Um die Untersuchung der präantralen Follikulogenese voranzutreiben, sind effiziente Methoden der Follikelisolierung aus einzelnen Eierstöcken erforderlich. Hier wird ein optimiertes, mechanisches Protokoll zur Follikelisolierung aus Rinderovarien mit einem Gewebezerkleinerer und Homogenisator vorgestellt. Diese Methode ermöglicht die Entnahme einer großen Anzahl lebensfähiger präantraler Follikel aus einem einzigen Eierstock.
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Methodenartikel
Isolierung kleiner präantraler Follikel aus dem Rindereierstock durch eine Kombination aus Fragmentierung, Homogenisierung und serieller Filtration
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Verständnis des gesamten Prozesses der Follikulogenese von Säugetieren ist entscheidend für die Verbesserung der assistierten Reproduktionstechnologien bei Nutztieren, Menschen und gefährdeten Arten. Die Forschung beschränkte sich meist auf antrale und große präantrale Follikel aufgrund von Schwierigkeiten bei der Isolierung kleinerer präantraler Follikel, insbesondere bei großen Säugetieren wie Rindern. Diese Arbeit stellt einen effizienten Ansatz dar, um eine große Anzahl kleiner präantraler Follikel aus einem einzelnen Rinderstock zu gewinnen. Der Kortex einzelner Rinderovarien wurde mit einem Gewebechopper in 500 μm Würfel geschnitten und 6 min bei 9.000-11.000 U/min mit einer 10 mm Sonde homogenisiert. Große Ablagerungen wurden mit einem Käsetuch vom Homogenat getrennt, gefolgt von einer seriellen Filtration durch 300 μm und 40 μm Zellsieb. Der im 40-μm-Sieb zurückgehaltene Inhalt wurde in eine Suchschale gespült, wo Follikel identifiziert und zu einem Tropfen Medium gesammelt wurden. Die Lebensfähigkeit der gesammelten Follikel wurde mittels Trypanblau-Färbung getestet. Diese Methode ermöglicht die Isolierung einer großen Anzahl lebensfähiger kleiner präantraler Follikel aus einem einzigen Rindereierstock in ca. 90 min. Wichtig ist, dass diese Methode vollständig mechanisch ist und die Verwendung von Enzymen zur Dissoziation des Gewebes vermeidet, was die Follikel schädigen kann. Die mit diesem Protokoll erhaltenen Follikel können für nachgeschaltete Anwendungen wie die Isolierung von RNA für RT-qPCR, Immunlokalisierung spezifischer Proteine und In-vitro-Kultur verwendet werden.
Einleitung
Eierstockfollikel sind die funktionellen Einheiten des Eierstocks, die für die Produktion der Gameten (Eizellen) sowie von Hormonen verantwortlich sind, die für die Fortpflanzungsfunktion und die allgemeine Gesundheit entscheidend sind. Primordiale Follikel bilden sich im Eierstock während der fetalen Entwicklung oder in der Neugeborenenperiode, abhängig von der Art1, und sie bilden die ovarielle Reserve einer Frau. Das follikuläre Wachstum beginnt mit der Aktivierung von primordialen Follikeln, die das Ruhebecken verlassen und in die Wachstumsphase eintreten. Die präantrale Follikulogenese, die alle Follikelstadien vor der Entwicklung des Antr....
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Protokoll
Die Eierstöcke von Rindern (Bos taurus) wurden aus einem örtlichen Schlachthof bezogen und innerhalb von 6 Stunden nach der Entnahme ins Labor transportiert. Aufgrund der großen Anzahl von Tieren, die in der Einrichtung verarbeitet werden, sind Alter, Rasse und Stadium des Brunstzyklus der Tiere unbekannt. Da in diesen Versuchen keine lebenden Tiere verwendet wurden, war kein genehmigtes Tierpflege- und Anwendungsprotokoll erforderlich.
1. Vorbereitung von Geräten und Reagenzien
- Decken Sie einen 2 Fuß breiten Abschnitt eines Labortisches mit Tischpapier ab.
