Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist ein ernstes Problem für alternde Gesellschaften weltweit. Die Aggregation von α-Synuclein ist eng mit Parkinson verbunden, und Proteinaggregate von α-Synuclein werden häufig als molekularer Biomarker für die Diagnose der Krankheit verwendet¹. α-Synuclein ist ein kleines saures Protein (140 Aminosäuren lang) mit drei Domänen, nämlich der N-terminalen Lipid-bindenden α-Helix, der Amyloid-bindenden zentralen Domäne (NAC) und dem C-terminalen sauren Schwanz². Die Fehlfaltung von α-Synuclein kann spontan auftreten und führt schließlich zur Bildung von Amyloid-Aggregaten, die als Lewy-Körper³ bezeichnet werden. α-Synuclein kann auf verschiedene Weise zur Pathogenese der Parkinson-Krankheit beitragen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass seine abnormalen, löslichen oligomeren Formen, die Protofibrillen genannt werden, toxische Spezies sind, die den neuronalen Zelltod verursachen, indem sie verschiedene zelluläre Ziele, einschließlich der synaptischen Funktion³, beeinflussen.

Die biologischen Modelle, mit denen neurodegenerative Erkrankungen untersucht werden, müssen für den Menschen in Bezug auf sein Genom und seine Zellbiologie relevant sein. Die besten Modelle wären menschliche neuronale Zelllinien. Diese Zelllinien sind jedoch mit mehreren technischen Problemen verbunden, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung von Kulturen, geringer Effizienz der Transfektion und hohen Kosten⁴. Aus diesen Gründen ist ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug erforderlich, um den Fortschritt in diesem Forschungsbereich zu beschleunigen. Wichtig ist, dass das Tool für die Analyse der gesammelten Daten einfach zu bedienen ist. Aus dieser Perspektive wurden verschiedene Modellorganismen weit verbreitet, darunter Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, Hefe und Nagetiere⁵. Unter ihnen ist Hefe der beste Modellorganismus, weil genetische Manipulation einfach und billiger ist als die anderen Modellorganismen. Am wichtigsten ist, dass Hefe hohe Ähnlichkeiten mit menschlichen Zellen aufweist, wie z.B. 60% Sequenzhomologie zu menschlichen Orthologen und 25% enge Homologie mit menschlichen krankheitsbezogenen Genen⁶, und sie teilen auch eine grundlegende eukaryotische Zellbiologie. Hefe enthält viele Proteine mit ähnlichen Sequenzen und ähnlichen Funktionen wie in menschlichen Zellen⁷. In der Tat wurde Hefe, die menschliche Gene exprimiert, häufig als Modellsystem zur Aufklärung zellulärer Prozesse verwendet⁸. Dieser Hefestamm wird als humanisierte Hefe bezeichnet und ist ein nützliches Werkzeug, um die Funktion menschlicher Gene zu erforschen⁹. Humanisierte Hefe hat Vorteile für die Untersuchung genetischer Interaktionen, da die genetische Manipulation in Hefe gut etabliert ist.

In dieser Studie haben wir die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus verwendet, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen, insbesondere um die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten und die Zytotoxizität zu untersuchen¹⁰. Für die Expression von α-Synuclein in der Knospungshefe wurde der W303a-Stamm zur Transformation mit Plasmiden verwendet, die für die Wildtyp- und familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein kodieren. Da der W303a-Stamm eine auxotrophe Mutation auf URA3 aufweist, ist er für die Selektion von Zellen geeignet, die Plasmide mit URA3 enthalten. Die Expression von α-Synuclein, das in einem Plasmid kodiert ist, wird unter dem GAL1-Promotor reguliert. So kann das Expressionsniveau von α-Synuclein gesteuert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Fusion von grün fluoreszierendem Protein (GFP) an der C-terminalen Region von α-Synuclein die Überwachung der Bildung von α-Synuclein-Herden. Um die Eigenschaften der familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein zu verstehen, haben wir diese Varianten auch in Hefe exprimiert und ihre zellulären Wirkungen untersucht. Dieses System ist ein einfaches Werkzeug für das Screening von Verbindungen oder Genen, die eine schützende Rolle gegen die Zytotoxizität von α-Synuclein spielen.

