Methodenartikel

Lumican-Extraktion aus Amnionmembran und Bestimmung ihrer Lagertemperatur

DOI:

10.3791/64460

⸱

14. Oktober 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Oftalmologia Fundacion Conde de Valenciana IAP, 2Biochemistry Department, Medicine Faculty, Universidad Nacional Autónoma de Mexico

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Lumican aus der Amnionmembran (AM) und deren Lagerbedingungen als AM-Extrakt (AME) bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage, um seine Proteine und Lumican-Konzentration zu quantifizieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lumican ist ein kleines leucinreiches Proteoglykan in der menschlichen Amnionmembran (AM), das die Hornhautepithelisierung und die Organisation von Kollagenfasern fördert und die Transparenz der Hornhaut aufrechterhält. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Proteinextraktion aus AM vorgeschlagen, um Lumican zu erhalten. Zusätzlich wird die Stabilität von Lumican im AM-Extrakt (AME) bewertet, der bei verschiedenen Temperaturen und Zeiträumen gelagert wird. 100 mg AM wurden aufgetaut und mechanisch deepithelialisiert. Das deepithelialisierte AM wurde eingefroren und zerkleinert, bis ein feines Pulver erhalten wurde, das mit 2,5 ml Kochsalzpuffer mit Proteaseinhibitoren gelöst und zur Proteinextraktion zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage gelagert. Danach wurde Lumican in jedem AME quantifiziert. Diese Technik ermöglicht ein zugängliches und erwerbbares Protokoll für die Lumican-Extraktion aus AM. Die Lumican-Konzentration wurde durch die Lagerzeit und die Temperaturbedingungen beeinflusst. Lumican in der AME von 12 Tagen Lagerung bei -20 °C und 4 °C war signifikant höher als andere AME. Diese Lumican-Extraktion könnte für die Entwicklung von Behandlungen und pharmazeutischen Lösungen nützlich sein. Weitere Studien sind erforderlich, um die Verwendung von AME Lumican bei der Reepithelialisierung und Wundheilung zu bestimmen.

Einleitung

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Eine der am häufigsten verwendeten Behandlungen für Hornhauterkrankungen ist die Amnionmembrantransplantation; In den letzten Jahren sind jedoch neue Vorschläge für die Verwendung verschiedener Bestandteile des Fruchtwassergewebes als alternative und adjuvante Behandlungen aufgetaucht. Zu den am meisten untersuchten Komponenten von AM gehören diejenigen, die aus dem AM-Extrakt (AME) 1,2,3,4,5,6,7 gewonnen werden. AM enthält mehrere lösliche Faktoren wie antiangiogene Proteine, Interleukine (IL), Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs), entzündungshemmende Proteine, die durch TSG-6 vermittelt werden und neutrophile extrazelluläre Fallen hemmen, Wachstumsfaktoren: epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF) (alpha und beta), Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Lumican, das die Transparenz der Hornhaut durch Regulierung der Kollagenfibrillogenese aufrechterhält1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

Lumican ist ein kleines leucinreiches Proteoglykan (SLRP), eine der wichtigsten extrazellulären Komponenten der interstitiellen Kollagenase in der Hornhautstromamatrix, verantwortlich für die Organisation von Kollagenfasern und die Aufrechterhaltung der Hornhauttransparenz 4,10,11. Proteoglykane sind Moleküle in der extrazellulären Matrix (ECM), die die wichtigsten bei der Durchführung von Zellsignalen und der Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostasesind 12. Es wurde berichtet, dass ECM-Proteine die zellulären Prozesse der Proliferation, Differenzierung und Migration während der Wundheilung antreiben11.

Hinweise auf die mögliche Beteiligung von Lumican am Prozess der Hornhautreepithelisierung. Saika et al. zeigten in einer Studie, dass nach einer Hornhautverletzung Lumican in Hornhautkeratozyten zwischen den ersten 8 h und bis zu 3 Tagen nach der Verletzung nachgewiesen werden konnte. Dieses Proteoglykan weist am zweiten und dritten Tag die höchste Konzentration von Lumican auf und ist anschließend am siebten Tag13 nicht nachweisbar. Diese Daten deuten auf die Beteiligung von Lumican an der Aktivierung des Hornhaut-Reepithelisierungsprozesses hin. Auf der anderen Seite wurde in einer anderen Studie berichtet, dass das Fehlen von Lumican die Reepithelialisierung verzögert; Interessanterweise könnte die Zugabe von Lumican den Reepithelisierungsprozessbeschleunigen 4,11,13. Ebenso hat eine kürzlich durchgeführte Studie berichtet, dass Lumican die entzündlichen Funktionen von Hornhautlimbus-Fibroblastenmodulieren kann 14, was auf eine Rolle von Lumican als Modulator der entzündlichen, antifibrotischen und reepithelialisierenden Reaktion hindeutet. In ähnlicher Weise kann Lumican die Hornhautreaktion modulieren, indem es mit Signalmolekülen wie Fas-FasL interagiert. Auch das Fehlen von Lumican in einem Knockout-Lum-/- Mausmodell zeigte, dass das Fehlen von Lumican-Signalen eine adäquate Hornhautreparatur verhindert15.

