Ein effizientes Clearing-Protokoll zur Untersuchung der Saatgutentwicklung bei Tomaten (Solanum lycopersicum L.)

Tomate (S. lycopersicum L.) ist eine der wichtigsten Gemüsekulturen der Welt, mit einer Produktion von 186,8 Millionen Tonnen fleischigen Früchten von 5,1 Millionen Hektar im Jahr 2020¹. Es gehört zur großen Familie der Solanaceae mit etwa 2.716 Arten², darunter viele kommerziell wichtige Kulturen wie Auberginen, Paprika, Kartoffeln und Tabak. Die Kulturtomate ist eine diploide Art (2n = 2x = 24) mit einer Genomgröße von ca. 900^Mb3. Seit langem werden große Anstrengungen unternommen, um Tomatendomestizierung und -züchtung zu züchten, indem wünschenswerte Merkmale aus wilden Solanum spp. Es gibt über 5.000 Tomatenakzessionen, die im Tomato Genetics Resource Center aufgeführt sind, und mehr als 80.000 Keimplasma von Tomaten werden weltweit gelagert⁴. Die Tomatenpflanze ist mehrjährig im Gewächshaus und vermehrt sich durch Samen. Ein reifer Tomatensamen besteht aus drei Hauptkompartimenten: einem ausgewachsenen Embryo, einem zellulären Endosperm und einer harten Samenschale ^5,6 (Abbildung 1A). Nach doppelter Befruchtung geht die Entwicklung von zellulärem Endosperm der Entwicklung von Zygoten voraus. Bei ~5-6 Tagen nach der Blüte (DAF) wird erstmals ein zweizelliger Proembryo beobachtet, wenn das Endosperm aus sechs bis acht Kernen besteht⁷. Bei Solanum pimpinellifolium nähert sich der Embryo nach 20 DAF seiner endgültigen Größe, und die Samen sind nach 32 DAF⁸ für die Keimung geeignet. Wenn sich der Embryo entwickelt, wird das Endosperm allmählich absorbiert und nur eine kleine Menge Endosperm verbleibt im Samen. Das restliche Endosperm besteht aus mikropylarem Endosperm, das die Radikelspitze umgibt, und seitlichem Endosperm im Rest des Samens ^9,10. Die äußere Samenhülle wird aus verdickter und verholzter äußerer Epidermis des Integuments entwickelt, und mit den abgestorbenen Schichten von Integumentresten bilden sie eine harte Schale, um den Embryo und das Endosperm zu schützen⁵.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines reifen Samens in Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana. (A) Längsanatomie eines reifen Tomatensamens. (B) Längsanatomie eines reifen Arabidopsis-Samens. Ein reifer Tomatensamen ist etwa 70-mal größer als ein Arabidopsis-Samen. Maßstabsbalken = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Produktion hochwertiger Tomatensamen hängt von der Koordination zwischen dem Embryo, dem Endosperm und den mütterlichen Samenbestandteilen ab¹¹. Die Analyse von Schlüsselgenen und Netzwerken in der Samenentwicklung erfordert eine tiefe und vollständige phänotypische Aufzeichnung von mutierten Samen. Konventionelle Einbettungsschnitttechniken, wie der Halbdünnschliff und der Paraffinschnitt, werden häufig auf Tomatensamen angewendet, um die lokalen und feineren Strukturen des Embryos^{zu beobachten 12,13,14,15}. Die Analyse der Seed-Entwicklung aus dünnen Schnitten ist jedoch in der Regel mühsam und es fehlt die räumliche Auflösung der z-Achse. Im Vergleich dazu ist die Gewebereinigung eine schnelle und effiziente Methode, um das Entwicklungsstadium von embryonalen Defekten zu bestimmen, die am wahrscheinlichsten auftreten¹⁶. Das Clearing-Verfahren verringert die Undurchsichtigkeit des inneren Gewebes durch Homogenisierung des Brechungsindex mit einem oder mehreren biochemischen Mitteln¹⁶. Die gesamte Gewebereinigung ermöglicht die Beobachtung einer pflanzlichen Gewebestruktur, ohne ihre Integrität zu zerstören, und die Kombination von Clearing-Technologie und dreidimensionaler Bildgebung ist zu einer idealen Lösung geworden, um Informationen über die Morphologie und den Entwicklungszustand eines Pflanzenorgans zu erhalten^17,18. Im Laufe der Jahre wurden Samenreinigungstechniken bei verschiedenen Pflanzenarten eingesetzt, darunter Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare und Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Unter diesen war die Whole-mount-Eizellenreinigungstechnologie ein effizienter Ansatz zur Untersuchung der Samenentwicklung von Arabidopsis, aufgrund ihrer geringen Größe, 4-5 Schichten der Samenhüllenzelle und des nuklearen Endosperms^24,25. Mit der kontinuierlichen Aktualisierung verschiedener Clearing-Mischungen, wie dem Auftauchen der Hoyer-Lösung²⁶, wurden die inneren Strukturen der Gerstenzelle mit einem hohen Grad an Klarheit abgebildet, obwohl ihr Endosperm den Großteil der Samen ausmacht. Die Embryogenese von Zuckerrüben kann durch Reinigung in Kombination mit Vakuumbehandlung und Erweichung mit Salzsäure^{beobachtet werden 19}. Im Gegensatz zu den oben genannten Arten wurden jedoch keine embryologischen Beobachtungen durch Clearing-Protokolle in Tomatensamen berichtet. Dies verhindert eine detaillierte Untersuchung der Embryonal- und Samenentwicklung von Tomaten.

