AirID-basierte Proximity-Markierung für Protein-Protein-Interaktion in Pflanzen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung des Proximity-Labeling-Experiments (PL) in Gurken (Cucumis sativus L.) unter Verwendung AT4G18020 (APRR2)-AirID-Proteins als Modell vor. Die Methode beschreibt die Konstruktion eines Vektors, die Transformation eines Konstrukts durch Agroinfiltration, Biotininfiltration, Proteinextraktion und die Reinigung von Biotin-markierten Proteinen durch Affinitätsreinigungstechnik.

Zusammenfassung

In Säugetierzellen und -pflanzen haben sich Proximity-Labeling-Ansätze (PL) mit modifizierter Ascorbatperoxidase (APEX) oder der Escherichia coli-Biotin-Ligase BirA (bekannt als BioID) als erfolgreich erwiesen, um Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) zu identifizieren. APEX, BioID und TurboID, eine überarbeitete Version von BioID, haben nicht nur wertvolle Technologien, sondern auch einige Einschränkungen. Die kürzlich entwickelte AirID, eine neuartige Version von BioID zur Proximity-Identifizierung in Protein-Protein-Interaktionen, hat diese Einschränkungen überwunden. Zuvor wurde AirID in Tiermodellen eingesetzt, während die aktuelle Studie die Verwendung von AirID in Pflanzen demonstriert, und die Ergebnisse bestätigten, dass AirID in pflanzlichen Systemen besser abschneidet als andere PL-Enzyme wie BioID und TurboID für die Proteinmarkierung, die sich proximal zu den Zielproteinen befinden. Hier finden Sie ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern unter Verwendung AT4G18020 (APRR2)-Proteins als Modell. Die Methoden beschreiben die Konstruktion von Vektoren, die Transformation von Konstrukten durch Agroinfiltration, die Umwandlung von Biotin, die Extraktion von Proteinen und die Anreicherung von Biotin-markierten Proteinen durch Affinitätsreinigungstechniken. Die Ergebnisse kommen zu dem Schluss, dass AirID ein neuartiges und ideales Enzym für die Analyse von PPIs in Pflanzen ist. Die Methode kann angewendet werden, um andere Proteine in Pflanzen zu untersuchen.

Einleitung

Verschiedene zelluläre Proteine arbeiten unter dem biologischen Regulationssystem, und Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) sind ein Teil dieses Systems und die Grundlage vieler zellulärer Prozesse. Neben PPIs wird die Funktion natürlicher Proteine durch verschiedene Modifikationen wie Komplexbildung, Ubiquitinierung und Phosphorylierung posttranslational gefördert. Daher ist die Untersuchung von PPIs wichtig, um die mögliche Funktion von Zielproteinen zu verstehen. PPIs wurden mit verschiedenen Technologien durchgeführt, wie z. B. Massenspektrometrie-Analyse nach Immunpräzipitation (IP-MS-Analyse)¹, Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H)², auch zellfreie Arrays³. Diese Methoden untersuchten verschiedene wichtige Erkenntnisse im Bereich der Forschung. Diese Methoden haben jedoch einige Nachteile. Zum Beispiel ist Y2H eine zeitaufwändige, teure Strategie, die den Aufbau der Y2H-Bibliothek der Zielspezies erfordert.

Darüber hinaus verwendet die Y2H-Technik Hefe, einen heterologen einzelligen eukaryotischen Organismus, der den zellulären Zustand höherer eukaryotischer Zellen nicht genau widerspiegeln kann. Die IP-MS ist für Proteine mit hoher Hydrophobizität ungeeignet und zeigt eine geringe Effizienz bei der Erfassung schwacher PPIs. Verschiedene essentielle Proteine in Pflanzen, wie z. B. Nukleotid-bindende Domänen- und leucinreiche Repeat-enthaltende (NLR) Proteine und rezeptorähnliche Kinasen (RLKs), werden auf niedrigem Niveau exprimiert und interagieren meist vorübergehend mit anderen Proteinen. Daher ist die Verwendung dieser Methoden nicht ausreichend, um die Mechanismen zu verstehen, die der Regulation dieser Proteine zugrunde liegen³.