In erster Linie zielt diese Methode darauf ab, einen praktikablen und zugänglichen Weg zur Extraktion von Lumican aus AM zu demonstrieren. Mit dieser vorteilhaften Methode der Lumican-Extraktion ist es möglich, ähnliche Konzentrationen von Proteinen zu erhalten, wodurch die Verarbeitungszeit verkürzt und für die Forscher im Vergleich zu den vorherigen Studien bequemer wird16. Darüber hinaus könnte dieses AME-Lumican als Adjuvans für Hornhautreparatur- und Reepithelisierungsprozesse verwendet werden.

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Protokoll

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Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Review Board genehmigt (Projekt Nr. CEI-2020/06/04). Die AM wurde von der Amnionbank Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (von identifizierten menschlichen Probanden) erhalten, die wie von Chávez-García et al.17 beschrieben hergestellt wird.

1. Herstellung des Amnionmembranextrakts

  1. Erhalten Sie 100 mg AM von der Amnionbank.
    HINWEIS: Laut einem früheren Bericht sezernieren 50 mg AM insgesamt 10 ng / ml Lumican14. Um eine höhere Konzentration von Lumic zu erhalten, verwenden Sie 100 mg AM, was einer Gesamtfläche von 32 cmentspricht 2.
  2. Wenn der AM gefroren ist, tauen Sie ihn bei Raumtemperatur auf.
    HINWEIS: Führen Sie die folgenden Verfahren unter einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II B durch.
  3. Waschen Sie den AM in einer Petrischale mit 10 ml steriler ausgewogener Salzlösung (BSS, siehe Materialtabelle) für 2 min.
    1. Gießen Sie das BSS in ein Becherglas.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3 und bestätigen Sie visuell, dass kein Glycerinmedium in der Petrischale BSS vorhanden ist.
      HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 3. nach Bedarf, bis Glycerinmedium in Petrischale BSS nicht vorhanden ist.
  4. Inkubieren Sie den AM mit 10 mL Dispase II (1,7 IE/ml, siehe Materialtabelle) bei 37 °C, 5%CO2 für 30 min.
    HINWEIS: Dispase II ist eine neutrale Protease mit sanfter Aktivität über Epithelzellen. Dieses Enzym trennt effektiv die intakte Epidermis von der Dermis und isoliert intakte Epithelblätter18.
  5. Nach der Dispase-Inkubation wird eine mechanische Deepithelialisierung14 mit einem Gummipolizisten durchgeführt (siehe Materialtabelle). Bestätigen Sie die Deepithelialisierung durch Mikroskopie-Visualisierung.
    HINWEIS: Der Prozess der Deepithelisierung wird in einem inversen Mikroskop mit 4x- und 20x-Objektiven bestätigt. Visualisieren Sie das Gewebe, um das Vorhandensein einer Zellschicht auszuschließen.
  6. Waschen Sie den AM in einer Petrischale mit 10 ml BSS für 2 min. Gießen Sie das BSS in ein Becherglas.
  7. Legen Sie den deepithelialisierten AM (dAM) in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Tauchen Sie den dAM für 40 min in flüssigen Stickstoff.
  8. Den gefrorenen dAM für 2-3 min in einem vorgekühlten Mörser bei -85 °C manuell mahlen, bis ein feines Pulver entsteht.
  9. Im Mörtel das dAM-Pulver mit 2,5 ml Proteaseinhibitorlösung (BSS mit Proteaseinhibitoren) auflösen.
    HINWEIS: Jede Tablette Proteasehemmer besteht aus der folgenden Mischung von Enzymen: Pankreasextrakt (0,02 mg / ml), Thermolysin (Metalloprotease) (0,0005 mg / ml), Chymotrypsin (0,002 mg / ml), Trypsin (0,02 mg / ml) und Papain (0,33 mg / ml) (siehe Materialtabelle).
  10. Sammeln Sie die Mischung mit einer Mikropipette und reinigen Sie die Mörtelwände mit Hilfe eines Skalpellmessers. Geben Sie die Mischung in ein 5-ml-Röhrchen.
  11. 30 s lang gut mit dem Wirbel mischen.
  12. Die Gewebemischung wird durch Zentrifugieren bei 34 x g für 20 min bei 4 °C homogenisiert und sofort bei 3360 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
  13. Der gesammelte Überstand ist der AME (Abbildung 1). Lagern Sie 0,7 ml jedes AME in verschiedenen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für 6, 12, 20 und 33 Tage bei den unterschiedlichen Temperaturbedingungen von -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT).