Chloralhydrat wird üblicherweise als Reinigungslösung verwendet, die es ermöglicht, die eingetauchten Gewebe und Zellen auf verschiedenen optischen Ebenen darzustellen und die Zellen oder Gewebekomponenten im Wesentlichen zu erhalten 27,28,29. Das auf Chloralhydrat basierende Clearing-Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Reinigung von Samen verwendet, um den Embryo und das Endosperm von Arabidopsis^21,28 zu beobachten. Diese Clearing-Lösung ist jedoch nicht effizient bei der Reinigung von Tomatensamen, die undurchlässiger sind als Arabidopsis-Samen. Zu den physischen Barrieren gehören: (1) das Tomatenintegument hat fast 20 Zellschichten bei 3 bis 15 DAF 30,31, (2) das Tomatenendosperm ist zellulär, nicht vom Kerntyp 32, und (3) Tomatensamen sind etwa^70-mal größer in der Größe^33,34 und (4) produzieren große Mengen an Samenmantelschleimstoffen^, die das Eindringen von Reinigungsreagenzien blockieren und die Visualisierung von Embryozellen beeinträchtigen.

Daher stellt dieser Bericht eine optimierte Chloralhydrat-basierte Clearing-Methode für die vollständige Reinigung von Tomatensamen in verschiedenen Stadien vor, die eine tiefe Bildgebung des Embryo-Entwicklungsprozesses ermöglicht (Abbildung 2).

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie das FAA-Fixiermittel durch Zugabe von 2,5 ml 37% Formaldehyd, 2,5 ml Eisessig und 45 ml 70% Ethanol in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Vortex und lagern Sie es bei 4 °C. FAA Fixiermittel kurz vor Gebrauch frisch zubereiten.
   ACHTUNG: 37% Formaldehyd ist ätzend und potenziell krebserregend, wenn es exponiert oder eingeatmet wird. Das Fixiermittel muss in einem Abzug unter Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
2. Bereiten Sie die Reinigungslösung vor, indem Sie 5 ml 100% Glycerin, 40 g Chloralhydrat und 10 ml destilliertes Wasser in einer 100-ml-Glasflasche hinzufügen, die mit Zinnfolie umwickelt ist. Mit einem Magnetrührer über Nacht bei Raumtemperatur auflösen. Die vorbereitete Lösung kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
   ACHTUNG: Chloralhydrat ist krebserregend und riecht stechend. Führen Sie das Experiment in einem Abzug durch und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung. Chloralhydrat lässt sich leicht in der Luft entwässern und sollte nicht in großen Mengen gelagert werden. Die Reinigungslösung kann sich bei Lichteinwirkung zersetzen und sollte von Licht ferngehalten werden.
3. Bereiten Sie die Desinfektionslösung vor, indem Sie 10 ml 6% Natriumhypochlorit, 40 ml destilliertes Wasser und 50 μL Tween-20 in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzufügen. Vortex und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Desinfektionslösung kurz vor Gebrauch frisch zu.
   HINWEIS: Der effektive Chlorgehalt von Natriumhypochlorit, der für eine lange Zeit platziert wurde, kann abnehmen, und der Gehalt an 6% Natriumhypochlorit kann entsprechend der tatsächlichen Situation erhöht werden.

