Eine skalierbare, zellbasierte Methode zur funktionellen Bewertung von Ube3a-Varianten

Summary

Eine einfache und skalierbare Methode wurde entwickelt, um die funktionelle Bedeutung von Missense-Varianten in Ube3a zu bewerten, einem Gen, dessen Verlust und Funktionsgewinn sowohl mit dem Angelman-Syndrom als auch mit der Autismus-Spektrum-Störung verbunden sind.

Abstract

Der verstärkte Einsatz von Sequenzierung in der Medizin hat Millionen von kodierenden Varianten im menschlichen Genom identifiziert. Viele dieser Varianten kommen in Genen vor, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, aber die funktionelle Bedeutung der überwiegenden Mehrheit der Varianten bleibt unbekannt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Varianten für Ube3a, ein Gen, das eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die sowohl mit Autismus als auch mit Angelman-Syndrom verbunden ist. Die Duplikation oder Verdreifachung von Ube3a ist stark mit Autismus verbunden, während seine Deletion das Angelman-Syndrom verursacht. Daher ist das Verständnis der Valenz von Veränderungen der UBE3A-Proteinaktivität wichtig für klinische Ergebnisse. Hier wird eine schnelle, zellbasierte Methode beschrieben, die Ube3a-Varianten mit einem Wnt-Signalweg-Reporter paart. Dieser einfache Assay ist skalierbar und kann verwendet werden, um die Wertigkeit und das Ausmaß von Aktivitätsänderungen in jeder Ube3a-Variante zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Einrichtung dieser Methode die Generierung einer Fülle von Struktur-Funktions-Informationen, die verwendet werden können, um tiefe Einblicke in die enzymatischen Mechanismen von UBE3A zu gewinnen.

Introduction

Jüngste technologische Fortschritte haben die Sequenzierung von Exomen und Genomen in klinischen Umgebungen zur Routine gemacht ^1,2. Dies hat zur Entdeckung einer großen Anzahl genetischer Varianten geführt, darunter Millionen von Missense-Varianten, die typischerweise eine Aminosäure in einem Protein verändern. Das Verständnis der funktionellen Bedeutung dieser Varianten bleibt eine Herausforderung, und nur ein kleiner Bruchteil (~2%) der bekannten Missense-Varianten hat eine klinische Interpretation ^1,3.

Ein prominentes Beispiel für dieses Problem ist Ube3a, ein Gen, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die auf Substratproteine für den Abbau^{abzielt 4}. Ube3a befindet sich auf Chromosom 15q11-13 und wird ausschließlich aus dem mütterlich vererbten Allel ^5,6,7 exprimiert. Beobachtungen aus der Krankheitsgenetik deuten stark darauf hin, dass eine unzureichende oder übermäßige Aktivität des UBE3A-Enzyms unterschiedliche neurologische Entwicklungsstörungen verursacht. Die Deletion des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 verursacht das Angelman-Syndrom (AS)8, eine Störung, die durch schwere geistige Behinderung, motorische Beeinträchtigungen, Krampfanfälle, ein fröhliches Auftreten mit häufigem Lächeln und dysmorphe Gesichtszüge gekennzeichnet^ist 8,9,10. Im Gegensatz dazu verursacht die Duplikation oder Verdreifachung des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 das Dup15q-Syndrom, eine heterogene Erkrankung, die als eine der häufigsten syndromalen Formen von Autismus anerkannt^{wird 11,12,13}. Darüber hinaus gibt es Hunderte von Missense-Varianten, die in Ube3a identifiziert wurden, von denen die meisten als Varianten von ungewisser Signifikanz (VUS) gelten, da ihre funktionelle und klinische Bedeutung unbekannt ist. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Methoden, die Ube3a-Varianten empirisch bewerten können, um festzustellen, ob sie zu neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen.

