lang durchwirbeln. Achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen.
    4. Alle Röhrchen 2 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Messen Sie die Fluoreszenz aller Röhrchen nach den Richtlinien des Herstellers mit dem Fluorometer (siehe Materialtabelle).
    5. Stellen Sie die Konzentration der gDNA-Probe für den Sequenzierungsvorgang richtig ein.

4. Vorbereitung der DNA-Bibliothek

HINWEIS: Die Vorbereitung und Sequenzierung der DNA-Bibliothek erfolgte gemäß den Richtlinien und Protokollen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Die anfängliche gDNA-Konzentration beträgt 4,0 ng.

  1. Tagmentation, PCR-Amplifikation und Indexierung
    1. In einem 0,2-ml-Röhrchen werden 2,5 μL Tagmentationspuffer und 2 μL Eingangs-gDNA (2,0 ng/μL) hinzugefügt. Durch Pipettieren vorsichtig mischen.
    2. Fügen Sie 1 μL Amplifikationspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Bei 280 x g 1 min bei Raumtemperatur herunterdrehen.
    3. Legen Sie die Proben in einen Thermocycler (siehe Materialtabelle) und führen Sie das folgende PCR-Programm durch: 55 °C für 5 min, dann bei 10 °C halten. Wenn die Proben 10 °C erreichen, fahren Sie sofort fort, um die Reaktion zu neutralisieren.
    4. Geben Sie 1 μL neutralisierenden Puffer in die Probenröhrchen und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Bei 280 x g für 1 min herunterdrehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Fügen Sie 1,7 μL jedes Indexadapters (d. h. Indizes i7 und i5) und 3 μL Indexing-PCR-Mastermix hinzu. Durch Pipettieren vorsichtig mischen. Bei 280 x g 1 min bei Raumtemperatur herunterdrehen.
    6. Legen Sie die Proben in den Thermocycler und führen Sie eine zweite PCR-Reaktion wie folgt durch: 72 °C für 3 min, 95 °C für 30 s, 18 Zyklen von 95 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 30 s, 72 °C für 5 min und bei 10 °C halten.
  2. Verstärkte Bibliotheksbereinigung
    1. Mischen Sie durch Vortexen der handelsüblichen magnetischen Perlenlösung (siehe Materialtabelle) gemäß den Richtlinien des Herstellers.
    2. Die markierte/indizierte gDNA-Probe wird in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt und 0,6 μL magnetische Beads für jedes μL des endgültigen Volumens der gDNA-Probe (≈13 μL) hinzugefügt. Vorsichtig durch Pipettieren mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie die Probenröhrchen für 2 min auf ein Magnetgestell (siehe Materialtabelle), bis der Überstand verschwunden ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die Perlen zu stören.
    4. Fügen Sie 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol ohne Mischen hinzu. Inkubieren Sie für 30 s, bis sich das Eluat klärt, und entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
    5. Führen Sie einen zweiten Waschschritt durch. 200 μL 80% Ethanol zu den Perlen geben und 30 s inkubieren. Nachdem der Eluat geklärt ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie die Perlen für 10 min an der Luft.
    6. 15 μL 10 mM Tris-Puffer (pH 8) zu den Beads geben und vorsichtig durch Pipettieren mischen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Probenröhrchen für 2 min wieder auf das Magnetgestell, damit der Überstand klar werden kann.
    7. Übertragen Sie vorsichtig 14 μL des Überstands aus dem Probenröhrchen in ein neues 0,2-ml-Röhrchen. Dies ist die bereinigte Bibliothek.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die bereinigte Bibliothek bis zu 7 Tage bei -20 °C gelagert werden.
  3. Normalisierung der Bibliothek
    1. Fahren Sie mit der Quantifizierung der bereinigten Bibliotheken durch Fluoreszenztest fort, wie in Schritt 3.2 beschrieben, mit Ausnahme von Schritt 3.2.5.
    2. Visualisieren Sie die bereinigten Bibliotheken auf einer 1% igen Agarose-Gelelektrophorese, um die durchschnittlichen Fragmentgrößen zu bestimmen.
    3. Berechnen Sie den Molaritätswert der Bibliothek anhand der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-1
    4. Berechnen Sie anhand des Molaritätswerts die richtigen Volumina des Resuspensionspuffers (RSB) und der bereinigten Bibliotheken, um die einzelne Bibliothek bei einer Ausgangskonzentration von 10 nM zu verdünnen.