2. Saatgutsammlung

1. Tomatensamen (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, siehe Materialtabelle) in 8 cm × 8 cm × 8 cm großen quadratischen Becken mit einer 1:1-Mischung aus Blütennährstofferde und Substrat (v/v) aussäen (siehe Materialtabelle) und wachsen in einem Wachstumsraum mit 16/8 h Hell-Dunkel-Perioden bei 24 ± 2 °C (Tag) und 18 ± 2 °C (Nacht), 60% -70% relative Luftfeuchtigkeit und eine Lichtintensität von 4.000 Lux. Etwa 6 Wochen später traten die Pflanzen in die Blütephase ein.
2. Markieren Sie das Blütedatum unabhängiger Blüten an der Anthese (Öffnungswinkel der Blütenblätter beträgt 90°) und notieren Sie den Tag nach der Blüte (DAF).
3. Ernten Sie die Früchte von 3 bis 23 DAF-Tomatenpflanzen und legen Sie sie sofort auf Eis. Teilen Sie Früchte (Samen oder Embryonen) von 3 bis 23 DAF in frühe (3-10 DAF), mittlere (11-16 DAF) und späte (17-23 DAF) Früchte (Samen oder Embryonen).
   HINWEIS: Sammeln Sie nicht zu viele Früchte auf einmal und stellen Sie sicher, dass die Samen in jeder Frucht innerhalb von 1 Stunde zur weiteren Behandlung entfernt werden.
4. Für frühe Früchte brechen Sie die Früchte und legen Sie sie auf einen Objektträger und sammeln Sie frische Samen sorgfältig mit einer Präzisionszange unter dem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle) bei 1x bis 4-facher Vergrößerung. Für mittlere und späte Früchte brechen Sie die Früchte und sammeln Sie frische Samen direkt mit einer Präzisionszange.

3. Chloralhydrat-basierte Reinigung von Samen

HINWEIS: Konventionelle³⁵ und optimierte Protokolle wurden in dieser Studie hinsichtlich ihrer Saatgutreinigungseffizienz verglichen.