1. Aufbereitung von Medien und Lösungen

1. Medienaufbereitung
   1. Zur Herstellung des YPD-Mediums werden 50 g YPD-Pulver in dH₂O gelöst, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
   2. Um YPD-Agarmedium herzustellen, lösen Sie 50 g YPD-Pulver und 20 g Agar in 1 L dH₂O. Autoklav zur Sterilisation. Nach dem Abkühlen auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.
   3. Zur Herstellung von SC mit Raffinose (SRd)-Ura-Medium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren in 795 ml_dH2O. Autoklav zur Sterilisation gelöst. Fügen Sie vor Gebrauch 100 ml 20% Raffinose, 5 ml 20% Glukose und 100 ml 10x -Ura-Drop-out hinzu.
   4. Zur Herstellung von SD-Ura-Agarmedium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren und 20 g Agar in 800 ml_dH2O. Autoklav in einem Kolben mit einem Volumen von über 2 l auflösen. Gut verrühren und auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.
   5. Zur Herstellung von SC mit Galactose (SG)-Ura-Agarmedium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren und 20 g Agar in 800 ml_dH2O. Autoklav in einem Kolben mit einem Volumen von über 2 l gelöst. 100 ml 20% Galaktose und 100 ml 10x -Ura-Drop-out hinzufügen. Gut vermischen und mit Petrischalen übergießen. Bei 4 °C lagern.
2. Standardlösungen für die Verwendung mit SD-Medien
   1. Um eine 20% ige Kohlenstoffquelle (Glukose, Galaktose und Raffinose) herzustellen, lösen Sie 100 g Glukose, Galaktose oder Raffinose in dH₂O auf, um ein Endvolumen von 500 ml zu erhalten. Autoklav und Lagerung bei RT.
   2. Um 10x Hefe synthetische Drop-out-Medium-Ergänzungen ohne Uracil (10x-Ura-Drop-out) herzustellen, lösen Sie 19,2 g "Hefe-synthetische Drop-out-Medium-Ergänzungen ohne Uracil" in dH_2Oauf, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten.
      HINWEIS: Für die Zubereitung eines agarhaltigen Mediums fügen Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben ein, um alle Lösungen gut zu mischen, bevor Sie sie auf Petrischalen gießen.

2. Hefe-Umwandlung

HINWEIS: Das pRS426-Plasmid wurde verwendet, um das α-Synuclein-Gen zu klonen und enthielt das URA3-Gen als selektierbaren Marker. Es gibt familiäre PD-assoziierte Varianten von α-Synuclein, die schwere Krankheitsphänotypen (z. B. Zytotoxizität) aufweisen. Diese Varianten wurden auch hier verwendet, um ihre Zytotoxizität und aggregierte Herdenbildung zu überwachen. Verwenden Sie die gleiche Kolonie von Hefetransformanten für alle Experimente, um konsistente Ergebnisse zu erhalten.

1. Für die Transformation der Hefeexpressionsplasmide ist ein leerer Vektor (pRS426) als Kontroll- und α-Synuclein-haltige Plasmide zu verwenden. Unter Bezugnahme auf die Standardmethode Lithiumacetat (LiAc)¹¹ werden sechs kompetente Zellen und 0,5 μg jedes Plasmids hergestellt und die Transformation durchgeführt.
2. Um Hefetransformatoren auszuwählen, die Plasmide enthalten, verwenden Sie das synthetisch definierte Medium (SD-Medium) ohne Uracil (SD-Ura) und inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 2-3 Tage.
3. Patchen Sie drei einzelne Kolonien auf eine SD-Ura-Agarplatte für die Auswahl von Zellen, die Plasmide für weitere Experimente enthalten.
   HINWEIS: Um genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, haben wir mindestens drei biologische Replikate pro Stamm untersucht.

3. Spotting-Test

ANMERKUNG: Es ist bekannt, dass die Expression von GFP-markiertem α-Synuclein in Plasmiden mit hoher Kopienzahl mit Zytotoxizität in Hefe¹⁰ assoziiert ist.

1. Die drei gepatchten Hefetransformatoren pro Stamm werden in 3 ml SRd-Ura für das selektive Wachstum von Hefe geimpft, die die Plasmide mit 2% Raffinose zur Hemmung der Induktion von α-Synuclein unter dem GAL1-Promotor und 0,1% Glukose enthält. Die Zellkultur wird bei 30 °C unter Rühren bei 200 U/min inkubiert.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Experimente mit verschiedenen Kolonien zu wiederholen. Wenn Sie die gleichen Ergebnisse von mehr als drei unabhängigen Kolonien erhalten, bedeutet dies, dass das Ergebnis zuverlässig ist.
2. Am nächsten Tag werden die über Nacht kultivierten Zellen in 3 ml frisches SRd-Ura auf einen OD 600 von 0,2 beimpft und 6 h bei 30 °C unter Rühren bei₂₀₀ U/min inkubiert.
3. Wenn der OD₆₀₀ 0,6-0,8 erreicht, verdünnen Sie die Zellen in 96-Well-Platten für den Spotting-Assay wie folgt.
   1. Messen Sie den OD 600 aller Proben und verdünnen Sie die Proben auf einen OD 600 von 0,5 mit sterilem_dH2O(das gemischte Volumen beträgt₁₀₀ μL) in Spur 1 einer 96-Well-Platte, um die Anzahl der Zellen in jeder Kultur auszugleichen.
   2. Führen Sie fünffache serielle Verdünnungen der Hefezellen durch, indem Sie 160 μL steriles_dH2Oin die nächsten fünf Bahnen geben. Stellen Sie ein Gesamtvolumen von 40 μL sicher, wenn Sie die Zellen in jeder Spur seriell verdünnen.
      HINWEIS: Niedrige Verdünnungsfaktoren können zu größeren Unterschieden zwischen den Proben führen. Ein ausreichendes Pipettieren ist erforderlich, um eine gleichmäßige Durchmischung bei der Durchführung der seriellen Verdünnungen zu gewährleisten. Die Pipettenspitze sollte an jeder Verdünnungsstelle ausgetauscht werden. Andernfalls könnten die Zellen, die an der Oberfläche der Spitze befestigt sind, in die nächste Vertiefung übertragen werden und die Zellzahl beeinflussen.
4. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 μL aus jeder Vertiefung zu übertragen, um die Proben auf SD-Ura-Agarplatten für die Kontrollen und SG-Ura-Agarplatten zur Überwachung der Toxizität zu erkennen.
   HINWEIS: Die Platten sollten getrocknet werden, bis die gefleckten Proben vollständig auf den Platten absorbiert sind.
5. Die gefleckten Platten kopfüber bei 30 °C 4 Tage lang bebrüten.
6. Nehmen Sie alle 24 Stunden bis zum 4. Tag Bilder von den Platten auf und analysieren Sie dann die Daten, indem Sie die Wachstumsunterschiede zwischen den mit dem Auge entdeckten Stämmen vergleichen. Zählen Sie die einzelnen Kolonien in der am stärksten verdünnten Probe, berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der ursprünglichen Kultur für jeden Stamm oder vergleichen Sie die Größe der einzelnen Kolonien.

4. Messung des Hefewachstums mit einem Mikrotiterplatten-Reader

1. Die drei geflickten Hefetransformatoren pro Stamm werden in 3 ml SRd-Ura geimpft und bei 30 °C unter Rühren bei 200 U/min über Nacht inkubiert.
   HINWEIS: Um jeden Koloniephänotyp des humanisierten Hefestamms, der α-Synuclein exprimiert, zu verstehen, verwenden Sie für alle Experimente die gleichen Transformanten.
2. Am nächsten Tag impfen Sie die über Nacht kultivierten Zellen in insgesamt 200 μL frisches SD-Ura und SG-Ura in 96-Well-Platten. Stellen Sie das Endvolumen, einschließlich der Zellen, auf 200 μL und die Anfangszelle OD₆₀₀ auf 0,05 ein.
   1. Stellen Sie die Programmeinstellungen in der Mikrotiterplatte wie folgt ein: Stellen Sie die Zieltemperatur auf 30 ° C ein, stellen Sie die Schütteldauer (Linear) auf 890 s ein, stellen Sie die Schüttelamplitude (Linear) auf 5 mm ein, stellen Sie die Intervallzeit auf 00:15:00 ein und stellen Sie die Messung als Absorption bei 600 nm ein.
   2. Inkubieren Sie die Platte für 2-3 Tage, damit alle Stämme die stationäre Phase in einem Mikroplatten-Reader erreichen.
3. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Wachstumskurve zeichnen (z. B. mit der Arbeitsmappe). Erfassen Sie die Datenpunkte, indem Sie die Extinktionswerte aus den drei biologischen Replikaten mittelen, und geben Sie die Fehlerbalken an. Verwenden Sie den Wert der Absorption nur von Medien als Kontrolle, und subtrahieren Sie diesen von den Werten von kultivierten Zellen (optional).

5. Fluoreszenzmikroskopie

1. Die geflickten Hefetransformatoren werden in 3 ml SRd-Ura geimpft und über Nacht bei 30 °C unter Rühren bei 200 U/min kultiviert.
   HINWEIS: Um die Korrelation des Phänotyps mit der Zytotoxizität und der Herdenbildung zu bestimmen, verwenden Sie die gleichen Kolonien für das Experiment.
2. Am nächsten Tag reinokulieren Sie die über Nacht kultivierten Zellen in 3 ml frisches SRd-Ura bis zu einem OD₆₀₀ von 0,003. Inkubieren Sie die Kultur, bis der OD 600 bei 30 °C unter Rühren bei₂₀₀ U/min (~18 h) 0,2 erreicht.
3. Wenn ein OD 600 von 0,2 erreicht ist, werden 300 μl 20%ige Galaktose zugegeben und dann weitere 6 h bei 30 °C unter Rühren bei₂₀₀ U/min inkubiert.
4. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min gesammelt und der Überstand verworfen.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 30 μL destilliertem Wasser.
6. Laden Sie 5 μL der resuspendierten Zellen auf ein Objektträgerglas. Bereiten Sie ein Agarose-Gel-Pad¹² vor und legen Sie es auf die geladenen Zellen, damit es sich gleichmäßig verteilt.
7. Führen Sie mikroskopische Aufnahmen mit einem 100-fachen Objektiv durch, wobei sowohl Hellfeld- als auch GFP-Fluoreszenzfilter verwendet werden.
   1. Verwenden Sie zunächst das Hellfeld, um die Zelle mit einem 100-fachen Objektiv mit Immersionsöl zu fokussieren. Verwenden Sie die Screen-Capture-Option , um die Bilder mit dem Programm zu generieren.
   2. Wechseln Sie zu einem GFP-Fluoreszenzfilter. Stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 ms und 300 ms ein, um ein klares Bild zu erzielen, indem Sie das Signal-Rausch-Verhältnis ausgleichen. Machen Sie eine Bildschirmaufnahme des Bildes mit dem Programm.
   3. Stellen Sie sich viele Zellen von mehreren Punkten aus und nicht nur eine.
8. Analysieren Sie die Bilder, indem Sie den Prozentsatz der Zellen zählen, die Herde von α-Synuclein-Aggregaten mit Hilfe von Analysesoftware enthalten. Beobachten Sie die Unterschiede zwischen dem löslichen GFP-Proteinsignal und dem foci-gebildeten GFP-Signal sowie die Diffusion von GFP mit der A30P-Variante von α-Synuclein.
   HINWEIS: Die Bildung von Herden wird bei den Wildtyp-, E46K- und A53T-Varianten von α-Synuclein beobachtet.