Eine neue Technik namens Proximity-Biotinylation (PB) hilft Forschern, PPIs zu identifizieren. PB hängt von PL-Enzymen ab, die an das Protein of Interest (POI) binden, und wenn das Partnerprotein in die Nähe von POI kommt, hängt das PL eine chemische Biotin-Markierung an das Partnerprotein an. Ferner kann das markierte Protein identifiziert werden und kann schnell wissen, welches Partnerprotein an das Zielprotein⁵ bindet. Frühere Studien haben gezeigt, dass BioID und TurboID erfolgreiche Werkzeuge für PPIs sind, insbesondere in Pflanzen, aber sie haben bestimmte Einschränkungen⁴. BioID benötigt für die Markierung von Partnerproteinen, die mehr als 16 h dauert, einen hohen Biotingehalt. Im Vergleich zu BioID ist der TurboID vorteilhafter, da er das Protein in 10 Minuten markiert und das Partnerprotein bei Raumtemperatur (RT) markieren kann. Es ist auch unter bestimmten Bedingungen toxisch für Zellen und markiert diejenigen Proteine, die keine Wechselwirkung mit dem interessierenden Protein zeigen.

Um diese Probleme zu überwinden, ist AirID, das von Kido et al. entwickelt wurde, effizienter als die anderen Markierungsenzyme, obwohl die Sequenzähnlichkeit zwischen BioID und AirID⁵ 82 % beträgt. Um die Effizienz von AirID zu überprüfen, haben wir ein Experiment mit einem POI mit bekannten Partnern durchgeführt. Dieses Experiment bestätigte, dass AirID zweifellos assoziierte Proteine in Pflanzenzellen markieren kann. AirID ist ein wertvolles Enzym für die Analyse von PPIs in vitro und in Zellen. Es erzeugt weniger Toxizität und ist weniger fehlerhaft in zeitaufwändigen Prozessen als TurboID, um Nicht-Partner zu markieren, was zum Abtöten der Zelle führt. Es zeigt, dass AirID für die Proximity-Biotinylierung wettbewerbsfähiger ist als andere Markierungsenzyme. Es ist genauer, hat mehr Potenzial für zeitraubende Prozesse und ist in vitro und in lebenden Zellen weniger toxisch. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Identifizierung von interagierenden Proteinen von APRR2 unter Verwendung von AirID als PL-Enzym; Darüber hinaus kann die Methode auf andere Proteine angewendet werden, um PPIs in Pflanzenarten zu untersuchen.

Protokoll

1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials

1. Cucumis sativus (Gurke) wird für die experimentelle Analyse eingesetzt. Die Samen in Wasser legen, bei 50 °C 20 min inkubieren und dann die Samen auf Filterpapier für 12-16 h auf eine Petriplatte legen.
2. Danach werden die Samen in Töpfe mit Erde (im Handel erhältlich) umgefüllt und in einer Klimakammer bei 23 °C Temperatur und 16 Stunden Licht und 8 Stunden dunkler Photoperiode angebaut.
3. Halten Sie die Pflanzen 3-4 Wochen lang in der Klimakammer, bis die Pflanzen 3 oder 4 Blattstadien für eine erfolgreiche Agroinfiltration erreicht haben.

2. AirID-Konstrukt erstellen

1. Verwenden Sie APRR2 als Zielprotein und konstruieren Sie APRR2-AirID unter dem 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (p35S: APRR2-AirID). Führen Sie es in den Gateway-kompatiblen binären Vektor pEarleyGate100⁶ ein (bereitgestellt von Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University) und synthetisieren Sie das PL-Enzym direkt gemäß der in Ergänzungsdatei 1 bereitgestellten Sequenz.