1. Clearing mit einem herkömmlichen Protokoll
   1. Frisches Saatgut (erhalten in Schritt 2.4) sofort in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml FAA-Fixiermittel geben und auf einem Orbitalschüttler (5 U/min, siehe Materialtabelle) 4 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Dehydrieren Sie diese Samen in einer Ethanolserie von 70%, 95% und 100% Ethanol (v / v) für jeweils 1 h auf einem Orbitalschüttler (5 U/min).
   3. Legen Sie die Samen in 3-5 Tropfen Reinigungslösung (~ 100 μL) auf den Objektträger und bedecken Sie die Probe vorsichtig mit einem Deckglas. Ersetzen Sie den Objektträger durch einen einzelnen konkaven Objektträger (siehe Materialtabelle) für mittlere und späte Samen.
   4. Bewahren Sie diese Objektträger oder einzelnen konkaven Objektträger bei Raumtemperatur für 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 Tag (9 DAF), 3 Tage (12 DAF) oder 7 Tage (14 bis 22 DAF) auf, abhängig von den Entwicklungsstadien des Saatguts (je jünger die Materialien, desto schneller die Clearing-Geschwindigkeit).
   5. Beobachten Sie die Proben mit einem DIC-Mikroskop (Differential Interference Contrast), das mit einer Digitalkamera (siehe Materialtabelle) bei 10-facher, 20-facher und 40-facher Vergrößerung ausgestattet ist. Passen Sie die Durchlichthelligkeit, den DIC-Schieberegler und die Kondensatorblende in Echtzeit für jede Probe an und optimieren Sie sie.
2. Clearing mit dem optimierten Protokoll
   1. Frisches Saatgut (erhalten in Schritt 2.4) wird direkt in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml Desinfektionslösung gegeben (Schritt 1.3).
      HINWEIS: Die Anzahl der Samen, die in der 2-ml-Zentrifugenröhre gesammelt werden, variiert je nach Entwicklungsstadium der Samen. Einzelheiten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   2. Inkubieren Sie die Proben auf einem Orbitalschüttler (30 U/min) bei Raumtemperatur für 3 bis 50 Minuten, bis der innerste Saatmantelumriss deutlich sichtbar ist. Entsorgen Sie die Desinfektionslösung.
      HINWEIS: Die erforderliche Inkubationszeit hängt vom Saatgutentwicklungsstadium ab (je später die Samen, desto länger ist die Inkubationszeit). Einzelheiten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   3. Bei mittleren und späten Samen die Samen auf einen Objektträger übertragen und den Samenschleim mit einer Pinzette und einer Seziernadel unter einem Stereomikroskop bei 1- bis 4-facher Vergrößerung entfernen. Die Samen werden mit einer Pinzette wieder in das ursprüngliche Zentrifugenröhrchen überführt.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist für frühe Samen nicht erforderlich.
   4. Waschen Sie die Samen 5x mit 1,5 ml entionisiertem Wasser, jeweils 10 s. Entsorgen Sie das entionisierte Wasser.
   5. Eine Reinigungslösung von 2 × Volumen der Samen zugeben, gefolgt von einer Vakuumbehandlung für 0 bis 50 min (Tabelle 1) mit einer Vakuumpumpe (siehe Materialtabelle). Die intermittierende Vakuumbehandlung wird mit jeder Vakuumbehandlung für 10 Minuten im Abstand von 10 Minuten durchgeführt.
   6. Ersetzen Sie durch eine frische Reinigungslösung von 2 × Volumen der Samen. Bewahren Sie das 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit den Samen 30 Minuten bis 7 Tage lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt auf, um die Reinigung zu erleichtern (Tabelle 1). Während der Inkubation wird bei späten Embryonen die Clearing-Lösung täglich durch frische Lösung ersetzt und die Samen 10 min lang einer Vakuumbehandlung unterzogen.
   7. Bereiten Sie die geklärten Samen auf Objektträgern oder einfach konkaven Objektträgern vor und beobachten Sie sie mit dem DIC-Mikroskop, das mit einer Digitalkamera in 10-facher, 20-facher und 40-facher Vergrößerung ausgestattet ist. Passen Sie die Durchlichthelligkeit, den DIC-Schieberegler und die Kondensatorblende in Echtzeit für jede Probe an und optimieren Sie sie.

Wenn Tomatensamen mit einer herkömmlichen Methode wie bei Arabidopsis entfernt wurden, blockierten dichte Endospermzellen die Visualisierung früher Tomatenembryonen bei 3 DAF und 6 DAF (Abbildung 3A,B). Als das Gesamtvolumen des Embryos zunahm, war ein kugelförmiger Embryo bei 9 DAF kaum zu unterscheiden (Abbildung 3C). Als die Samengröße jedoch weiter zunahm, nahm ihre Permeabilität ab, was zu einem unscharfen Herzembryo bei 12 DAF führte (Abbildung 3D). Ab 13 DAF wurden Samenschleim und Saatschale allmählich dichter, wodurch das Eindringen von Klärmitteln verhindert wurde. Der Umriss des Embryos in 14-19 DAF-Samen war extrem verschwommen, selbst wenn die Behandlungszeit auf 7 Tage verlängert wurde (Abbildung 3E-G). Bei 22 DAF-Samen war die innere Struktur des Samens vollständig unsichtbar (Abbildung 3H).