- Besorgen Sie sich einen Skalpellgriff,....
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Ergebnisse
Überblick und kritische Schritte
Mit diesem Protokoll können kleine präantrale Rinderfollikel zuverlässig aus einzelnen Eierstöcken in experimentell relevanter Anzahl isoliert werden. Von insgesamt 30 Replikaten wurden durchschnittlich 41 Follikel pro Replikat mit einem Bereich von 11 bis 135 Follikeln erhalten (Abbildung 4A). In 14 Replikaten wurden die Follikel für das Entwicklungsstadium wie zuvor beschrieben26 durch Messung des Follikeldurchmes.......
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Diskussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Gewinnung präantraler Follikel im Frühstadium, insbesondere in primären und frühen sekundären Stadien, aus dem Rindereierstock. Dieses Protokoll baut auf früheren Berichten 20,25,30,34,35,36 auf und bietet Optimierungen, die zur Isolierung einer sinnvollen Anzahl von.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Dieses Projekt wurde teilweise durch das USDA Multi-State-Projekt W4112 und den UC Davis Jastro Shields Award an SM finanziert.
Die Autoren möchten Central Valley Meat, Inc. für die Bereitstellung der in allen Experimenten verwendeten Rindereierstöcke danken. Die Autoren danken auch Olivia Silvera für die Unterstützung bei der Eierstockverarbeitung und Follikelisolierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5-3/4" Soda Limette Einweg-Glas-Pasteur-Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur-Pipette, die verwendet werden kann, um Follikel von Ablagerungen zu entfernen, während in der Petrischale gesucht |
| wird 16% Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | Verdünnt auf 4%; Fixierung von Follikeln für die Immunfärbung |
| 20 mL Luer-Lock-Spritze | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Spritze, die mit der 18-G-Nadel verwendet wird, um Follikel aus dem 40 μ; m cell Sieb |
| #21 Sterile Skalpellklinge | Fisher Scientific | 50-365-023 | Wird verwendet, um die Eierstöcke zu schneiden und die Medula |
| zu entfernen 40 μ m Zell-Sieb | Fisher Scientific | 22-363-547 | Wird verwendet, um das Filtrat aus dem 300 μ m cell ssieb |
| 104 mm Kunststofftrichter | Fisher Scientific | 10-348C | Die Größe kann variieren, aber stellen Sie sicher, dass das Käsetuch richtig geschnitten ist und dass das Ovarialhomogenat nicht über |
| 300 μm überläuft. m Zellsieb | pluriSelect | 43-50300-03 | Wird verwendet, um das Filtrat aus dem Käsetuch zu filtern |
| 500 mL Erlenmeyerkolben | Fisher Scientific | FB500500 | Trichter und Kolben zum Auffangen von Filtrat aus dem Käsetuch |
| Air-Tite Sterile Nadeln 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G bietet genügend Druck, um Follikel aus dem 40 μ; m cell Sieb |
| Air-Tite Sterile Nadeln 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Nadeln, mit denen Ablagerungen manipuliert werden können, in denen Follikel stecken |
| geblieben sind BD Hoechst 33342 Lösung | Fisher Scientific | Fluoreszierender | DNA-Farbstoff |
| Rinderserum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Bestandteil des Follikelwaschmediums |
| Käsetuch | Elektronenmikroskopie Sciences | 71748-00 | Erster Filterschritt des Eierstockhomogenats zur Entfernung großer Gewebereste |
| Klassische Doppelkanten-Sicherheitsrasierklingen | Wilkinson Schwert | N/A | Rasierklingen, die am besten in den McIlwain Tissue Chopper passen und nicht schnell abstumpfen |
| Esel-Anti-Kaninchen Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Sekundärer Antikörper für die Immunfärbung |
| Eisco Latex-Pipettenbirnen | Fisher Scientific | S29388 | Gummibirne zur Verwendung mit Pasteur-Pipetten |
| HEPES-Puffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Bestandteil des Follikelwaschmediums |
| Homogenisator | VWR | 10032-336 | Homogenisieren Sie das Eierstockgewebe, um Follikel freizusetzen |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software für die Analyse der Fluoreszenz-Immunlokalisierung |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Wird verwendet, um Eierstockgewebe klein genug für die Homogenisierung zu schneiden |