Es ist bekannt, dass die hohe Expression von α-Synuclein mit dem neuronalen Zelltod und der Parkinson-Krankheit in Modellsystemen der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Diese Studie beschreibt drei Methoden zur Überwachung der Zytotoxizität von α-Synuclein und der Bildung von aggregiertem α-Synuclein in Hefe. Hier wurde das α-Synuclein in Hefe überexprimiert, und die Phänotypen von Wildtyp-α-Synuclein und drei Varianten von α-Synuclein, die als familiäre Mutanten von PD bekannt sind, wurden untersucht (Abbildung 1 und die Materialtabelle).

Die α-Synuclein-Expression unter dem GAL1-Promotor im pRS426-Vektor zeigte eine signifikante Wachstumsverzögerung auf der Agarplatte, die Galaktose als Induktor enthielt (Abbildung 2). Der Unterschied im Wachstum der α-Synuclein-Expression wurde auch in flüssigen Kulturen beobachtet (Abbildung 3). In beiden Kulturbedingungen zeigten Wildtyp-α-Synuclein und Varianten mit E46K- oder A53T-Mutationen Wachstumsdefekte aufgrund von α-Synuclein-Toxizität. Die α-Synuclein-A30P-Variante, die keine Aggregate bildet, zeigte jedoch einen nicht-toxischen Phänotyp.

Um den Zusammenhang zwischen Zytotoxizität und der Aggregation von α-Synuclein zu verstehen, ist eine Methode zur Überwachung des Status von α-Synuclein in Hefe erforderlich. Das α-Synuclein wurde von einem GFP-Protein am C-Terminus markiert, um den Status von α-Synuclein in lebenden Hefezellen durch Detektion des GFP-Signals mittels Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen. Die Stämme mit schwerer Zytotoxizität zeigten Herde von α-Synuclein-Aggregaten, aber in der A30P-Variante wurde eine weniger toxische Form von α-Synuclein in den Zellen diffundiert (Abbildung 4).

Abbildung 1: α-Synuclein-Domänen und -Konstrukte, die in dieser Studie verwendet wurden. (A) Die Struktur von humanem α-Synuclein mit den drei verschiedenen Domänen - der N-terminalen Domäne, der NAC-Domäne und der C-terminalen Domäne. Die Aminosäurereste sind unten angegeben. Die orangefarbenen Linien zeigen die mutierten Stellen an. (B) Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten Plasmidkonstrukte. Als Rückgrat wurde das pRS426-Plasmid verwendet. α-Synuclein wurde mit einem GFP-Tag am C-Terminus fusioniert, und seine Expression wurde durch den GAL1-Promotor gesteuert. Abkürzungen: NAC = Nicht-Amyloid-β-Komponente; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Zytotoxizität von α-Synuclein auf Agar aufgrund der Expression von Plasmiden mit hoher Kopienzahl in Hefe. Hefezellen, die GAL1-getriebene α-Synuclein-GFP-Varianten in pRS426-Plasmiden exprimierten, wurden in fünffacher Verdünnung auf einem selektiven Hefemedium mit 2% Glucose oder 2% Galactose entdeckt. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert und die Platten fotografiert. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; EV = leerer Vektor; WT = Wildtyp; α-Syn = α-Synuclein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Zytotoxizität von α-Synuclein in flüssigen Medien aufgrund der Expression von Plasmiden mit hoher Kopienzahl in Hefe. Hefezellen, die GAL1-getriebene α-Synuclein-GFP-Varianten exprimierten, wurden in flüssigen Medien in einer 96-Well-Platte bei 30 °C für 2 Tage kultiviert und das Wachstum wurde mit einem Mikroplatten-Reader überwacht. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; EV = leerer Vektor; WT = Wildtyp; α-Syn = α-Synuclein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Analyse von Hefezellen, die α-Synuclein-GFP exprimieren, mittels Fluoreszenzmikroskopie. α-Synuclein-GFP-Varianten wurden durch Zugabe von Galaktose und Inkubation für 6 h induziert. Die Bestätigung von α-Synuclein-GFP erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; EV = leerer Vektor; WT = Wildtyp; α-Syn = α-Synuclein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Zusammenfassung dieser Methode zur Messung der Zytotoxizität und der Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung humanisierter Hefe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.