Methodenartikel

AirID-basierte Proximity-Markierung für Protein-Protein-Interaktion in Pflanzen

DOI:

10.3791/64428

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16. September 2022

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1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung des Proximity-Labeling-Experiments (PL) in Gurken (Cucumis sativus L.) unter Verwendung AT4G18020 (APRR2)-AirID-Proteins als Modell vor. Die Methode beschreibt die Konstruktion eines Vektors, die Transformation eines Konstrukts durch Agroinfiltration, Biotininfiltration, Proteinextraktion und die Reinigung von Biotin-markierten Proteinen durch Affinitätsreinigungstechnik.

Zusammenfassung

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In Säugetierzellen und -pflanzen haben sich Proximity-Labeling-Ansätze (PL) mit modifizierter Ascorbatperoxidase (APEX) oder der Escherichia coli-Biotin-Ligase BirA (bekannt als BioID) als erfolgreich erwiesen, um Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) zu identifizieren. APEX, BioID und TurboID, eine überarbeitete Version von BioID, haben nicht nur wertvolle Technologien, sondern auch einige Einschränkungen. Die kürzlich entwickelte AirID, eine neuartige Version von BioID zur Proximity-Identifizierung in Protein-Protein-Interaktionen, hat diese Einschränkungen überwunden. Zuvor wurde AirID in Tiermodellen eingesetzt, während die aktuelle Studie die Verwendung von AirID in Pflanzen demonstriert, und die Ergebnisse bestätigten, dass AirID in pflanzlichen Systemen besser abschneidet als andere PL-Enzyme wie BioID und TurboID für die Proteinmarkierung, die sich proximal zu den Zielproteinen befinden. Hier finden Sie ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern unter Verwendung AT4G18020 (APRR2)-Proteins als Modell. Die Methoden beschreiben die Konstruktion von Vektoren, die Transformation von Konstrukten durch Agroinfiltration, die Umwandlung von Biotin, die Extraktion von Proteinen und die Anreicherung von Biotin-markierten Proteinen durch Affinitätsreinigungstechniken. Die Ergebnisse kommen zu dem Schluss, dass AirID ein neuartiges und ideales Enzym für die Analyse von PPIs in Pflanzen ist. Die Methode kann angewendet werden, um andere Proteine in Pflanzen zu untersuchen.

Einleitung

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Verschiedene zelluläre Proteine arbeiten unter dem biologischen Regulationssystem, und Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) sind ein Teil dieses Systems und die Grundlage vieler zellulärer Prozesse. Neben PPIs wird die Funktion natürlicher Proteine durch verschiedene Modifikationen wie Komplexbildung, Ubiquitinierung und Phosphorylierung posttranslational gefördert. Daher ist die Untersuchung von PPIs wichtig, um die mögliche Funktion von Zielproteinen zu verstehen. PPIs wurden mit verschiedenen Technologien durchgeführt, wie z. B. Massenspektrometrie-Analyse nach Immunpräzipitation (IP-MS-Analyse)1, Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H)

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Protokoll

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1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials

  1. Cucumis sativus (Gurke) wird für die experimentelle Analyse eingesetzt. Die Samen in Wasser legen, bei 50 °C 20 min inkubieren und dann die Samen auf Filterpapier für 12-16 h auf eine Petriplatte legen.
  2. Danach werden die Samen in Töpfe mit Erde (im Handel erhältlich) umgefüllt und in einer Klimakammer bei 23 °C Temperatur und 16 Stunden Licht und 8 Stunden dunkler Photoperiode angebaut.
  3. Halten Sie die Pflanzen 3-4 Wochen lang in der Klimakammer, bis die Pflanzen 3 oder 4 Blattstadien für eine erfolgreiche Agroinfiltration erreicht haben.

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Ergebnisse

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Nach bisherigen Forschungen ist das Gurkengen APRR2 das Kandidatengen, das die Farbe weißer, unreifer Früchte steuert8. Hier wurde ein Protokoll entwickelt, das AirID als Proximity-Markierungsenzym verwendet, um das interagierende Partnerprotein von APRR2 in Gurken zu finden. Das Konstrukt wurde auf die Gurkenblätter übertragen, und 36 Stunden nach der Infiltration wurde Biotin übertragen. Nach 48 h wurden die Proben für die Western-Blot-Analyse entnommen, um die erfolgreiche Tra.......

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Diskussion

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Im aktuellen Experiment wurde AirID für die Proximity-Markierung verwendet, die Kido et al. durch einen Algorithmus zur Rekonstruktion von Ahnenenzymen unter Verwendung eines großen Genomdatensatzes und fünf konventioneller BirA-Enzyme entwickelt haben5. Zufällige Mutationen wurden im traditionellen evolutionären Protein-Engineering verwendet, um die Aktivitätzu erhöhen 9,10, da zufällige Mutationen keine dynamischen Sequenzänderungen herv.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklärten, dass keine Interessenkonflikte vorlägen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32000197 to X.H.), dem Special Financial Grant der China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2019T120467 to X.H.)

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetosyringonBeijing Solaribo Wissenschaft und Technologie Co.LtdS1519
Acryl/Bis 30% LösungSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
AgaroseTsingke (Shanghai) Co.LtdTSJ001
AmmoniumbicarbonatSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd
BiotinBBI life SciencesG908BA0012
CaCl2BBI life SciencesE209BA0008
Kompetente Zellen GV3101Hergestellt im aktuellen Experiment
Entsalzungskolonne ThermoscientificWC321753
DesoxycholsäureSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd
DH5α kompetente ZellenHergestellt im aktuellen ExperimentE.coli DH5α
β-D-MaltosideBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Shanghai) Co.LtdE104BA0029
GlycineSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd161BA0031
HEPESBeijing solaribo science and technology Co.LtdH8090
LiClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH209BA0003
MESBeijing solaribo science and technology Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Deutschland3429963Schnellfiltration Materialfilter
MgCl2Beijing solaribo science and technology Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH324BA0003
NP40Sangon Biotech (Shanghai) Co.LtdN8030
Proteininhibitor CocktailBeijing Scolario Wissenschaft und Technologie Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD 5820172
SDSBeijing Scolario Wissenschaft und Technologie Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdS9430
Streptavidin-C1-konjugierte magnetische KügelchenEnriching Biotechnology7E511E1Magnetische Kügelchen
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd GB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdF828BA0020
TryptonThermo scientificLP0042
G313BA0018G818BA0029

Referenzen

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  1. Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226(2015).
  2. Zhao, S., et al.

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Schlagwörter

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