5. Bibliothekspooling, Denaturalisierung und Sequenzerinitiierung

  1. Tauen Sie die Reagenzienpatrone gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. Entnehmen Sie die Durchflusszelle aus dem Kühlschrank (4 °C) und bringen Sie sie vor der Sequenzierung auf Raumtemperatur.
  2. Pool 5 μL jeder normalisierten Bibliothek (10 nM) in ein niedrig bindendes 1,5 ml Röhrchen. Verdünnen Sie die gepoolte Bibliothek bei 4 nM mit dem richtigen Volumen von RSB.
  3. Fügen Sie 5 μL der gepoolten Bibliothek (4 nM) und 5 μL 0,2 N NaOH in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen mit niedriger Bindebindung hinzu. Kurz durch Wirbeln mischen, bei 280 x g für 1 min herunterdrehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die gepoolte Bibliothek in einzelne Stränge zu denaturieren.
  4. 10 μL denaturierte Poolbibliothek und 990 μL vorgekühlten Hybridisierungspuffer werden vorsichtig durch Pipettieren gemischt und auf Eis gelegt, bis die endgültige Verdünnung für die Sequenzerbeladung durchgeführt wurde. Die Konzentration der denaturierten Poolbibliothek beträgt 20 pM.
  5. Auftauen und Vorbereiten einer Kontrollbibliothek (siehe Materialtabelle) bei einer Konzentration von 4 nM durch Mischen von 2 μL Kontrollbibliothek (10 nM) und 3 μL nukleasefreiem Wasser.
  6. Mischen Sie 5 μL der Steuerungsbibliothek (4 nM) und 5 μL frisch zubereitetes 0,2 N NaOH. Kurz durch Wirbeln mischen, bei 280 x g für 1 min herunterdrehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Steuerungsbibliothek in einzelne Stränge zu denaturieren.
  7. 10 μL denaturierte Kontrollbibliothek und 990 μL vorgekühlten Hybridisierungspuffer werden vorsichtig durch Pipettieren gemischt und auf Eis gelegt, bis die endgültige Verdünnung für die Sequenzerbeladung erfolgt ist. Die Konzentration der denaturierten Kontrollbibliothek beträgt 20 pM.
  8. In einem neuen Low-Bind-1,5-ml-Röhrchen werden 594 μL der denaturierten Poolbibliothek bei 20 pM und 6 μL der denaturierten Kontrollbibliothek bei 20 pM kombiniert. Richtig mischen.
  9. Die endgültige Bibliotheksmischung (20 pM) wird mit dem vorgekühlten Hybridisierungspuffer auf eine Endbelastungskonzentration von 1,2 pM in einem Volumen von 600 μL verdünnt.
  10. Bevor Sie die endgültige Bibliotheksmischung auf die Reagenzienpatrone laden, führen Sie eine zusätzliche thermische Vorbehandlung durch, um eine effiziente Beladung in die Durchflusszelle zu erreichen. Die endgültige Bibliotheksmischung für 2 min bei 96 °C inkubieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen, und legen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf Eis.
  11. Laden Sie 500 μL der endgültigen Bibliotheksmischung in das vorgesehene Reservoir der Reagenzienpatrone. Initiieren Sie die Sequenzierung gemäß den Richtlinien. Laden Sie die Durchflusszelle und die Reagenzienkartusche und richten Sie den Sequenzierlauf ein.

6. Sequenzdatenanalyse

HINWEIS: In der Zusatzdatei 1 finden Sie eine weitere Beschreibung der allgemeinen WGS-Datenvorverarbeitung, Software, Parametereinstellungen und Sequenzanalyse des E. coli-Genoms.

