Tollwut ist eine akute, fortschreitende, virale Enzephalitis. Der kugelförmige ätiologische Erreger gehört zur Gattung Lyssavirus, von denen weltweit mindestens 17 (außer in der Antarktis) Tollwut verursachen. Das Tollwutvirus ist das wichtigste Mitglied dieser vielfältigen RNA-Viren. Alle Säugetiere sind anfällig, wobei Fledermäuse und Mesokarnivoren wichtige Reservoirs sind. Die Übertragung erfolgt vor allem nach einem Biss. Als Inbegriff der Neurotropika gelangen die Virionen nach der Ablagerung über Axone zentripetal von der Peripherie zum Zentralnervensystem (ZNS) zur Replikation, danach zu den Speicheldrüsen und werden in den Speichel ausgeschieden. Weltweit sind Hunde für die meisten Todesfälle durch Tollwut verantwortlich und verursachen jährlich Zehntausende von Todesfällen. In Anbetracht der zoonotischen Dimensionen sind Labormethoden für die angewandte Forschung und die Meldung, Prävention und Bekämpfung von Krankheiten bei Menschen, Haustieren und Wildtieren unerlässlich. Das Ziel dieser Sammlung von neun miteinander verbundenen Artikeln ist es, Methoden vorzustellen, die eine Introspektion des Auftretens, der Erkennung, der Pathobiologie, der Epidemiologie, des Managements und der Verbesserung von Biologika ermöglichen.
Wie wird Tollwut beurteilt? Tollwut sollte eine meldepflichtige Krankheit sein, mit angemessener Erhebung, Analyse und epidemiologischer Interpretation der Daten. Heute werden die meisten Fälle durch passive Überwachung gemeldet, die auf Tieren basiert, die Menschen exponieren. Während es relativ einfach erscheinen mag, sich das sichere Einfangen, Fixieren, Sedieren und Einschläfern eines klinischen Verdachts (d. h. eines beißenden Hundes zur Tollwutdiagnose) vorzustellen, ist dies für einige Wildtiere nicht so einfach. Taiwan zum Beispiel war ein Gebiet, das ursprünglich als "tollwutfrei" galt und ursprünglich auf einer umfassenden Überwachung von Haustieren beruhte. Die Forscher auf der Insel erkannten jedoch die Bedeutung anderer Tierreservoire und wandten ihre Aufmerksamkeit der Tierwelt zu. Wie Hsu et al. beschreiben, bietet die gezielte Sammlung von sterbenden und toten Fledermäusen eine Möglichkeit zum Nachweis einzigartiger Lyssavirus-Spezies in Taiwan1. Diese Bemühungen erweiterten die taxonomische Breite dieser Virusgattung und lieferten ein vernünftiges Schema für andere Bewertungen in Asien.
Welche Gewebe werden für die Diagnose von Lyssaviren benötigt? Neben der Ableitung relevanter Überwachungsmethoden und der korrekten Speziesbestimmung ist eine sichere und sachgerechte Gewebeauswahl für eine sensitive und spezifische Diagnose der Tollwut von größter Bedeutung. Seit dem 19. Jahrhundert wurde das Zentralnervensystem (ZNS) als primäres Gewebe geschätzt. Die Tiere wurden eingeschläfert, ihre Kadaver ins Labor geschickt, Schädel wurden geöffnet, Gehirne entnommen und Teile mikroskopisch auf Viruseinschlüsse untersucht. Der Transport ganzer Tiere ist jedoch nicht praktikabel, insbesondere bei großvolumigen Säugetieren wie Nutztieren. Darüber hinaus sind nicht alle Bereiche des Gehirns gleichermaßen für die Diagnose geeignet. Jarvis et al. beschreiben sichere und praktische Nekropsiemethoden sowohl für kleine als auch für große Säugetiere, die das Expositionsrisiko minimieren und die Verarbeitungszeiten verkürzen2. Die Anwendung solcher Biosicherheitsempfehlungen und die Konzentration auf den Hirnstamm und das Kleinhirn werden die Praktiken für die moderne laborgestützte Überwachung von Tollwut bei Tieren verbessern.
Welche Möglichkeiten gibt es für den Nachweis von viralen Antigenen? Für die routinemäßige Lyssavirus-Diagnose wird seit Mittedes 20 . Jahrhunderts ein direkter Fluoreszenz-Antikörper-Test (DFA) zur Beobachtung von Viruseinschlüssen im ZNS-Gewebe eingesetzt. Der DFA-Test ist zwar hochempfindlich und spezifisch, erfordert aber ein Fluoreszenzmikroskop und verwendet Aceton als Gewebefixiermittel. Patrick et al. berichten über die Verwendung eines direkten, immunhistochemischen Schnelltests (DRIT), der auf der Entnahme von Hirnstammen, der Formalinfixierung von Gewebeabdrücken, der Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die an Biotin konjugiert sind, und dem Nachweis von Viruseinschlüssen durch Lichtmikroskopie in weniger als 1 Stunde3 beruht. Der drit hat eine ähnliche Sensitivität und Spezifität wie der DFA-Test und eignet sich für die dezentrale, verbesserte laborbasierte Überwachung unter Feldbedingungen. Für Umgebungen mit begrenzten Ressourcen ist ein linearer Durchfluss-Assay (LFA) eine weitere Methode zur schnellen Diagnose, die nur minimales technisches Fachwissen erfordert, wie Mauti et al. berichten. Positive Teststreifen aus dem Feld können zur Bestätigung an ein Zentrallabor geschickt werden4.
Eignen sich neben dem Antigennachweis auch andere Methoden für die Lyssavirus-Diagnose? Die DFA-, drit- und LFA-Tests sind nützlich für den Nachweis von viralen Antigenen in postmortalem ZNS-Gewebe. Hirngewebe kann jedoch zersetzt werden. Darüber hinaus sind bei Verdachtsfällen beim Menschen ante-mortem-Tests wünschenswerter und können alternative klinische Proben wie Liquor umfassen. Daher sind molekulare Assays sehr nützlich, um kleine Mengen viraler Nukleinsäuren nachzuweisen. Marston et al. und Wang et al. beschreiben eine Echtzeit- bzw. verschachtelte Polymerase-Kettenreaktionstechnik, die schnell, sensitiv und spezifisch ist 5,6. Diese sorgfältige Liebe zum Detail zur Minimierung der Probenkontamination und das richtige Primer-Design ermöglichen die Primärdiagnose über das gesamte Spektrum divergierender Lyssaviren.
Ist die konventionelle Mikroskopie nach der Diagnose ausreichend für moderne Erkenntnisse über die Lyssavirus-Pathobiologie? Die alleinige Verwendung zweidimensionaler mikroskopischer Methoden kann dazu führen, dass kritische in vivo-Elemente in Bezug auf Kontext und Komplexität übersehen werden. Unter Verwendung von Objektiven mit langem Freiarbeitsabstand können virusinfizierte Gewebe jedoch mit konventioneller konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie mit hoher Auflösung abgebildet werden, wie von Zaeck et al. beschrieben, um die Erregerverteilung zu visualisieren und feine Details zur viralen Pathogenese, Ausbreitung, Tropismus und Neuroinvasion besser zu verstehen7.
Gibt es Alternativen zur Messung der Wirksamkeit von Tollwutimpfstoffen? Die derzeitigen Methoden zur Messung der Wirksamkeit von Tollwutimpfstoffen erfordern eine große Anzahl von Labornagetieren. Kosten, Konfidenzintervalle und Wohlfahrtsprobleme erfordern jedoch eine Alternative. Das Glykoprotein des Tollwutvirus löst nach der Impfung virusneutralisierende Antikörper aus. Wie von Jallet und Tordo mitgeteilt, kann ein In-vitro-ELISA-Test anstelle von Tieren verwendet werden, um den relativen Gehalt von Tollwutvirus-Impfstoffen unter Verwendung hochspezifischer monoklonaler Antikörperzu messen 8.
Kann mit Hilfe von Biomarkern Rückschlüsse auf den Verzehr von oralen Impfstoffködern durch Wildtiere gezogen werden? Neben der parenteralen Impfung von Menschen und Haustieren gibt es seit den 1970er Jahren auch die Schluckimpfung von wilden Mesokarnivoren. Neben der Messung der Immunogenität von Impfstoffen oder der daraus resultierenden Wirksamkeit bei Populationen von Füchsen, Waschbären, Stinktieren usw. durch Fallerkennung können Biomarker verwendet werden, um auf den Kontakt und den Verzehr von impfstoffbeladenen Ködern zu schließen. In der Vergangenheit wurde der Nachweis von eingebautem Tetracyclin aus Ködern in den Knochen oder Zähnen von Tieren durchgeführt. Eine Alternative zur Entnahme solcher Hartgewebe ist die serologische Messung eines anderen Biomarkers, wie z.B. Iophenoxsäure. Berentsen et al. berichten über die Analyse solcher Derivate in den Seren von Mangusten, einem wichtigen natürlichen Reservoir in Asien, das in die Karibik eingeführt wurde9. Nach dem Verzehr von Ködern, die diesen Biomarker enthielten, durch in Gefangenschaft gehaltene Mangusten extrahierten sie iophenoxische Säuren in Acetonitril und analysierten Tierseren mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie. Es wurde eine ausreichende Markierung für mehrere Wochen nach dem Verzehr von Ködern festgestellt, und solche Derivate könnten für die Feldbewertung der Aufnahme von impfstoffbeladenen Ködern bei freilebenden Tieren geeignet sein.
Unter anderem aufgrund der anhaltenden COVID-19-Pandemie werden verbesserte virologische Methoden zur verstärkten Überwachung des Lyssavirus, zur Entdeckung von Krankheitserregern, zur Bestätigungsdiagnose und zur Variantencharakterisierung erwartet. Das Lesen über verschiedene Techniken in der von Experten begutachteten Literatur ist in der Regel der erste Schritt für eine interessierte Person. Wenn Sie jedoch eine Abfolge von Schritten direkt beobachten und den Kontext von einem erfahrenen Bediener hören, werden Nuancen und Fehlinterpretationen beseitigt. Derzeitige und künftige Labor- und Feldprotokolle im Zusammenhang mit Tollwut, wie sie von der OIE und der WHO empfohlen werden, könnten von zusätzlichen Sammlungen visueller Methoden profitieren, um neuen Forschern, insbesondere in Entwicklungsländern, zu helfen.