Methodenartikel

Sammlung von Alfalfa-Wurzelexsudaten zur Untersuchung des Einflusses von Di(2-ethylhexyl)phthalat auf die Metabolitenproduktion

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DOI:

10.3791/64470

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2. Juni 2023

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne durch eine nicht zielgerichtete metabolomische Analyse bewertet werden kann.

Zusammenfassung

Wurzelexsudate sind die wichtigsten Medien der Informationskommunikation und des Energietransfers zwischen Pflanzenwurzeln und der Umgebung. Die Veränderung der Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, allgemeine Richtlinien für die Sammlung von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um die Auswirkungen von Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Zunächst werden Luzerne-Sämlinge unter DEHP-Stress in einem hydroponischen Kulturexperiment gezüchtet. Zweitens werden die Pflanzen für 6 h in Zentrifugenröhrchen mit 50 ml sterilisiertem Reinstwasser überführt, um Wurzelexsudate zu sammeln. Anschließend werden die Lösungen in einem Vakuum-Gefriertrockner gefriergetrocknet. Die gefrorenen Proben werden extrahiert und mit Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz derivatisiert. Anschließend werden die derivatisierten Extrakte mit einem Gaschromatographensystem in Verbindung mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gemessen. Die gewonnenen Metabolitendaten werden dann mit bioinformatischen Methoden analysiert. Differentielle Metaboliten und signifikant veränderte Stoffwechselwege sollten eingehend erforscht werden, um die Auswirkungen von DEHP auf Luzerne im Hinblick auf Wurzelexsudate aufzudecken.

Einleitung

Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) ist eine synthetische chemische Verbindung, die in verschiedenen Kunststoffen und Polymeren als Weichmacher verwendet wird, um deren Plastizität und Festigkeit zu verbessern. In den letzten Jahren deuten immer mehr Studien darauf hin, dass DEHP ein endokriner Disruptor ist und sich nachteilig auf die Atemwege, Nerven und Fortpflanzungssysteme von Menschen und anderen Tieren auswirkt 1,2,3. In Anbetracht seines Gesundheitsrisikos haben die Umweltschutzbehörde der Vereinigten Staaten, die Europäische Union und das Environmental Monitoring Center of China DEHP in die Liste der prioritären Schadstoffe aufgenommen. Der Boden wurde aufgrund der Anwendung von Kunststoffmulch und organischem Dünger, der Bewässerung mit Abwasser und der Anwendung von Schlammfarmen als wichtige Senke von DEHP in der Umwelt angesehen4. Erwartungsgemäß wurde DEHP ubiquitär in landwirtschaftlich genutzten Böden nachgewiesen, deren Gehalt in einigen Regionen Chinas sogar bis zu Milligramm pro Kilogramm getrockneter Böden erreicht 5,6. DEHP kann hauptsächlich über die Wurzeln in Pflanzen eindringen und auf verschiedenen trophischen Ebenen in Bodenökosystemen biomagnifikiert werden7. Daher wurde in den letzten Jahrzehnten erhebliche Besorgnis über DEHP-induzierten Stress in Pflanzen geäußert.

Pflanzen sind in der Regel anfällig für eine DEHP-Exposition. Es wurde beobachtet, dass DEHP-Stress eine nachteilige Wirkung auf die Samenkeimung und den normalen Stoffwechsel ausübt und dadurch das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen hemmt 8,9. Zum Beispiel kann DEHP oxidative Schäden an Mesophyllzellen induzieren, den Gehalt an Chlorophyll und Osmolyten verringern und die antioxidative Enzymaktivität erhöhen, was schließlich zu einer Abnahme des Ertrags und der Qualität essbarer Pflanzen führt10,11. Die meisten bisherigen Studien über die Reaktion von Pflanzen auf DEHP-Stress konzentrierten sich jedoch auf oxidativen Stress und physiologische und biochemische Eigenschaften. Die entsprechenden Mechanismen, die mit dem pflanzlichen Stoffwechsel verbunden sind, sind weniger erforscht. Wurzelexsudate ist ein Oberbegriff, der Verbindungen beschreibt, die Pflanzenwurzeln absondern und in die Umwelt abgeben. Sie gelten als Interaktionsmedien zwischen Pflanzen und dem Boden der Rhizosphäre und spielen eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung12. Es ist bekannt, dass Wurzelexsudate etwa 30%-40% des gesamten photosynthetischenKohlenstoffs ausmachen 13. In verschmutzten Umgebungen sind Wurzelausscheidungen an der Verbesserung der Toleranz von Pflanzen gegenüber dem Stress von Schadstoffen durch Stoffwechsel oder äußeren Ausschluss beteiligt14. Folglich könnte ein tiefes Verständnis der Reaktion von Pflanzenwurzelexsudaten auf Verschmutzungsstress dazu beitragen, die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken, die mit der Zellbiochemie und biologischen Phänomenen verbunden sind15.