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Abbildung 1: Prozess der AME-Präparation und Lumican-Konzentrationsmessung . 100 mg AM wurden mit Dispase II bei 37 °C für 30 min inkubiert und mechanisch deepithelialisiert. Der deepithelialisierte AM wurde gewaschen und 40 min lang in flüssigen Stickstoff getaucht und dann zerkleinert, bis ein feines Pulver erhalten wurde, das mit 2,5 ml Kochsalzpuffer mit Proteaseinhibitoren gelöst und zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20 °C, 4 °C und RT für 6, 12, 20 und 32 Tage bis zur vollständigen Protein- und Lumican-Quantifizierung gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. AME-Protein-Quantifizierung

HINWEIS: Die Quantifizierung des Gesamtproteins in der AME muss unmittelbar nach der Einnahme durchgeführt werden. Quantifizieren Sie Proteine mit dem Lowry-Proteintest und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Es wird empfohlen, alle Standards und Proben in dreifacher Ausfertigung zu untersuchen.

  1. Pipettieren Sie 40 μL jeder AME-Probe in eine 96-Well-Mikroplatte.
    1. Präparation einer Standardkurve in dieselbe Mikroplatte unter Verwendung des BSA-Standards für Rinderserumalbumin (BSA) für eine endgültige BSA-Konzentration von 0-1.500 μg/ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000 und 1.500 μg/ml).
  2. Pipettieren Sie 200 μL des modifizierten Lowry-Reagenzes in jede Vertiefung. Mischen Sie es sofort auf einem Plattenmischer für 30 s.
  3. Decken Sie die Mikroplatte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie bei RT für 10 min.
  4. 20 μL 1x Folin-Ciocalteu-Reagenz in jede Vertiefung pipettieren. Mischen Sie es sofort auf einem Plattenmischer für 30 s.
    HINWEIS: Um 1x Folin-Ciocalteu-Reagenz herzustellen, verdünnen Sie 2x (2N) Reagenz 1:1 mit Reinstwasser. Bereiten Sie 1x Folin-Ciocalteu-Reagenz am selben Tag der Anwendung vor, da das verdünnte Reagenz instabil ist.
  5. Decken Sie die Mikroplatte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie bei RT für 30 min.
  6. Messung der Absorption von Proben bei 660 nm in einem ELISA-Plattenspektrometer (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Farbe kann bei Wellenlängen zwischen 650 nm und 750 nm gemessen werden.
  7. Mittelwert des Absorptionswerts von 660 nm der Standard-Blindproben und Subtraktion von anderen 660-nm-Werten von Standard- und unbekannten Proben.
    1. Messen Sie die Absorption mit einem ELISA-Plattenspektrometer in einem Endpunktmodus mit geringer Erschütterung für 10 s.
  8. Verwenden Sie die Standardkurve, um die Proteinkonzentration jeder unbekannten Probe zu bestimmen.
  9. Für die Berechnung des Proteins bestimmen Sie die Konzentration aus einem linearen Regressionsgraphen unter Verwendung der Absorptionswerte auf der Y-Achse gegen die Konzentrationen in mg/ml auf der X-Achse jeder Standard-BSA-Kurve.
    1. Erhalten Sie die Gleichung der linearen Regression und den r-Wert, um die Proteinkonzentration zu berechnen.
      HINWEIS: Die Ergebnisse werden als normalisierte relative Konzentrationswerte des Gesamtproteins relativ zu mg AM (μg / ml Protein / mg AM-Gewebe) ausgedrückt.

3. Quantifizierung von Lumican bei AME

HINWEIS: Die Konzentration von Lumican muss in der AME gemessen werden, die unter verschiedenen Lagerbedingungen und Zeiträumen gelagert wird. Quantifizieren Sie Lumican mit Sandwich-ELISA und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Es wird empfohlen, alle Standards und Proben in zweifacher Ausfertigung zu untersuchen.

