Die Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne durch eine nicht zielgerichtete metabolomische Analyse bewertet werden kann.
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Methodenartikel
Sammlung von Alfalfa-Wurzelexsudaten zur Untersuchung des Einflusses von Di(2-ethylhexyl)phthalat auf die Metabolitenproduktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wurzelexsudate sind die wichtigsten Medien der Informationskommunikation und des Energietransfers zwischen Pflanzenwurzeln und der Umgebung. Die Veränderung der Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, allgemeine Richtlinien für die Sammlung von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um die Auswirkungen von Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Zunächst werden Luzerne-Sämlinge unter DEHP-Stress in einem hydroponischen Kulturexperiment gezüchtet. Zweitens werden die Pflanzen für 6 h in Zentrifugenröhrchen mit 50 ml sterilisiertem Reinstwasser überführt, um Wurzelexsudate zu sammeln. Anschließend werden die Lösungen in einem Vakuum-Gefriertrockner gefriergetrocknet. Die gefrorenen Proben werden extrahiert und mit Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz derivatisiert. Anschließend werden die derivatisierten Extrakte mit einem Gaschromatographensystem in Verbindung mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gemessen. Die gewonnenen Metabolitendaten werden dann mit bioinformatischen Methoden analysiert. Differentielle Metaboliten und signifikant veränderte Stoffwechselwege sollten eingehend erforscht werden, um die Auswirkungen von DEHP auf Luzerne im Hinblick auf Wurzelexsudate aufzudecken.
Einleitung
Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) ist eine synthetische chemische Verbindung, die in verschiedenen Kunststoffen und Polymeren als Weichmacher verwendet wird, um deren Plastizität und Festigkeit zu verbessern. In den letzten Jahren deuten immer mehr Studien darauf hin, dass DEHP ein endokriner Disruptor ist und sich nachteilig auf die Atemwege, Nerven und Fortpflanzungssysteme von Menschen und anderen Tieren auswirkt 1,2,3. In Anbetracht seines Gesundheitsrisikos haben die Umweltschutzbehörde der Vereinigten Staaten, die Europäische Union und das Environmental Monitoring Center ....
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Protokoll
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine allgemeine Pipeline von einem hydroponischen Kulturexperiment bis hin zu metabolomischen Analysen bereitzustellen, um die Wirkung von DEHP auf Luzernewurzelexsudate zu quantifizieren.
1. Hydroponisches Kulturexperiment
HINWEIS: Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel für ein hydroponisches Luzerne-Kulturexperiment, das entwickelt wurde, um Luzerne-Sämlinge (Medicago sativa) unter dem Stress verschiedener DEHP-Konzentrationen zu erhalten. Es wurden drei Behandlungen durchgeführt: die Kontrolle ohne Zusätze und die Nährlösung mit 1 mg kg-1 und 10 mg k....
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Ergebnisse
In diesem Experiment wurden Luzernewurzelexsudate gesammelt, extrahiert und nach den oben genannten Methoden analysiert (Abbildung 1). Es wurden drei Behandlungsgruppen eingerichtet: Kontrollgruppe, niedrige Konzentration von DEHP (1 mg L−1) und hohe Konzentration von DEHP (10 mg L−1).
Im Chromatographen der Kontrollgruppe wurden insgesamt 778 Peaks detektiert, von denen 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert werden konnten. .......
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Diskussion
Dieses Protokoll bietet eine allgemeine Anleitung zur Erfassung und Messung der Wurzelexsudate von Luzerne unter DEHP-Stress sowie zur Analyse der Metabolomdaten. Einigen kritischen Schritten in diesem Protokoll muss besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. In hydroponischen Kulturexperimenten wurden Luzerne-Sämlinge hydroponisch in Glasflaschen kultiviert, die mit Nährlösungen mit unterschiedlichen DEHP-Konzentrationen gefüllt waren. Die Glasflaschen sollten während der gesamten Kulturperiode vor Licht geschützt werde.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (41877139), den Großprojekten der National Natural Science Foundation of China (41991335), dem National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nr. BK20161616), dem "135"-Plan und dem Frontiers Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (ISSASIP1615) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adonitol | SIGMA | ≥ 99% | |
| Alfalfa-Saatgut | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analysenwaage | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | mit 1% TMCS, v/v | |
| Zentrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographische Säule | Agilent | DB-5MS (30 m & mal 250 & mu; m & times; 0,25 μm m) | |
| Di(2-ethylhexyl)phthalat | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gaschromatographie (GC) | Agilent | 7890A | |
| Schleifinstrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Massenspektrometer (MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatiohydrochlorid | TCI | AR | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1,5 mL |
| Ofen | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridin | Adamas | HPLC | |
| R Software | Statistische Analysesoftware (Pfadanreicherung, Topologie) | ||
| SIMCA16.0.2 | Statistische Analysesoftware (OPLS-DA usw.) | ||
| Ultratiefkühlschrank | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 Serie | |
| Ultraschall | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vakuumtrockner | Taicang Huamei Fabrik für biochemische Instrumente | LNG-T98 |
Referenzen
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053(2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
