Ein effizientes Clearing-Protokoll zur Untersuchung der Saatgutentwicklung bei Tomaten (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Der Tomatensamen ist ein wichtiges Modell für das Studium der Genetik und Entwicklungsbiologie während der Pflanzenvermehrung. Dieses Protokoll ist nützlich, um Tomatensamen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu entfernen, um die feinere embryonale Struktur zu beobachten.

Abstract

Tomate (Solanum lycopersicum L.) ist eine der wichtigsten Cash Crops weltweit. Der Tomatensamen ist ein wichtiges Modell für das Studium der Genetik und Entwicklungsbiologie während der Pflanzenvermehrung. Die Visualisierung einer feineren embryonalen Struktur innerhalb eines Tomatensamens wird oft durch Samenhüllenschleim, mehrzellige Schichtintegument und ein dickwandiges Endosperm behindert, das durch mühsames Einbetten aufgelöst werden muss. Eine einfachere Alternative ist der Einsatz von Gewebereinigungstechniken, die das Saatgut mit chemischen Mitteln nahezu transparent machen. Obwohl herkömmliche Clearingverfahren einen tiefen Einblick in kleinere Samen mit dünnerer Samenhülle ermöglichen, ist die Klärung von Tomatensamen vor allem in den späten Entwicklungsstadien eine technische Herausforderung.

Hier wird ein schnelles und arbeitssparendes Clearing-Protokoll vorgestellt, um die Entwicklung von Tomatensamen 3 bis 23 Tage nach der Blüte zu beobachten, wenn die embryonale Morphologie fast abgeschlossen ist. Diese Methode kombiniert eine in Arabidopsis weit verbreitete Chloralhydrat-basierte Reinigungslösung mit anderen Modifikationen, einschließlich des Wegfalls der Formalin-Aceto-Alkohol (FAA) -Fixierung, der Zugabe von Natriumhypochlorit-Behandlung von Samen, der Entfernung der erweichten Samenschichtschleimhaut sowie des Waschens und der Vakuumbehandlung. Diese Methode kann zur effizienten Reinigung von Tomatensamen in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden und ist nützlich bei der vollständigen Überwachung des Entwicklungsprozesses von mutierten Samen mit guter räumlicher Auflösung. Dieses Clearing-Protokoll kann auch auf die Tiefenbildgebung anderer kommerziell wichtiger Arten in den Solanaceae angewendet werden.

Introduction

Tomate (S. lycopersicum L.) ist eine der wichtigsten Gemüsekulturen der Welt, mit einer Produktion von 186,8 Millionen Tonnen fleischigen Früchten von 5,1 Millionen Hektar im Jahr 2020¹. Es gehört zur großen Familie der Solanaceae mit etwa 2.716 Arten², darunter viele kommerziell wichtige Kulturen wie Auberginen, Paprika, Kartoffeln und Tabak. Die Kulturtomate ist eine diploide Art (2n = 2x = 24) mit einer Genomgröße von ca. 900^Mb3. Seit langem werden große Anstrengungen unternommen, um Tomatendomestizierung und -züchtung zu züchten, indem wünschenswerte Merkmale aus wilden Solanum

Protocol

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie das FAA-Fixiermittel durch Zugabe von 2,5 ml 37% Formaldehyd, 2,5 ml Eisessig und 45 ml 70% Ethanol in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Vortex und lagern Sie es bei 4 °C. FAA Fixiermittel kurz vor Gebrauch frisch zubereiten.
   ACHTUNG: 37% Formaldehyd ist ätzend und potenziell krebserregend, wenn es exponiert oder eingeatmet wird. Das Fixiermittel muss in einem Abzug unter Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
2. Bereiten Sie die Reinigungslösung vor, indem Sie 5 ml 100% Glycerin, 40 g Chloralhydrat und 10 ml destilliertes Wasser in einer 100-ml-Glasflasche....

Results

Wenn Tomatensamen mit einer herkömmlichen Methode wie bei Arabidopsis entfernt wurden, blockierten dichte Endospermzellen die Visualisierung früher Tomatenembryonen bei 3 DAF und 6 DAF (Abbildung 3A,B). Als das Gesamtvolumen des Embryos zunahm, war ein kugelförmiger Embryo bei 9 DAF kaum zu unterscheiden (Abbildung 3C). Als die Samengröße jedoch weiter zunahm, nahm ihre Permeabilität ab, was zu einem unscharfen Herzembryo bei 12 DAF füh.......

Discussion

Im Vergleich zum mechanischen Schneiden ist die Clearing-Technologie für die dreidimensionale Bildgebung vorteilhafter, da sie die Integrität von Pflanzengeweben oder Organen bewahrt¹⁶. Herkömmliche Clearing-Protokolle sind aufgrund des leichteren Eindringens chemischer Lösungen oft auf kleine Proben beschränkt. Tomatensamen sind eine problematische Probe für die Gewebereinigung, da sie etwa 70-mal größer sind als ein Arabidopsis-Samen und mehr Durchlässigkeitsbarrieren aufweisen. Die

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.000 & Mikro; L Pipette	GILSON	FA10006M
1.000 µ L Pipettenspitzen	Corning	T-1000-B
2 ml Zentrifugenröhrchen	Axygen	MCT-200-C
37% Formaldehyd	DAMAO	685-2013
5.000 & micro; L Pipette	Eppendorf	3120000275
5.000 µ L Pipettenspitzen	Biosharp	BS-5000-TL
50 ml Zentrifugenröhrchen	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Flasche Glas	Fisher	FB800-100
Chloralhydrat	Meryer	M13315-100G
Deckglas	Leica	384200
DIC Mikroskop	Zeiss	Axio Imager A1	10-fache, 20-fache und 40-fache Vergrößerung
Desinfektionsmittel	QIKELONGAN	17-9185
Präpariernadel	Bioroyee	17-9140
Blumennährstoff Erde	FANGJIE
Pinzette	HAIOU	4-94
Eisessig	BOYUAN	676-2007
Glycerin	Solarbio	G8190
Magnetrührer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbitalschüttler	QILINBEIER	QB-206
Aussaatsubstrat	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Siebung: 0-10 mm
Einfacher konkaves Objektträger	HUABODEYI
Objektträger	Leica	3800381
Stereomikroskop	Leica	S8 APO	1x bis 4x Vergrößerung
Weißblechfolie	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vakuumpumpe	SHIDING	SHB-III
Vortexmeter	Silogex	MX-S