  1. Verdünnen Sie den humanen Lumican-Antikörper (siehe Materialtabelle) auf die verwendete Konzentration in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    HINWEIS: Die Durchstechflasche mit Capture-Antikörpern enthält 120 μg Antikörper. Nach Rekonstitution mit 0,5 ml PBS wird der Einfangantikörper in einer Arbeitslösung von 2 μg/ml verdünnt.
    1. Pipettieren Sie sofort 100 μl pro Welle des verdünnten Capture-Antikörpers auf eine 96-Well-Mikroplatte. Schließen Sie die Platte ein und inkubieren Sie sie über Nacht bei RT.
  2. Jede Vertiefung absaugen und durch Pipettieren mit 300 μL Waschpuffer: 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat 20 in PBS, pH 7,2-7,4 (siehe Materialtabelle) mit einem Mehrkanalpipettor absaugen. Wiederholen Sie dies dreimal.
    HINWEIS: Entfernen Sie nach dem letzten Waschen den verbleibenden Waschpuffer, indem Sie die Platte abschneiden und vorsichtig gegen Papiertücher klopfen.
  3. Blockplatten durch Zugabe von 300 μL Reagenzverdünnungsmittel: 1% BSA in PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm gefiltert (siehe Materialtabelle) zu jeder Vertiefung. Inkubieren bei RT für 1 h.
  4. Wiederholen Sie Schritt 2.
  5. Präparation einer Standardkurve in eine 96-Well-Mikroplatte unter Verwendung von zweifachen seriellen Verdünnungen von 0-8.000 pg/ml für Endkonzentrationen von 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 und 8.000 pg/ml. Das ELISA-Lumican-Kit enthält einen rekombinanten Lumican-Standard von 75 ng (siehe Materialtabelle).
  6. Fügen Sie 100 μL Proben und die Standardkurve in die mit Capture-Antikörpern beschichtete 96-Well-Mikroplatte hinzu.
  7. Die Mikroplatte abdecken und 2 h bei RT mit geringer Bewegung in einer kompakten Wippe inkubieren, wobei die Geschwindigkeit zwischen 2-3 U/min beibehalten wird.
  8. Wiederholen Sie Schritt 2.
  9. Geben Sie 100 μL des biotinylierten Antikörpers (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung. Vor Licht schützen und 2 h bei RT mit geringer Bewegung in einer kompakten Wippe inkubieren, wobei die Geschwindigkeit zwischen 2-3 U/min beibehalten wird.
    HINWEIS: Die Durchstechflasche mit biotinylierten Antikörpern enthält 24 μg Antikörper. Nach Rekonstitution mit 1,0 ml Reagenzverdünnungsmittel wird der biotinylierte Nachweisantikörper in einer Arbeitslösung von 400 ng/ml verdünnt.
  10. Wiederholen Sie Schritt 2.
  11. In jede Vertiefung werden 100 μL der Arbeitsverdünnung von Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP, siehe Materialtabelle) gegeben. Die Mikroplatte mit Licht abdecken und 20 min bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Das reaktive Streptavidin-HRP war 40-fach konzentriert. Die Arbeitslösung 1x Streptavidin- HRP wurde mit Reagenzverdünnungsmittel hergestellt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Platte direktem Licht auszusetzen.
  12. Wiederholen Sie Schritt 2.
  13. Schließlich werden 100 μL Substrattetramethylbenzidin (TMB, siehe Tabelle der Materialien) zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
    HINWEIS: Bereiten Sie TMB-Lösung mit einem gleichen Volumen stabilisierter Wasserstoffperoxid-30% iger Lösung vor, die im Kit enthalten ist.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch vor und halten Sie sie bei Raumtemperatur.
  14. Inkubieren Sie für 30 min bei RT an einem dunklen Ort.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Platte direktem Licht auszusetzen. Saugen Sie die TMB-Lösung nicht ab, da kein weiteres Waschen erforderlich ist.
  15. Fügen Sie 50 μL 1NH2SO4-Stopp-Lösung hinzu, um die kolorimetrische Reaktion zu stoppen. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten.
  16. Bestimmen Sie sofort die Absorption jeder Vertiefung mit einem Mikroplattenleser, der in einem ELISA-Plattenspektrometer auf 450 nm eingestellt ist.
  17. Messen Sie die Absorption mit einem ELISA-Plattenspektrometer in einem Endpunktmodus mit geringer Erschütterung für 10 s.
  18. Der Absorptionswert von 450 nm der Standard-Blindproben wird gemittelt und von anderen 450-nm-Werten von Standardproben und unbekannten Proben subtrahiert.
  19. Verwenden Sie die Standardkurve, um die Lumican-Konzentration jeder unbekannten Probe zu bestimmen.
  20. Für die Berechnung der Lumican-Konzentration erstellen Sie ein lineares Regressionsdiagramm unter Verwendung der Extinktionswerte auf der Y-Achse gegen die Konzentrationen in pg / ml auf der X-Achse jeder Standard-Lumican-Kurve.
    1. Rufen Sie die Gleichung der linearen Regression und den r-Wert ab, um die Lumican-Konzentration zu berechnen.
      HINWEIS: Die Konzentration von Lumican wurde in Bezug auf die mg des extrahierten Gewebes normalisiert. Die Ergebnisse werden als normalisierte relative Konzentrationswerte von Lumican zu mg AM (ng/ml Lumican/mg AM-Gewebe) ausgedrückt.