3. Aufbereitung kompetenter Zellen

1. Präparation von DH5α-kompetenten Zellen
   1. Die 2 ml LB (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl; pH = 7,0) werden mit E.Coli DH5α-Zellen (direkt aus dem gefrorenen Fond ohne Auftauen) beimpft und über Nacht (O/N) bei 37 °C gezüchtet.
   2. Frisch 0,1 % bis 0,5 % Inokulum aus der O/N-Kultur in 100 ml LB-Medium inokulieren und die Zellen wachsen lassen, bis OD₆₀₀ zwischen 0,4 und 0,6 liegt, und dann die Kultur bei 4 °C für 30 Minuten inkubieren.
   3. Die Kultur wird in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 2500 x g 5 min bei 4 °C geschleudert.
   4. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml 0,1 M eiskaltem CaCl₂ und legen Sie sie 15 Minuten lang auf Eis. Die Zellen werden mit 2500 x g Schleudern für 5 min bei 4 °C pelletiert.
   5. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskaltem 0,1 M CaCl₂ + 20 % Glycerin, aliquoten 100 μl in jedes 1,5 ml-Röhrchen und lagern Sie sie sofort bei -80 °C.
2. Präparation von GV3101 kompetenten Zellen
   1. Beimpfen Sie 2 ml LB (mit 50 μg/ml Gentamycin und 25 μg/ml Rifampicin) mit einer einzigen GV3101-Kolonie. Die Kultur O/N wird bei 28 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert.
   2. Beimpfen Sie 200 ml LB mit 1 ml einer gesättigten Kultur über Nacht. Die Kultur wird bei 250 U/min geschüttelt und bei 28 °C inkubiert, bis der OD₆₀₀ gleich 0,5 ist.
   3. Die Kultur wird in vier vorgekühlte, sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 30 Minuten lang auf Eis gelegt.
   4. Die Zellen werden bei 2500 x g für 10 min bei 4 °C pelletiert. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie die Pellets auf Eis.
   5. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml 0,1 M eiskalter CaCl_2-Lösung . Fassen Sie die Zellen in einem vorgekühlten 50-ml-Oakridge-Röhrchen zusammen.
   6. Die Zellen werden bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml eiskalter CaCl_2-Lösung . 30 Min. auf Eis stellen.
   7. Die Zellen werden bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml 0,1 M eiskalter CaCl_2-Lösung .
   8. Geben Sie die Zellen in ein 50-μl-Aliquot in vorgekühlten, sterilen Polypropylenröhrchen. Lagern Sie die Zellen bei -80 °C.

4. Agroinfiltration

1. Übertragen Sie zunächst das Plasmid auf Agrobacterium
   1. 2,5 μl des aus Schritt 2.1 erzeugten Plasmids werden in die kompetenten Zellen des Stamms Agrobacterium tumefaciens GV3101 übertragen und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert.
   2. Das Röhrchen mit dem Plasmid und den entsprechenden Zellen wird 3 Minuten lang in flüssigen Stickstoff gegeben.
   3. Hitzeschock bei 37 °C für 5 min in einem Inkubator und dann 2 min auf Eis legen.
   4. 1.000 μl LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl; pH = 7,0) zum Agrobakterium geben und bei 30 °C und 118 U/min 1 h inkubieren.
   5. Bei 3.000 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren.
   6. Die oberen 800 μl der Lösung werden verworfen und die verbleibende Lösung gemischt. Dann wird es auf LB (wie in Schritt 4.1.4 erwähnt, mit Agar und 50 μg/ml Kanamycin für das Plasmid und 50 μg/ml Gentamycin und 25 μg/ml Rifampicin für GV3010-kompetente Zellen hinzugefügt) aufgetragen. Die Platten 48 h bei 30 °C inkubieren.
      HINWEIS: Es ist besser, einige Kolonien auszuwählen und eine PCR durchzuführen, um das interessierende Gen zu bestätigen⁷.
2. Nehmen Sie einige Bakterienkolonien von den Platten auf und legen Sie sie in LB-Medien und geeignete Antibiotika (siehe Schritt 4.1.6). Bei 30 °C und 218 U/min 36-48 h inkubieren.
3. Die Zellen werden bei 3.000 x g für 2 Min. bei 4 °C zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen auf OD₆₀₀ = 1,0 in Agroinfiltrationspuffer (10 mM MgCl₂, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM Acetosyringon).
4. Infiltrieren Sie das Inokulum (erzeugt aus Schritt 4.3) in die (abaxiale) Epidermis mit einer nadellosen 1-ml-Spritze.
   HINWEIS: Es ist besser, das gesamte Blatt zu infiltrieren und sich für die Replikation zu entscheiden. Verwende für 4-5 Pflanzen ein Konstrukt. Für jedes Blatt sind 1,5 ml resuspendierte Agrobakterien ausreichend.
5. Halten Sie die Pflanzen für 36 h in der Klimakammer mit 16 h Licht (ca. 75 μmol·^m-2·^s-1) und 8 h dunkler Photoperiode bei 23 °C.
6. Nach 36 h Konstruktinfiltration infiltrieren Sie 1 ml 5 μM Biotin (in 10 mM_{MgCl2-Lösung} ) in die bereits infiltrierten Blätter des Konstrukts.
7. Pflegen Sie die behandelten Pflanzen für weitere 4-12 Stunden, bevor Sie das Blattgewebe ernten.
   HINWEIS: Laut der vorherigen Studie erreicht das Zielprotein nach 36 Stunden seinen Höhepunkt, also wählen Sie 36 HPI Biotin-Infiltrationen ^4,6. Die Inkubationsdauer für Biotin hängt von der Zielstudie ab, aber nach dem aktuellen Experiment ist eine Inkubationszeit von 8 Stunden für die Markierung von Proteinen besser geeignet.

5. Entnahme von Proben

HINWEIS: Alle Materialien für die Probenentnahme sollten steril sein, um eine Kontamination mit Keratin zu vermeiden, und alle Protokollschritte sollten in einer kontaminationsfreien Umgebung durchgeführt werden.

1. Schneiden Sie die infiltrierten Blätter ab und geben Sie sie schnell in flüssigen Stickstoff um, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
2. Durchführung des Vornachweises von Proteinen durch Immunoblot-Analysen⁶; dies wird vor der Co-Immunpräzipitation (Co-IP) dringend empfohlen.

6. Gesamtproteinextraktion aus dem Blatt

1. Die Blätter mit einem Stößel und Mörser zerkleinern, schnell 2 ml 1x PBS-BSA PH 7,4 hinzufügen und langsam mahlen.
2. Nehmen Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen, platzieren Sie einen Schnellfiltrationsmaterialfilter auf dem konischen Röhrchen, überführen Sie die Probenmischung durch den Schnellfiltrationsmaterialfilter in das Röhrchen und lassen Sie es auf Eis liegen.
3. Überführen Sie die Proben in ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie 1 % Proteininhibitor-Cocktail hinzu.
4. Mischen Sie den Inhalt durch 7-8-faches Drehen nach oben und unten und zentrifugieren Sie ihn bei 1.000 x g für 2 min bei 4 °C.
5. Das obere Lösungsmittel der Proben wird in neue 2-ml-Röhrchen überführt, 10 % β-D-Maltosid (β-D.M.) hinzugefügt und 5 Minuten lang auf Eis gelegt. Bei 20.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.

7. Entsalzungskolonne ausgleichen

1. Die Säule wird bei 1.000 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugiert.
   HINWEIS: Markieren Sie eine Seite der Säule und stellen Sie sicher, dass die markierte Seite während aller Zentrifugationsvorgänge nach außen zeigt.
2. Die obere und untere Abdeckung der Säule werden entfernt und bei 1.000 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert.
3. Entsorgen Sie die flüssige Lösung aus dem Sammelröhrchen der Säule und fügen Sie 5 ml 1x PBS-Puffer zum Waschen hinzu.
4. Die Säule wird bei 1.000 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert.
5. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 und 7.4 mindestens fünfmal.

8. Waschen von magnetischen Perlen

1. Nehmen Sie ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 50 μl Streptavidin-C1-konjugierte magnetische Kügelchen hinzu.
2. 1 ml 1x PBS-BSA zum Waschen hinzufügen, gründlich mischen und für 3 Minuten auf den Magnetständer stellen. Verwerfen Sie den Überstand.
3. Wiederholen Sie Schritt 8.2 mindestens dreimal.
4. Legen Sie das Röhrchen nach jedem Waschen auf das magnetische Gestell, um die Kügelchen an einer Seite des Röhrchens zu adsorbieren und den Waschpuffer zu entfernen.

9. Anreicherung von biotinylierten Proteinen

1. 2 ml der Proben in die Säule geben und bei 1.000 x g 8 min bei 4 °C zentrifugieren.
2. Geben Sie 1 ml des entsalzten Proteinextrakts zu 50 μl Streptavidin-C1-konjugierten magnetischen Kügelchen, um sie auszugleichen.
3. Legen Sie das Röhrchen mit normaler Geschwindigkeit auf den Rotator, damit sich die Lösung gründlich vermischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert wird.
4. Legen Sie die Perlen für 3 Minuten bei RT auf das magnetische Gestell oder bis sie sich auf einer Seite des Röhrchens sammeln, um den Überstand vorsichtig zu entfernen.
5. 1 ml Waschpuffer I (2 % SDS in Wasser) zugeben, 2 min auf einem Rotator bei RT rotieren und Schritt 9.4 wiederholen.
6. Stellen Sie das Röhrchen nach Zugabe von 1 ml Waschpuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % Desoxycholsäure [w/v] und 1 % Triton X-100) für 2 Minuten auf den Rotator. Wiederholen Sie Schritt 9.4.
7. 1 ml Waschpuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % Desoxycholsäure [w/v], 1 % NP40 [v/v]) zugeben und mit einem Schüttler 2 min bei RT drehen. Wiederholen Sie dann Schritt 9.4.
8. Um das Reinigungsmittel zu entfernen, fügen Sie 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) hinzu und wiederholen Sie Schritt 9.4. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
9. Die Kügelchen werden sechsmal für jeweils 2 min in 1 ml 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer bei RT gewaschen und Schritt 9.4 wiederholt.
10. 50 μl des Proteinextrakts mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 % (w/v) Saccharose (Suc), 2 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat und 1,5 % (w/v) Dithiothreitol zu den Kügelchen geben, 5 min lang im Inkubator bei 100 °C hitzeschockieren und Schritt 9.4 befolgen. Lagern Sie den Überstand bei -80 °C für die LC-MS/MS-Analyse.

Ergebnisse

Nach bisherigen Forschungen ist das Gurkengen APRR2 das Kandidatengen, das die Farbe weißer, unreifer Früchte steuert⁸. Hier wurde ein Protokoll entwickelt, das AirID als Proximity-Markierungsenzym verwendet, um das interagierende Partnerprotein von APRR2 in Gurken zu finden. Das Konstrukt wurde auf die Gurkenblätter übertragen, und 36 Stunden nach der Infiltration wurde Biotin übertragen. Nach 48 h wurden die Proben für die Western-Blot-Analyse entnommen, um die erfolgreiche Tra...

Diskussion

Im aktuellen Experiment wurde AirID für die Proximity-Markierung verwendet, die Kido et al. durch einen Algorithmus zur Rekonstruktion von Ahnenenzymen unter Verwendung eines großen Genomdatensatzes und fünf konventioneller BirA-Enzyme entwickelt haben⁵. Zufällige Mutationen wurden im traditionellen evolutionären Protein-Engineering verwendet, um die Aktivität^{zu erhöhen 9,10}, da zufällige Mutationen keine dynamischen Sequenzänderungen herv...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetosyringon	Beijing Solaribo Wissenschaft und Technologie Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% Lösung	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	Tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammoniumbicarbonat	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Kompetente Zellen GV3101	Hergestellt im aktuellen Experiment
Entsalzungskolonne Thermo	scientific	WC321753
Desoxycholsäure	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd
DH5α kompetente Zellen	Hergestellt im aktuellen Experiment		E.coli DH5α
β-D-Maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Deutschland	3429963	Schnellfiltration Materialfilter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Proteininhibitor Cocktail	Beijing Scolario Wissenschaft und Technologie Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD 5820172
SDS	Beijing Scolario Wissenschaft und Technologie Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-konjugierte magnetische Kügelchen	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetische Kügelchen
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Trypton	Thermo scientific	LP0042