Das UBE3A-Enzym gehört zur HECT-Domänenfamilie (homolog to E6-AP C-terminus) von E3-Ubiquitin-Ligasen, die alle die gleichnamige HECT-Domäne besitzen, die die biochemische Maschinerie enthält, die notwendig ist, um aktiviertes Ubiquitin von E2-Enzymen aufzunehmen und auf Substratproteine zu übertragen¹⁴. In der Vergangenheit stützte sich die Charakterisierung von E3-Enzymen auf rekonstituierte In-vitro-Systeme, die ein Ensemble gereinigter Proteine^erfordern 4,15,16. Solche Methoden sind langsam und arbeitsintensiv und können die Aktivität einer großen Anzahl von Varianten nicht beurteilen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass UBE3A den Wnt-Signalweg in HEK293T-Zellen aktiviert, indem es die Funktion des Proteasoms moduliert, um den Abbau von β-Catenin¹⁷ zu verlangsamen. Diese Erkenntnis ermöglicht den Einsatz von Wnt-Signalwegreportern als effiziente und schnelle Methode, um sowohl Loss- als auch Gain-of-Function-Varianten von Ube3a¹⁸ zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt detailliert eine Methode zur Erzeugung von Ube3a-Varianten sowie einen Luciferase-basierten Reporter zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivität von Ube3a-Varianten.

Protocol

1. Mutagenese-Klonierung zur Erzeugung von Ube3a-Varianten

1. Klonen Sie alle Ube3a-Varianten in das pCIG2-Plasmid (Abbildung 1A), einen bicistronischen Vektor, der einen Hühner-β-Aktin-Promotor und eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) für die EGFP-Expression¹⁹ enthält. Ube3a-Konstrukte in voller Länge enthalten eine N-terminale Myc-Tag-Sequenz und werden unter Verwendung einer 5'-SacI-Site und einer 3'-XmaI-Site in pCIG2 geklont. Darüber hinaus werden natürlich vorkommende EcoRI-, EcoRV- und PstI-Stellen innerhalb der Ube3a-Kodierungssequenz auch zum Subklonen von Fragmenten verwendet.
   HINWEIS: De-identifizierte Varianten für Ube3a können über die Literatur und in öffentlich zugänglichen Repositorien wie der ClinVar-Datenbank¹ bezogen werden. Zusätzliche nicht gemeldete Varianten können durch persönliche Kommunikation mit medizinischen Zentren erhalten werden.
2. Verwenden Sie eine angepasste zweistufige Megaprimer-Mutagenesemethode²⁰ , um Mutationen in den Ube3a-Leserahmen einzuführen. Im ersten Schritt entwerfen Sie das mutagene Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation enthält (das in diesem Protokoll gezeigte Beispiel ist die Erzeugung einer UBE3A Q588E-Variante), flankiert von mindestens 30 Basenpaaren (bp) der Homologie 5' und 3' zur Mutation (Abbildung 1B und Tabelle 1).
3. Verwenden Sie das mutagene Oligonukleotid zusammen mit einem komplementären Oligonukleotid für die erste Runde der PCR, um einen 200-400 bp Megaprimer zu erzeugen, der die Mutation enthält (Abbildung 1C; Tabelle 2 und Tabelle 3). Verwenden Sie die gesamten 50 μL des PCR-Reaktionsvolumens für die Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen Gels und anschließender Gelreinigung (Table of Materials). Eluieren Sie das PCR-Produkt in 30 μL deionisiertem_H2O(_diH2O) zur Verwendung in der zweiten PCR-Runde unten.
4. Richten Sie die PCR der zweiten Runde wie angegeben ein (Abbildung 1C; Tabelle 2 und Tabelle 3). Dieser Schritt erzeugt größere DNA-Fragmente (typischerweise ~1-1,5 kb Länge), die die Mutations- und terminalen Restriktionsstellen enthalten, die für die Subklonierung geeignet sind (Abbildung 1C).
5. Nach Abschluss der PCR-Reaktion wird das resultierende Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskits (Table of Materials) gereinigt. Eluieren Sie in 30 μL und verdauen Sie das gesamte gereinigte Produkt und das pCIG2 Ube3a WT-Konstrukt mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (das Beispiel zeigt die Verdauung mit EcoRI und XmaI).
6. Nach 2 h Aufschluss bei 37 °C die Aufschlussprodukte durch Agarosegelelektrophorese (1% Gel) auflösen und die entsprechenden Produkte gelreinigen. Richten Sie Ligaturen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials) ein, wandeln Sie die Ligationsprodukte in einen DH10B-Bakterienstamm (Table of Materials) um und legen Sie dann eine Platte mit Ampicillin (100 μg / ml) Auswahl.
7. Wählen Sie am nächsten Tag zwei bis vier Kolonien aus, um 3-ml-Kulturen mit Luria-Brühe (LB) und 100 μg / ml Ampicillin zu impfen. Lassen Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C in einem Orbitalbrutschrank mit Schütteln (225 U/min) wachsen.
8. Verwenden Sie am nächsten Tag 1-1,5 ml der Bakterienkultur, um die Plasmid-DNA (Table of Materials) zu minimieren. Speichern Sie die restliche Kultur, indem Sie sie bei 4 °C platzieren. Screenen Sie die miniprepped Plasmide durch Sanger-Sequenzierung mit einem Oligonukleotid, das ~ 200 bp von der gewünschten Mutation bindet.
9. Verwenden Sie die bei 4 °C gespeicherten Bakterienkulturen, um 50-ml-Kulturen auf das richtige Plasmid (Table of Materials) umzuimpfen. Sequenzieren Sie die Ube3a-Kodierungssequenz vollständig, um die korrekte Sequenz der DNA zu validieren.
10. Erstellen Sie Arbeitsbestände von Ube3a-Variantenplasmiden sowie dem β-Catenin-aktivierten Reporter (BAR)²¹, TK-Renilla-Luciferase, ligasetotem Ube3a (UBE3A C820A-Mutation) und pCIG2-leerem Vektor in einer Konzentration von 100 ng/μL unter Verwendung von sterilem_H2Ofür die nachfolgenden Transfektionsschritte.