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Ergebnisse

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Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Es wurden studentische t-Tests und Varianzanalysen (ANOVA) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe von Statistiksoftware (siehe Materialtabelle).

Die Gesamtproteinmenge in der AME wurde durch Zeit und Lagerbedingungen beeinflusst. Die basale Proteinkonzentration war bei allen AME ähnlich; der Bereich de...

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Diskussion

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In dieser Studie wurde das Vorhandensein von Lumican im AME und seine direkte Korrelation mit seiner Stabilität unter verschiedenen Lagerbedingungen analysiert. Interessanterweise stieg die Proteinkonzentration nach der Lagerung an, wenn die Gesamtproteinkonzentration in AME quantifiziert wurde. Es gibt Hinweise auf drei Mechanismen, die die Proteinkonzentration in gefrorenen Lagern verändern könnten: kalte Denaturierung, die gefrorene Konzentration gelöster Stoffe und eisinduzierte teilweise Entfaltung der Proteinstrukt...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie wurde durch das Förderprogramm für Forschungs- und Technologieinnovationsprojekte der Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Fördernummer PAPIIT IN203821) und des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft, Technologie und Innovation (Fördernummer SECTEI 250/2019) finanziert.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 N H2SO4 AnschlaglösungR& D SystemsDY994
100 μ L MikropipetteEppendorf
1000 μ L MikropipetteEppendorf
15 mm PetrischaleSymlaboratorios
18 G Nadel (1,2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 
2 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorfZ606340
20 mL Kunststoffspritze BD Becton Dickinson 
20 μ L MikropipetteEppendorf
20-200 μ L MikropipetteEppendorf
5 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorf30119401
96-Well-MikroplatteSARSTEDT821581
AluminiumfolieN/AN/A
AmnionmembranInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Ausgewogene SalzlösungBausch + LombBSS-403802
BecherN/AN/A
BioRender BioRenderFiguren Design 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
komplett, EDTA-frei, Proteasehemmer
Cocktailtabletten		Roche11 873 580 001Proteasehemmer
Daiggner Vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA PlattenspektrometerThermo Labsystems& nbsp;35401106Multiscan
Freezer
GraphPad PrismaGraphPad Software, IncVersion 9statistisches Analyse- und Grafikprogramm 
Human Lumican DuoSet ELISA KitR& D SystemsDY2846-05enthält einen humanen Lumican-Capture-Antikörper-Inkubator
.Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
InverslichtmikroskopOlympus 6A13921zur Bestätigung der Deepithelisierung  Mod.CK2
Laminar-Flow-HaubeForma Scientific14753-567Mod.1184
FlüssigstickstoffN/AN/A
MörserN/AN/A
MehrkanalpipetteEppendorf
StickstofftankThermo ScientificMod. Biocan 20
PapierhandtücherN/AN/A
Phosphatgepufferte KochsalzlösungR& D SystemsDY006
Pierce Modifiziertes Lowry-Protein-Assay-KitThermo Scientific23240
PlattenversiegelerF& T & D SystemsDY992
Reagenz VerdünnungsmittelF& Technik D SystemsDY9951% BSA in PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μ m gefilterte
gekühlte Zentrifugecenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Gummi Polizist ZellschaberNEST710001zur mechanischen Deepithelisierung
SkalpellmesserBraunBB521Nr. 10 oder 21
Streptavidin-HRP 40-fach konzentriertForschung & Forschung D SystemsTeil 893975
Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) LösungF& Technik D SystemsDY999
ZahnpinzetteInvent Germany6bEdelstahl 
ReinstwasserPISA
Wash PufferR& D SystemsWA1260,05 % Tween 20 in PBS, pH 7,2-7,4
305211302562

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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