| Mikroskop - Stereoskop | Olympus | SZX2-ILLT | Dissektionsmikroskop zum Suchen und Entnehmen von Follikeln aus dem Filtrat |
| Mikroskop - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverses Mikroskop für die Hellfeldvisualisierung isolierter Follikel mit hoher Vergrößerung |
| Mikroskop - Inverses | ECHO | Revolve R4 | Inverses Mikroskop für die Hellfeld- und Epifluoreszenzvisualisierung isolierter Follikel mit hoher Vergrößerung |
| Mineralöl | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Öl zum Abdecken der Tropfen des Follikelwaschmediums, um eine Verdunstung während der Suche zu verhindern |
| Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Bestandteil des Follikelwaschmediums |
| Normales Eselsserum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagenz zur Immunfärbung blockierender Puffer |
| Nunc 4-Well-Schalen für IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-Well-Schalen für die Follikelisolierung und das Waschen |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung 100x | Gibco | 15-140-122 | Komponente des Follikelwaschmediums |
| Petrischale, 60 mm OD x 13,7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petrischale, die am besten in die McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) passtFisher | Scientific | BP665-1 | Waschpuffer für Eierstöcke und Follikel |
| Kunststoff-Schneidebrett | Fisher Scientific | 09-002-24A | Schneidebrett in ausreichender Größe zum sicheren Schneiden Eierstöcke |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Die Zugabe von PVP (0,1 % w/v) zu PBS verhindert, dass Follikel an der Platte oder aneinander kleben. |
| ProLong Gold Antifade Eindeckmittel | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Eindeckmedium für fluoreszenzmarkierte Zellen oder Gewebe |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA-Säulenreinigungskit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistische Analysesoftware |
| Kaninchen-Anti-Mensch Cx37/GJA4 Polyklonaler Antikörper | Abcam | ab181701 | Cx37 Primärantikörper für Immunfärbung |
| RevertAid RT Reverse Transkriptionskit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA-Synthesekit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistische Analysesoftware |
| Natriumhydroxidlösung (1N/zertifiziert) | Fisher Scientific | SS266-1 | Wird verwendet, um den pH-Wert des Mediums auf 7,6-7,8 |
| zu erhöhen Natriumpyruvat (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Bestandteil des Follikelwaschmediums |
| Quadratische Petrischale, 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Petrischalen mit Raster ermöglichen eine effizientere Identifizierung von Follikeln. |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green | Supermix BioRad 1725271 | Mastermix für PCR-Reaktionen | |
| Steritop Gewindefilter mit Flaschenaufsatz | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Wird zur Sterilisation von Follikelwaschmedium verwendet |
| SYBR-sicherer DNA-Gel-Farbstoff | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Färben auf visuellen PCR-Produkten auf Agarosegel |
| TCM199 mit Hank' s Salze | Gibco | 12-350-039 | Bestandteil des Follikelwaschmediums |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Reinigungsmittel für die Immunfärbung Permeabilisierungspuffer |
| Trizol-Reagenz | Thermo Fisher Scientific | RNA-Isolationsreagenz | |
| Trypanblau-Lösung, 0,4% | Gibco | 15-250-061 | Wird zur Prüfung der Lebensfähigkeit isolierter Follikel |
| Tween 20 | Reinigungsmittel für Immunflecken Waschpuffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warmhalteplatte, um die Follikel bei 38,5 &° zu halten; C bei der Suche unter dem Mikroskop |
| Wiretrol II Kalibrierte Mikropipetten | Drummond | 50002-005 | Mikropipetten aus Glas zur Manipulation von Follikeln |
Referenzen
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
