Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Lumican aus der Amnionmembran (AM) und deren Lagerbedingungen als AM-Extrakt (AME) bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage, um seine Proteine und Lumican-Konzentration zu quantifizieren.
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Methodenartikel
Lumican-Extraktion aus Amnionmembran und Bestimmung ihrer Lagertemperatur
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lumican ist ein kleines leucinreiches Proteoglykan in der menschlichen Amnionmembran (AM), das die Hornhautepithelisierung und die Organisation von Kollagenfasern fördert und die Transparenz der Hornhaut aufrechterhält. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Proteinextraktion aus AM vorgeschlagen, um Lumican zu erhalten. Zusätzlich wird die Stabilität von Lumican im AM-Extrakt (AME) bewertet, der bei verschiedenen Temperaturen und Zeiträumen gelagert wird. 100 mg AM wurden aufgetaut und mechanisch deepithelialisiert. Das deepithelialisierte AM wurde eingefroren und zerkleinert, bis ein feines Pulver erhalten wurde, das mit 2,5 ml Kochsalzpuffer mit Proteaseinhibitoren gelöst und zur Proteinextraktion zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage gelagert. Danach wurde Lumican in jedem AME quantifiziert. Diese Technik ermöglicht ein zugängliches und erwerbbares Protokoll für die Lumican-Extraktion aus AM. Die Lumican-Konzentration wurde durch die Lagerzeit und die Temperaturbedingungen beeinflusst. Lumican in der AME von 12 Tagen Lagerung bei -20 °C und 4 °C war signifikant höher als andere AME. Diese Lumican-Extraktion könnte für die Entwicklung von Behandlungen und pharmazeutischen Lösungen nützlich sein. Weitere Studien sind erforderlich, um die Verwendung von AME Lumican bei der Reepithelialisierung und Wundheilung zu bestimmen.
Einleitung
Eine der am häufigsten verwendeten Behandlungen für Hornhauterkrankungen ist die Amnionmembrantransplantation; In den letzten Jahren sind jedoch neue Vorschläge für die Verwendung verschiedener Bestandteile des Fruchtwassergewebes als alternative und adjuvante Behandlungen aufgetaucht. Zu den am meisten untersuchten Komponenten von AM gehören diejenigen, die aus dem AM-Extrakt (AME) 1,2,3,4,5,6,7 gewonnen werden. AM enthält mehrere löslic....
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Protokoll
Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Review Board genehmigt (Projekt Nr. CEI-2020/06/04). Die AM wurde von der Amnionbank Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (von identifizierten menschlichen Probanden) erhalten, die wie von Chávez-García et al.17 beschrieben hergestellt wird.
1. Herstellung des Amnionmembranextrakts
- Erhalten Sie 100 mg AM von der Amnionbank.
HINWEIS: Laut einem früheren Bericht sezernieren 50 mg AM insgesamt 10 ng / ml Lumican14. Um eine höhere Konzentration von Lumic zu erhalten, verwenden Sie 100 mg AM, was einer Ge....
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Ergebnisse
Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Es wurden studentische t-Tests und Varianzanalysen (ANOVA) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe von Statistiksoftware (siehe Materialtabelle).
Die Gesamtproteinmenge in der AME wurde durch Zeit und Lagerbedingungen beeinflusst. Die basale Proteinkonzentration war bei allen AME ähnlich; der Bereich de.......
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Diskussion
In dieser Studie wurde das Vorhandensein von Lumican im AME und seine direkte Korrelation mit seiner Stabilität unter verschiedenen Lagerbedingungen analysiert. Interessanterweise stieg die Proteinkonzentration nach der Lagerung an, wenn die Gesamtproteinkonzentration in AME quantifiziert wurde. Es gibt Hinweise auf drei Mechanismen, die die Proteinkonzentration in gefrorenen Lagern verändern könnten: kalte Denaturierung, die gefrorene Konzentration gelöster Stoffe und eisinduzierte teilweise Entfaltung der Proteinstrukt.......
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Offenlegungen
Die Studie wurde durch das Förderprogramm für Forschungs- und Technologieinnovationsprojekte der Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Fördernummer PAPIIT IN203821) und des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft, Technologie und Innovation (Fördernummer SECTEI 250/2019) finanziert.
Danksagungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 N H2SO4 Anschlaglösung | R& D Systems | DY994 | |
| 100 μ L Mikropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μ L Mikropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petrischale | Symlaboratorios | ||
| 18 G Nadel (1,2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | ||
| 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL Kunststoffspritze | BD Becton Dickinson | ||
| 20 μ L Mikropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μ L Mikropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-Well-Mikroplatte | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminiumfolie | N/A | N/A | |
| Amnionmembran | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Ausgewogene Salzlösung | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Becher | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | Figuren Design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| komplett, EDTA-frei, Proteasehemmer Cocktailtabletten | Roche | 11 873 580 001 | Proteasehemmer |
| Daiggner Vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA Plattenspektrometer | Thermo Labsystems& nbsp; | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prisma | GraphPad Software, Inc | Version 9 | statistisches Analyse- und Grafikprogramm |
| Human Lumican DuoSet ELISA Kit | R& D Systems | DY2846-05 | enthält einen humanen Lumican-Capture-Antikörper-Inkubator |
| . | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverslichtmikroskop | Olympus | 6A13921 | zur Bestätigung der Deepithelisierung Mod.CK2 |
| Laminar-Flow-Haube | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Flüssigstickstoff | N/A | N/A | |
| Mörser | N/A | N/A | |
| Mehrkanalpipette | Eppendorf | ||
| Stickstofftank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Papierhandtücher | N/A | N/A | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | R& D Systems | DY006 | |
| Pierce Modifiziertes Lowry-Protein-Assay-Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plattenversiegeler | F& T & D Systems | DY992 | |
| Reagenz Verdünnungsmittel | F& Technik D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μ m gefilterte |
| gekühlte Zentrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Gummi Polizist Zellschaber | NEST | 710001 | zur mechanischen Deepithelisierung |
| Skalpellmesser | Braun | BB521 | Nr. 10 oder 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fach konzentriert | Forschung & Forschung D Systems | Teil 893975 | |
| Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) Lösung | F& Technik D Systems | DY999 | |
| Zahnpinzette | Invent Germany | 6b | Edelstahl |
| Reinstwasser | PISA | ||
| Wash Puffer | R& D Systems | WA126 | 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7,2-7,4 |
Referenzen
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