  1. Stellen Sie eine Verbindung zum Sequenzdatenserver her und laden Sie die FASTQ-Dateien herunter.
  2. Bewerten Sie die anfängliche Qualität von Sequenzrohdaten mit Software von Drittanbietern. Entfernen Sie Restadaptersequenzen, Basen niedriger Qualität (Zusatzdatei 1).
  3. Stellen Sie die qualitätsgeprüften Sequenzierungsdaten mithilfe von Software von Drittanbietern auf Contig- oder Gerüstebene zusammen (siehe Zusatzdatei 1).
  4. Führen Sie eine Genomannotation durch, indem Sie die FASTA-Datei mit dem assemblierten Genom an den RAST-Server senden (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Laden Sie die FASTA-Datei auf die Webplattformen Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) und ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) hoch, um epidemiologische Merkmale, ARGs, VAGs und Plasmide zu identifizieren (siehe Zusatzdatei 1).
  6. Laden Sie die FASTA-Datei auf den PHASTER-Server hoch, um Prophagensequenzen (https://phaster.ca/) zu identifizieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die antimikrobielle Suszeptibilität wurde durch die Scheibendiffusionsmethode bestimmt und durch CLSI-Breakpoint-Kriterien für 12 Antibiotika interpretiert, die sechs verschiedene antimikrobielle Klassen umfassen, dh Aminoglykoside, β-Lactame, Fluorchinolone, Nitrofurane, Phenicole und Folatwegsantagonisten. Das E. coli ACM5 zeigte eine Empfindlichkeit gegenüber allen Antibiotika mit Ausnahme eines β-Lactam-Arzneimittels. Vier β-Lactam-Medikamente wurden getestet: Ampicillin, Carbenicillin, Cephalothin und Cefot...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt eine Anpassung des bakteriellen WGS-Workflows unter Verwendung eines Tischsequenzierers und einer Pipeline zur genomischen Charakterisierung einer pathogenen E. coli-Variante dar. Abhängig von der verwendeten Sequenzierungsplattform können die Durchlaufzeiten (TATs) für nasse Laborverfahren (Bakterienkultur, gDNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung) und die Sequenzanalyse variieren, insbesondere wenn langsam wachsende Bakterien untersucht werden. Nach dem oben beschriebenen ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

An den Nationalen Rat für Wissenschaft und Technologie von Mexiko (CONACyT durch sein Akronym auf Spanisch) für das Promotionsstipendium an José Antonio Magaña-Lizárraga [Nr. 481143].

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Accublock Mini digitales TrockenbadLabnetD0100Trockenbad für die Inkubation von Röhrchen
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetische Beads in Lösung für die Aufreinigung von DNA-Bibliotheken
DeNovix DS-11DeNovix Inc.UV-Vis-Spektrophotometer zur Überprüfung der Qualität der extrahierten
gDNA-DNA LoBind-RöhrchenEppendorf00301084181,5 mL PCR-Röhrchen für das Pooling von DNA-Bibliotheken
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DMagnetisches Mikroröhrchengestell für die Aufreinigung von DNA-Daten auf Basis von magnetischen Beads
Gramnegative Multibac I.D.Diagnostische Forschung (Mexiko)PT-35Kommerzielle Standard-Antibiotika-Disks für antimikrobielle Empfindlichkeitstests
MiniSeq Mid Output Kit (300 Zyklen)IlluminaFC-420-1004Reagenzienkartdrige für die Paired-End-Sequenzierung (2x150)
MiniSeq System InstrumentIlluminaSY-420-1001Tischsequenzierer für die Sequenzierung der nächsten Generation
MiniSpin-ZentrifugeEppendorf5452000816Standard Zentrifuge für Röhrchen
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1024Reagenzien zur Durchführung von DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung. Enthält Reagenzien aus Box 1 und Box 2 für 24 Proben
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Index-Set A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001DNA-Bibliothekssteuerung für die Sequenzierung
Präzisions-WasserbadLabCare America51221081Wasserbadschüttler für Bakterienkulturen
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Reagenzien für fluoreszenzbasierte DNA-Quantifizierungsassays
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometer für Fluoreszenzassays
Qubit Assay-RöhrchenInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ328560,5 mL PCR-Röhrchen für fluoreszenzbasierte DNA-Quantifizierungsassays
SimpliAmp ThermocyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler für die Amplifikation von DNA-Bibliotheken
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spektrophotometer für bakterielle Suspensionen bei antimikrobiellen Empfindlichkeitstests
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300Kit für die Extraktion genomischer DNA (50 Präparate)

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Schlagwörter

Escherichia ColiWhole Genome SequencingAntimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Verwandte Artikel