Daher wurde das konventionelle Chloralhydrat-basierte Clearingverfahren optimiert, um eine effiziente Reinigung von Tomatensamen zu ermöglichen. Details zu allen Schritten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Erstens wurden die FAA-Fixierungs- und Ethanol-Dehydratisierungsschritte, die bei herkömmlichen Clearing-Verfahren häufig erforderlich sind, im Protokoll weggelassen. Während die FAA-Fixierung im Allgemeinen verwendet wird, um die morphologische Struktur und die zellulären Komponenten vor dem Zerfall zu bewahren, wurde (in dieser Studie) festgestellt, dass die innere Struktur von Tomatensamen nicht leicht deformiert wurde und trotz des Fehlens von FAA-Fixierung und Ethanol-Dehydratation gut erhalten blieb.

Zweitens ist der Samenmantelschleim, der von den epidermalen Zellen der Samenhülle produziert wird, ab 13 DAF sehr ausgeprägt (Abbildung 4). Der polysaccharidreiche Samenschleim zeigte eine hohe Viskosität und eine signifikant geringe Permeabilität35,36. Erste Versuche, es zu entfernen, ohne die Samenschale mit feinen Pinzetten und Nadeln unter einem Seziermikroskop zu zerstören, scheiterten leider. Dies liegt daran, dass die Samenhülle spröde und eng mit dem Schleim verbunden ist. Darüber hinaus führt das Vorhandensein von Pigment in der Samenschale weiter zu einer Verschlechterung der Qualität des Hellfeldbildes37. Um dieses Problem zu überwinden, wurden die Samen mit einer Desinfektionslösung aus 1,2% Natriumhypochlorit und 0,1% Tween 20 behandelt. Die Bleichwirkung von Natriumhypochlorit ermöglicht eine eindeutige Identifizierung der inneren Samenhülle und schafft eine relativ sterile Umgebung, in der Proben lange gelagert werden können. Die Verwendung von Waschmittel Tween 20 könnte die Oberflächenspannung senken und die Samendurchlässigkeit erhöhen. Noch wichtiger ist, dass nach diesem Schritt der größte Teil des anhaftenden Schleims vom Samen gelöst werden kann, ohne die Samenhülle zu beschädigen (Abbildung 4). Fortan wurden die behandelten Samen in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen zusammengefasst und bei Raumtemperatur in einem Orbitalschüttler (30 U/min) inkubiert.

Drittens wurde eine Vakuumbehandlung verwendet, um das Eindringen der Clearing-Lösung in die Embryonen im mittleren und späten Stadium zu beschleunigen. Da Tomatensamen nach 12 DAF besonders größer sind, wurden herkömmliche Objektträger bei der DIC-Bildgebung durch einzelne konkave Objektträger ersetzt.

Nach der Behandlung nach dem optimierten Clearing-Protokoll zeigten Tomatensamen in allen getesteten Entwicklungsstadien eine zufriedenstellende Transparenz (Abbildung 5A-L). Im Gegensatz zu unscharfen Zellkonturen, die mit herkömmlichen Protokollen erhalten wurden, waren unterschiedliche Zellschichten der Samenhülle bei 3 DAF sichtbar (Abbildung 5A). Endospermzellen waren bei 5 DAF besser unterscheidbar (Abbildung 5B). Der stabförmige Embryo erschien bei 7 DAF, und dann erreichte der Embryo das kugelförmige Stadium bei 9 DAF und das Herzstadium bei 11 DAF (Abbildung 5C-E). Während dieser Entwicklungsstadien waren die Umrisse der Zellen im Inneren des Embryos am deutlichsten sichtbar. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode erzeugte das optimierte Protokoll eine deutlich bessere Bildqualität vom Herzstadium bis zum reifen Embryostadium. Als die embryonale Entwicklung das frühe Torpedostadium bei 13 DAF, das mittlere Torpedostadium bei 14 DAF, das späte Torpedostadium bei 15 DAF, das frühe Keimblattstadium bei 16 DAF, das gebogene Keimblattstadium bei 19 DAF und 21 DAF und den reifen Embryo bei 23 DAF erreichte, war der Grad der Kräuselung von Keimblättern und Sprossapikalmeristem sehr leicht zu erfassen (Abbildung 5F-L ). Nach 23 DAF war es jedoch nicht möglich, die Details im Embryo zu visualisieren, selbst wenn die Clearing-Behandlung auf über 1 Woche verlängert wurde.