Die Metabolomik-Technologie bietet eine effiziente Strategie zur gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von niedermolekularen Metaboliten in Zellen 16,17, Geweben18 und sogar Exsudaten von Organismen 19, einschließlich Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren und Lipiden. Im Vergleich zu herkömmlichen oder klassischen chemischen Analysemethoden erhöht der Metabolomik-Ansatz die Anzahl der nachweisbaren Metaboliten erheblich20, was dazu beitragen kann, Metaboliten mit höherem Durchsatz zu identifizieren und wichtige Stoffwechselwege zu identifizieren. Die Metabolomik ist im Forschungsbereich der biologischen Reaktion in Stressumgebungen, wie z. B. Schwermetalle21, neu auftretende Schadstoffe22 und Nanopartikel19, weit verbreitet. Die meisten dieser Studien an Pflanzen konzentrierten sich auf die metabolischen Veränderungen im inneren Pflanzengewebe, während nur wenige über die Reaktion von Wurzelexsudaten auf Umweltstress berichtet wurden. Ziel dieser Studie ist es daher, allgemeine Richtlinien für die Entnahme von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um den Einfluss von DEHP auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Die Ergebnisse dienen als methodischer Leitfaden für die Folgestudie der pflanzlichen Metabolomik mittels DEHP.

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Protokoll

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine allgemeine Pipeline von einem hydroponischen Kulturexperiment bis hin zu metabolomischen Analysen bereitzustellen, um die Wirkung von DEHP auf Luzernewurzelexsudate zu quantifizieren.

1. Hydroponisches Kulturexperiment

HINWEIS: Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel für ein hydroponisches Luzerne-Kulturexperiment, das entwickelt wurde, um Luzerne-Sämlinge (Medicago sativa) unter dem Stress verschiedener DEHP-Konzentrationen zu erhalten. Es wurden drei Behandlungen durchgeführt: die Kontrolle ohne Zusätze und die Nährlösung mit 1 mg kg-1 und 10 mg kg-1 di(DEHP. Die DEHP-Konzentrationen wurden entsprechend dem tatsächlichen DEHP-Gehalt im Boden23 festgelegt. Jede Behandlung hatte sechs Replikate.

  1. Luzernesamen mit 0,1 % Natriumhypochlorit für 10 Minuten und 75 % Ethylalkohol für 30 Minuten sterilisieren.
    1. Spülen Sie die sterilisierten Samen mehrmals mit destilliertem Wasser ab und keimen Sie dann auf feuchtem Filterpapier in einer sterilen Petrischale bei 30 °C im Dunkeln.
  2. Übertragen Sie 20 einheitliche, gekeimte, große, pralle Samen in einen Pfropfkorb in einer mit Nährlösung gefüllten Kulturflasche, bestehend aus (in μM): Ca(NO 3)2, 3.500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Na2Fe-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 75; H3 BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; und (NH4)6Mo7O24, 0,02. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 0,1 M KOH auf 7,0 ein. Erneuern Sie alle Lösungen wöchentlich.
  3. Stellen Sie alle Kulturflaschen in eine kontrollierte Wachstumskammer mit einer Lichtintensität von 150-180 μmol m-2 s-1 mit einer Photoperiode von 16 h pro Tag, bei 27 °C bzw. 20 °C, was Tag (16 h) bzw. Nacht (8 h) darstellt.
  4. Übertragen Sie 15 einheitliche Luzerne-Sämlinge in eine neue Glasflasche für Kulturexperimente unter 1 mg kg-1 und 10 mg kg-1 DEHP-Stress nach 2 Wochen. Wickeln Sie die Glasflaschen mit Alufolie und Parafilm ein, um eine Photolyse und Verflüchtigung des DEHP zu verhindern. Um die gleichen Bedingungen anzuwenden, wickeln Sie die Kontrollflaschen auch mit Alufolie und Parafolie ein. Ergänzen Sie die Nährlösung täglich, um den Flüssigkeitsstand aufrechtzuerhalten.
  5. Platzieren und drehen Sie die Flaschen alle 2 Tage nach dem Zufallsprinzip, um konsistente Wachstumsbedingungen für die Luzerne-Sämlinge zu gewährleisten.
  6. Nehmen Sie nach 7 Tagen Kultivierung die Luzernesämlinge aus den Flaschen und waschen Sie sie mehrmals mit Reinstwasser, um sich auf die Sammlung von Wurzelexsudaten vorzubereiten.

