Method Article

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

DOI:

10.3791/64418

⸱

November 25th, 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ajou University

In This Article

Summary

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Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Abstract

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Die Parkinson-Krankheit ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und ist gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Zelltod, der durch die Bildung von Lewy-Körperchen verursacht wird, die fehlgefaltetes und aggregiertes α-Synuclein enthalten. α-Synuclein ist ein reichlich vorhandenes präsynaptisches Protein, das den synaptischen Vesikeltransport reguliert, aber die Anhäufung seiner proteinartigen Einschlüsse führt zu Neurotoxizität. Neuere Studien haben gezeigt, dass verschiedene genetische Faktoren, einschließlich bakterieller Chaperone, die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in vitro reduzieren könnten. Es ist jedoch auch wichtig, den Anti-Aggregationseffekt in der Zelle zu überwachen, um dies als mögliche Behandlung für die Patienten anzuwenden. Es wäre ideal, neuronale Zellen zu verwenden, aber diese Zellen sind schwer zu handhaben und brauchen lange, um den Anti-Aggregations-Phänotyp zu zeigen. Daher ist ein schnelles und effektives In-vivo-Tool für die weitere Bewertung der In-vivo-Antiaggregationsaktivität erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um den Anti-Aggregationsphänotyp in der humanisierten Hefe Saccharomyces cerevisiae zu überwachen und zu analysieren, der humanes α-Synuclein exprimierte. Dieses Protokoll demonstriert In-vivo-Werkzeuge, die zur Überwachung der α-Synuclein-induzierten zellulären Toxizität sowie der Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in Zellen verwendet werden könnten.

Introduction

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Die Parkinson-Krankheit (PD) ist ein ernstes Problem für alternde Gesellschaften weltweit. Die Aggregation von α-Synuclein ist eng mit Parkinson verbunden, und Proteinaggregate von α-Synuclein werden häufig als molekularer Biomarker für die Diagnose der Krankheit verwendet1. α-Synuclein ist ein kleines saures Protein (140 Aminosäuren lang) mit drei Domänen, nämlich der N-terminalen Lipid-bindenden α-Helix, der Amyloid-bindenden zentralen Domäne (NAC) und dem C-terminalen sauren Schwanz2. Die Fehlfaltung von α-Synuclein kann spontan auftreten und führt schließlich zur Bildung von Amyloid-Aggregaten, ....

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Protocol

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1. Aufbereitung von Medien und Lösungen

  1. Medienaufbereitung
    1. Zur Herstellung des YPD-Mediums werden 50 g YPD-Pulver in dH2O gelöst, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
    2. Um YPD-Agarmedium herzustellen, lösen Sie 50 g YPD-Pulver und 20 g Agar in 1 L dH2O. Autoklav zur Sterilisation. Nach dem Abkühlen auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.
    3. Zur Herstellung von SC mit Raffinose (SRd)-Ura-Medium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren in 795 mldH2O. Autoklav zur Sterilisation gelöst. Fügen Sie vor Gebrauch 100 ml 20% Raf....

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Results

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Es ist bekannt, dass die hohe Expression von α-Synuclein mit dem neuronalen Zelltod und der Parkinson-Krankheit in Modellsystemen der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Diese Studie beschreibt drei Methoden zur Überwachung der Zytotoxizität von α-Synuclein und der Bildung von aggregiertem α-Synuclein in Hefe. Hier wurde das α-Synuclein in Hefe überexprimiert, und die Phänotypen von Wildtyp-α-Synuclein und drei Varianten von α-Synuclein, die als familiäre Mutanten von PD bekannt sind, wurden untersucht (

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Discussion

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Angesichts der Komplexität verschiedener zellulärer Systeme beim Menschen ist es vorteilhaft, Hefe als Modell für die Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen zu verwenden. Obwohl es nahezu unmöglich ist, die komplexen zellulären Interaktionen des menschlichen Gehirns mit Hilfe von Hefe zu untersuchen, weisen Hefezellen aus Einzelzellperspektive eine hohe Ähnlichkeit mit menschlichen Zellen in Bezug auf die genomische Sequenzhomologie und grundlegende eukaryotische zelluläre Prozesse auf

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken James Bardwell und Tiago F. Outeiro für die freundliche Bereitstellung der Plasmide, die α-Synuclein enthalten. Changhan Lee erhielt Fördermittel von der National Research Foundation of Korea (NRF), die von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wurde (Grant 2021R1C1C1011690), dem Basic Science Research Program durch das NRF, das vom Bildungsministerium finanziert wurde (Grant 2021R1A6A1A10044950) und dem neuen Fakultätsforschungsfonds der Ajou University.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-Well-PlatteSPL30096
AgaroseTAESHIN0158
Bacto AgarBD Difco214010
Breathe-easydiversifizierte BiotechnologieBEM-1Gasdurchlässige Dichtungsmembran für Mikrotiterplatten
DeckgläserMarienfeld24 x 60 mm
KulturröhrchenSPL40014
Küvettenverhältnislab2712120
D-(+)-GalactosesigmaG0625
D-(+)-GlucosesigmaG8270
D-(+)-Raffinose-PentahydratDaejung6638-4105
Inkubator (schüttelnd)Labtron-Modell: SHI1
Inkubator (statisch)Vision wissenschaftlichModell: VS-1203PV-O
LiAcsigmaL6883
Mikroplatten-ReaderTecan30050303 01Modell: Infinite 200 pro
Mehrkanalpipette 20-200 & Mikro; LgilsonFA10011
Mehrkanalpipette 2-20 &Mikro; LgilsonFA10009
Olympus MikroskopOlympusIX-53
PEGsigmaP4338durchschnittliches mol wt 3.350
PetrischaleSPL10090
pRS426Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunktionale Hefe-Shuttle-Vektoren mit hoher Kopienzahl. Gen. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 Promotor α-Synuclein A30POuteiro, T. F. & Lindquist, S. Hefezellen geben Einblick in die Biologie und Pathobiologie von Alpha-Synuclein. Wissenschaft. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 Promotor α-Synuclein A53TOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Hefezellen geben Einblick in die Biologie und Pathobiologie von Alpha-Synuclein. Wissenschaft. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 Promotor α-Synuclein E46KOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Hefezellen geben Einblick in die Biologie und Pathobiologie von Alpha-Synuclein. Wissenschaft. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 Promotor α-Synuclein WTOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Hefezellen geben Einblick in die Biologie und Pathobiologie von Alpha-Synuclein. Wissenschaft. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
ReservoirSPL23050
Spektralphotometereppendorf6131 05560
W303aVorhanden von James Bardwell
Hefe Stickstoffbase ohne AminosäurenDifco291940
Hefe synthetisches Drop-out-Medium Ergänzungen ohne UracilsigmaY1501
YPDKondalab1547.00
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  2. Surguchov, A. Intrac....

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Alpha Synuclein AggregationYeast ModelParkinson s DiseaseSynuclein ToxicityHumanized YeastProtein AggregationFluorescence MicroscopyWestern BlottingGenetic ScreeningSynaptic Vesicle Trafficking

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