Abbildung 2: Flussdiagramm des konventionellen Protokolls und des optimierten Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Differentielle Interferenzkontrastbilder von S. lycopersicum Eizellen, die mit der konventionellen Clearing-Methode behandelt wurden. (A) Eine Eizelle mit unscharfem Embryosack bei 3 DAF. (B) Embryosack mit sichtbaren Endospermzellen (Pfeilspitzen) bei 6 DAF. (C) Ein kaum unterscheidbarer kugelförmiger Embryo bei 9 DAF. Ein unscharfer Embryo bei (D) 12, (E) 14, (F) 16 und (G) 19 DAF. (H) Die innere Struktur des Samens ist bei 22 DAF völlig unsichtbar. Maßstabsbalken = 25 μm; em = Embryo; es = Embryosack. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Desinfektion von S. lycopersicum-Samen in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die oberen Bilder (A1-F1) sind die gestreiften Samen der sich entwickelnden Früchte bei (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 und (F1) 21 DAF, während die unteren Bilder (A2-F2) Samen sind, die mit Desinfektionslösung behandelt wurden. In A2-F2 ist die innere Saatkontur deutlich zu erkennen. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Differentielle Interferenzkontrastbilder von S. lycopersicum-Embryonen, die mit dem optimierten Protokoll entfernt wurden. (A-L) DIC-Mikroskopiebilder der Tomateneizelle mit sichtbarem Embryosack bei (A) 3 DAF und (B) 5 DAF, (C) einem stabförmigen Embryo bei 7 DAF, (D) einem kugelförmigen Embryo bei 9 DAF, (E) einem Herzembryo bei 11DAF, (F) ein früher Torpedoembryo bei 13 DAF, (G) ein mittlerer Torpedoembryo 14 DAF, (H) ein später Torpedoembryo bei 15 DAF, (I) ein früher Keimblattembryo bei 16 DAF, ein gebogener Keimblattembryo bei (J) 19 DAF und (K) 21 DAF und (L) ein reifer Embryo bei 23 DAF. Maßstabsbalken = 50 μm; em = Embryo; sc = Samenhülle; en = Endosperm; es = Embryosack; hy = Hypokotyl; co = Cotyledon; r = Radikel; sa = apikal schießen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Optimierung des Protokolls zur Verbesserung der Clearing-Wirksamkeit bei Tomatensamen. 1 = Batch-Operationen, Clearing-Beobachtung einer großen Anzahl von Saatgut auf einmal; Samen wurden in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. 2 = Desinfektion mit 6% NaClO:dH2O:Tween-20, im Verhältnis 200:800:1 (v/v); Alle Schritte wurden auf einem Orbitalschüttler mit 30 U/min Schütteln durchgeführt. 3 = Alle Schritte wurden unter einem Seziermikroskop mit Pinzette und Seziernadeln durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. 4 = Die Samen wurden nach jedem Schritt mit destilliertem Wasser gewaschen. 5 = Reinigung mit 100% Glycerin:Chloralhydrat:dH2O, in Anteilen von 1:8:2 (v/w/v). 6 = Jede Vakuumbehandlung dauerte 10 min und wurde in Abständen von 10 min verteilt. 7 = Durch frische Reinigungslösung ersetzen und Samen lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern; Bei Samen von 17 DAF bis 23 DAF die Reinigungslösung durch eine frische Lösung ersetzen und während der gesamten Inkubationszeit täglich 10 Minuten lang vakuumieren.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.