2. Sammlung, Extraktion und metabolomische Analyse von Wurzelexsudaten

HINWEIS: Dieses Protokoll ist in drei Teile unterteilt: ein Entnahmeexperiment, ein Extraktionsexperiment und eine metabolomische Analyse der Wurzelexsudate. Ziel des Sammelexperiments ist es, die in Pflanzenproben sezernierten Metaboliten zur anschließenden Extraktion in das Lösungssystem zu übertragen.

  1. Sammlungs-Experiment
    1. Übertragen Sie 10 gleichmäßige Luzerne-Sämlinge in Zentrifugenröhrchen, die mit 50 ml sterilisiertem deionisiertem Wasser gefüllt sind. Tauchen Sie die Wurzeln 6 Stunden lang in Wasser, um Wurzelausscheidungen zu sammeln. Halten Sie die Schläuche aufrecht. Führen Sie für jede Behandlung mindestens sechs Wiederholungen durch.
    2. Wickeln Sie die Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ein, um die Wurzeln vor Licht zu schützen.
    3. Entfernen Sie die Pflanzen und gefrieren Sie die gesammelte Flüssigkeit für die Erstellung von Metabolitenprofilen.
  2. Extraktions-Experiment
    1. 1,8 ml Extraktionslösung (Methanol:H2O= 3:1, V/V) in die Röhrchen geben und 30 s lang wirbeln.
    2. Wenden Sie 10 Minuten lang Ultraschallwellen in einem Eiswasserbad auf die Röhren an.
    3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C und 11.000 × g für 15 min.
    4. Übertragen Sie vorsichtig 200 μl Überstand in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Aus jeder Probe werden 45 μl Überstand entnommen und mit einem Endvolumen von 270 μl in Qualitätskontrollproben (QC) gemischt, die zur Kalibrierung der Metabolomdaten der Proben verwendet werden.
    5. Gefriertrocknen Sie die Extrakte in einem Vakuumkonzentrator. Trocknen Sie mit 5 μl des internen Standards (Ribonukleol) weiter.
    6. Nach dem Verdampfen in einem Vakuumkonzentrator werden 30 μl Methoxyaminierungshydrochlorid (gelöst in Pyridin in einer Konzentration von 20 mg ml-1) in die Röhrchen gegeben und die Röhrchen bei 80 °C 30 min lang inkubiert. Geben Sie dann 40 μl Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz (mit 1 % Trimethylchlorsilan [TMC], V/V) zu den Proben und stellen Sie die Röhrchen für 1,5 h bei 70 °C zur Derivatisierung auf.
    7. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab und fügen Sie den QC-Proben 5 μl Fettsäuremethylester (FAMEs) (in Chloroform) hinzu.
  3. Metabolomische Analyse
    1. Injizieren Sie 1,0 μl der derivatisierten Extrakte in ein Gaschromatographensystem, das mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt ist, um die metabolomische Profilerstellung im splitlosen Modus zu analysieren.
      1. Verwenden Sie eine Kapillarsäule (30 m x 250 μm x 0,25 μm) zur Abtrennung von Wurzelexsudaten, mit Helium als Trägergas bei einer Flussrate von 1,0 mL min-1. Stellen Sie die Injektionstemperatur auf 280 °C ein und halten Sie die Temperatur der Transferleitung und die Temperatur der Ionenquelle bei 280 °C bzw. 250 °C.
      2. Zum Trennen verwenden Sie folgendes Ofenprogramm: 1 min isotherme Erwärmung auf 50 °C, 10 °C/min-1 Ofenrampe auf 310 °C und eine abschließende isotherme Erwärmung auf 310 °C für 8 min.
      3. Führen Sie den Elektronenkollisionsmodus mit einer Energie von -70 eV durch. Erhalten Sie Massenspektren im Vollscan-Überwachungsmodus mit einem Massenscanbereich von 50-500 m/z bei einer Rate von 12,5 Spektren/s.
    2. Filtern Sie einzelne Spitzen, um Rauschen zu entfernen. Der Abweichungswert wird basierend auf dem Interquartilsabstand gefiltert.
    3. Füllen Sie die fehlenden Werte mit der Hälfte der Mindestwerte, standardisieren und normalisieren Sie die Daten.
    4. Importieren Sie die endgültigen Daten in .csv Format in eine statistische Analysesoftware für die multivariate Analyse.
    5. Schlagen Sie die Metaboliten in der Datenbank der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) nach (eine Datenbankressource zum Verständnis der allgemeinen Funktionen und Nützlichkeiten des biologischen Systems) und klassifizieren Sie die Metaboliten in verschiedene Kategorien wie Kohlenhydrate, Säuren, Lipide, Alkohole und Amine. Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um ein Kreisdiagramm zu erstellen, das den Prozentsatz jeder Kategorie in allen Wurzelexsudaten angibt.
    6. Wenden Sie überwachte orthogonale Projektionen auf die Diskriminationsanalyse latenter Strukturen (OPLS-DA) an, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu demonstrieren.
    7. Das Screening signifikant veränderte Metaboliten als differentielle Metaboliten basierend auf einer variablen Wichtigkeit in der Projektion (VIP) > 1 und p < 0,05 (Student's t Test).
    8. Verwenden Sie die Metabolomdaten, um Heatmaps mit der statistischen Analysesoftware zu erstellen, und verwenden Sie die Faltungsänderungen unter verschiedenen Behandlungen, um Histogramme zu erstellen.
    9. Schlagen Sie die differentiellen Metaboliten in der KEGG-Datenbank und in Pubchem nach und stellen Sie die Stoffwechselwege zusammen, die die differentiellen Metaboliten enthalten. Führen Sie eine Analyse der Pfadanreicherung oder der Topologie durch.