2. Vorbereitung und Transfektion menschlicher embryonaler Nierenzellen 293T (HEK293T)

1. Durchführung der Assays an HEK293T-Zellen, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet wurden, das mit Glutamin, 10% fetalem Rinderserum (FBS) und antibiotisch-antimykotischem Wirkstoff wie zuvor beschrieben vorergänzt wurde¹⁷. Die Zellen werden in einem sterilen, befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%_CO2 gezüchtet.
2. Mit einer Biosicherheitswerkbank werden die suspendierten HEK293T-Zellen zunächst auf gewebekulturbehandelte 96-Well-Platten mit flachem Boden mit einer Dichte von 2,2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 100 μL Kulturmedien geschichtet und über Nacht wachsen lassen.
3. Am zweiten Tag transfizieren Sie die Zellen in einer Biosicherheitswerkbank mit Firefly- und Renilla-Luciferase-Reporterplasmiden (Tabelle 4) und Ube3a-Plasmiden in dreifacher Ausfertigung. Die Transfektionen werden in 10 μL Gesamtvolumen pro Vertiefung unter Verwendung eines 10:1:8-Verhältnisses von Plasmiden (50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla bzw. 40 ng Ube3a-Plasmid pro Well) durchgeführt, wie zuvor beschrieben¹⁸, und 0,4 μL Transfektionsreagenz (Tabelle 4).
   HINWEIS: Für jedes Experiment werden auch ein leerer Vektor (nur GFP) und ein Plasmid, das für Ligase-totes Ube3a kodiert, transfiziert, um als Negativkontrollen zu dienen.
4. Erstellen Sie eine Mastermischung für die Transfektionen für jede Variante in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Tabelle 4) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur (RT) für 15 min. Nach der Inkubation rühren Sie die Transfektionsmischung vorsichtig durch Klopfen des Röhrchens und fügen Sie dann 10 μL der Transfektionsmischung direkt zu den vorhandenen Wachstumsmedien in den Vertiefungen hinzu.
5. Danach bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie die Plasmide 48 h lang exprimieren. Ein Austausch der Wachstumsmedien ist nicht erforderlich.
6. Überwachen Sie die Transfektionseffizienz durch GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop. HEK293T-Zellen werden mit dieser Methode effizient transfiziert, und >80% der Zellen sollten nach 48 h GFP exprimieren.

3. Messung der Luciferase-Aktivität

HINWEIS: Die Luciferase-Aktivität wird mit einem kommerziell erhältlichen System bewertet, das sowohl Firefly als auch Renilla luciferase (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers untersucht.