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Ergebnisse

In diesem Experiment wurden Luzernewurzelexsudate gesammelt, extrahiert und nach den oben genannten Methoden analysiert (Abbildung 1). Es wurden drei Behandlungsgruppen eingerichtet: Kontrollgruppe, niedrige Konzentration von DEHP (1 mg L−1) und hohe Konzentration von DEHP (10 mg L−1).

Im Chromatographen der Kontrollgruppe wurden insgesamt 778 Peaks detektiert, von denen 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert werden konnten. ...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine allgemeine Anleitung zur Erfassung und Messung der Wurzelexsudate von Luzerne unter DEHP-Stress sowie zur Analyse der Metabolomdaten. Einigen kritischen Schritten in diesem Protokoll muss besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. In hydroponischen Kulturexperimenten wurden Luzerne-Sämlinge hydroponisch in Glasflaschen kultiviert, die mit Nährlösungen mit unterschiedlichen DEHP-Konzentrationen gefüllt waren. Die Glasflaschen sollten während der gesamten Kulturperiode vor Licht geschützt werde...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (41877139), den Großprojekten der National Natural Science Foundation of China (41991335), dem National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nr. BK20161616), dem "135"-Plan und dem Frontiers Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (ISSASIP1615) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdonitolSIGMA≥ 99%
Alfalfa-SaatgutJiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
AnalysenwaageSartoriusBSA124S-CW
BSTFAREGIS Technologiesmit 1% TMCS, v/v
ZentrifugeThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
Chromatographische SäuleAgilentDB-5MS (30 m & mal 250 & mu; m & times; 0,25 μm m)
Di(2-ethylhexyl)phthalatDr. Ehrenstorfer
FAMEsDr. Ehrenstorfer
Gaschromatographie (GC)Agilent7890A
SchleifinstrumentShanghai Jingxin Technology Co., LtdJXFSTPRP-24
Massenspektrometer (MS)LECOPEGASUS HT
MethanolCNW TechnologiesHPLC
MethoxyaminatiohydrochloridTCIAR
MikrozentrifugenröhrchenEppendorfEppendorf Quality1,5 mL
OfenShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdDHG-9023A
PyridinAdamasHPLC
R SoftwareStatistische Analysesoftware (Pfadanreicherung, Topologie)
SIMCA16.0.2 Statistische Analysesoftware (OPLS-DA usw.)
UltratiefkühlschrankThermo Fisher ScientificForma 900 Serie
UltraschallShenzhen Fangao Microelectronics Co., LtdYM-080S
VakuumtrocknerTaicang Huamei Fabrik für biochemische InstrumenteLNG-T98

Referenzen

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DEHP StressMetaboliten Profilingnicht zielgerichtete Metabolomikhydroponische KulturGaschromatographieMassenspektrometriedifferenzielle MetabolitenStoffwechselwegeEntgiftung in Pflanzen

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