1. Saugen Sie die Kulturmedien vorsichtig aus transfizierten HEK293T-Zellen ab und waschen Sie die Zellen dann mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Das PBS absaugen und die Zellen durch Zugabe von 25 μL nicht denaturierendem Lysepuffer lysieren und 15 min unter leichtem Schaukeln auf Eis inkubieren.
2. Anschließend werden 20 μL des resultierenden Lysats (keine Zentrifugation erforderlich) in eine neue 96-Well-Assay-Platte gegeben, die 100 μL eines Firefly-Luciferase-Substratreagenz enthält. Mischen Sie den Teller vorsichtig durch Tippen.
3. Laden Sie die Platte auf einen Plattenleser und messen Sie die Lumineszenz mit einem Top-Detektor mit einer Lesehöhe von 1 mm und einer Integrationszeit von 1 s.
   HINWEIS: Die Verstärkung des Detektors muss möglicherweise basierend auf der Stärke des Signals angepasst werden.
4. Unmittelbar nach dem Lesen der Firefly-Luciferase-Lumineszenz 100 μL Renilla-Luciferase-Substrat in die Vertiefungen geben. Dieser Schritt löscht gleichzeitig die Firefly-Luciferase-Aktivität und bewertet gleichzeitig die Renilla-Luciferase-Aktivität. Mischen Sie die Proben durch sanftes Rühren der Platte und messen Sie erneut die Lumineszenz, um die Renilla-Luciferase-Aktivität zu beurteilen.
   HINWEIS: Während andere Platten für diesen Assay verwendet werden können, liefert die Verwendung von Platten mit schwarzen Rahmen und weißen Vertiefungen die empfindlichsten Ergebnisse, da dies das Luciferase-Signal verstärkt und gleichzeitig das Rauschen minimiert.
5. Quantifizieren Sie die Antworten des Reporters als Firefly-Luciferase zu Renilla-Luciferase-Verhältnis (Firefly / Renilla) und mitteln Sie die Werte der dreifachen Messungen. Normalisieren Sie anschließend den Firefly/Renilla-Wert für jede Variante mit den Werten für Wildtyp-(WT) Ube3a-exprimierende Zellen, um die relative Aktivität varianter Proteine zu vergleichen.

Results

Großflächiges funktionelles Screening von Ube3a-Missense-Varianten identifiziert eine breite Landschaft von Loss- und Gain-of-Function-Mutationen
Frühere Arbeiten mit Ube3a-Mutanten deuteten darauf hin, dass die Wnt-Antwort als Reporter der zellulären UBE3A-Proteinaktivität dienen kann. Diese Beobachtungen wurden erweitert und zusätzliche Validierungsexperimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob der BAR-Assay geeignet ist, eine Reihe von UBE3A-Aktivitäten in der Zelle zu melden. Zu...

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine effiziente und skalierbare Methode zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität von Ube3a-Varianten. Es gibt mehrere technische Details, die bei der Verwendung dieses Assays sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Eine Überlegung ist die Wahl der Wnt-Reporterplasmide, die in diesem Assay verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet speziell den β-Catenin-aktivierten Reporter (BAR)²¹, einen Reporter, der ein Konkatemer aus 12 T-Ze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Trypsin-EDTA (1x), phenolrot	Gibco	25300-054
1 Kb DNA-Leiter	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA-Leiter	Lambda Biotech	M107
10x Puffer für T4 DNA-Ligase mit 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaktionspuffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotikum-Antimykotische Lösung	Corning	30004CI
Schwarz/Weiß Isoplatte-96 Schwarzer Rahmen White Well Platte	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Dinatriumsalz	Midwest Scientific	KCC46000-5
Gräfin Zellzählkammer   Objektträger	Invitrogen von Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automatisierter Zellzähler	life technologies		Zellzählmaschine
Custom DNA-Oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Desoxynukleotid (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat	Gibco	10569044	Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums HEK293T Zelllinie
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriktionsenzym
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviertes	Gibco	16140071	Fötales Rinderserum
Fisherbrand Oberflächenbehandelte Gewebekulturschalen	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfektionsreagenz	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T Zellen	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemisch kompetente Zellen	Intakte Genomik	1011-12	E. coli DH10B Zellen
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi Prep
pCIG2 Plasmid
pGL3 BAR Plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA-Polymerase
ProFlex 3 x 32 Well PCR-System	Angewandte Biosysteme von life technologies		Thermocycler
pTK Renilla Plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini-Vorbereitung
QIAquick Gel-Extraktionskit (250)	Qiagen	28706	Gel-Aufreinigung
QIAquick PCR-Aufreinigungskit (250)	Qiagen	28106	PCR-Aufreinigung
rCutSmart Puffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriktionsenzym
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Platten-Reader läuft mit Gen5-Software v3.08 (BioTek)
T4 DNA-Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE-Puffer, Tris-Acetat-EDTA, 50x Lösung, Elektrophorese	Fisher Scientific	BP13324
Gewebekulturplatte 96 Wells,	Fisherbrand	mit
ultrareine Ethidiumbromid-Lösung	Invitrogen von Thermo Fisher Scientific
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriktionsenzym