Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.
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Methodenartikel
Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und das Differenzierungspotenzial mehrerer Linien gelten allgemein als die bestimmenden Merkmale hämatopoetischer Stammzellen (HSCs). Zahlreiche Studien deuten jedoch darauf hin, dass im HSC-Kompartiment funktionelle Heterogenität besteht. Neuere Einzelzellanalysen haben über HSC-Klone mit unterschiedlichen Zellschicksalen innerhalb des HSC-Kompartiments berichtet, die als biased HSC-Klone bezeichnet werden. Die Mechanismen, die heterogenen oder schlecht reproduzierbaren Ergebnissen zugrunde liegen, sind wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Dauer der Selbsterneuerung, wenn gereinigte HSZ-Fraktionen durch konventionelle Immunfärbung transplantiert werden. Daher ist die Etablierung einer reproduzierbaren Isolationsmethode für Langzeit-HSZ (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSZ (ST-HSCs), definiert durch die Dauer ihrer Selbsterneuerung, entscheidend für die Überwindung dieses Problems. Mit Hilfe eines unverzerrten mehrstufigen Screenings konnten wir einen Transkriptionsfaktor, Hoxb5, identifizieren, der ein exklusiver Marker für LT-HSCs im hämatopoetischen System der Maus sein könnte. Basierend auf diesen Erkenntnissen etablierten wir eine Hoxb5-Reportermauslinie und isolierten erfolgreich LT-HSCs und ST-HSCs. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs unter Verwendung des Hoxb5-Reportersystems . Diese Isolationsmethode wird den Forschern helfen, die Mechanismen der Selbsterneuerung und die biologischen Grundlagen für diese Heterogenität im HSZ-Kompartiment besser zu verstehen.
Einleitung
Hämatopoetische Stammzellen (HSZ), die über Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz verfügen, befinden sich an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie 1,2. 1988 zeigten Weissman und Kollegen erstmals, dass die Isolierung von HSZ bei Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie erreicht werden kann3. Anschließend wurde berichtet, dass eine Fraktion, die durch eine Kombination von Zelloberflächenmarkern definiert wurde, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSCs in Mäusen 4,5,6,....
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Protokoll
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research genehmigt.
1. Vorkonditionierung der Empfängermäuse
- Männliche C57BL/6 kongene Mäuse im Alter von 8-10 Wochen werden als Empfängermäuse vorbereitet. Die Anzahl der Empfängermäuse hängt vom Versuchsprotokoll ab. Wir bereiten in der Regel 10-20 Mäuse für jede Erkrankung vor.
- Füttern Sie die Mäuse mit sterilisiertem Wasser, das mit Enrofloxacin (170 mg/l) ergänzt ist. Da bestrahlte Empfängermäuse sehr anfällig für Infektionen sind, sollten die Käfige so sauber wie möglich gehalten werden.
HINWEIS: Die Supplementierung mi....
- Füttern Sie die Mäuse mit sterilisiertem Wasser, das mit Enrofloxacin (170 mg/l) ergänzt ist. Da bestrahlte Empfängermäuse sehr anfällig für Infektionen sind, sollten die Käfige so sauber wie möglich gehalten werden.
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Ergebnisse
Bisher wurde die Selbsterneuerungskapazität mit Hilfe von kompetitiven Transplantationsassays gemessen, bei denen angenommen wurde, dass Spender-HSZ ihre Selbsterneuerungsfähigkeit nur dann behalten, wenn Spenderzellen mit mehreren Linien im peripheren Blut des Empfängers beobachtet werden17. Darüber hinaus werden LT-HSZ in mehreren Berichten als Zellen definiert, die auch mehrere Monate nach der zweiten Knochenmarktransplantation noch periphere Blutzellen produzieren10,18<.......
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Diskussion
Traditionell wurden HSCs, die durch Zelloberflächenmarker definiert sind, hergestellt, um die Funktionen von HSCs zu untersuchen, wie z. B. die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Multipotenz 19,20,21. Die immunphänotypisch definierte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-Fraktion enthält jedoch zwei diskrete HSZ-Populationen: LT-HSCs und ST-.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.
Danksagungen
Wir danken Hiroshi Kiyonari für die Tierpflege und die Bereitstellung von Empfängermäusen am RIKEN BDR sowie Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka und Masaki Miyahashi für das Labormanagement an der Universität Kobe. Die Autoren schätzen auch die anhaltende Unterstützung für diese Arbeit sehr. Masanori Miyanishi wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 und JP20H03268, der Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, der Life Science Foundation of Japan, der Takeda Science Foundation, der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders und AMED-PRIME, AMED unter der Fördernummer JP18gm6110020....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,2 mL Streifen mit 8 Röhrchen, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0,5M EDTA pH 8,0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 & Mikro; m Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G Insulinspritze | BD | 326668 | |
| 40 µ m Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Schnappkappe für das Zellsieb | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 Well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator mit Falle Kolben | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6. CD45.1 kongene Mäuse | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II Sonderbestellsystem | BD | N/A | |
| Brillant-Fleckenpuffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 kongene Mäuse | N/A | N/A | gezüchtet im Labor |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Zentrifugenröhrchen 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Zentrifugenröhrchen 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) ohne Ca und Mg, flüssig | Nacalai | 14249-24 | |
| Fötales Rinderserum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo Version 10 | BD Biosciences | ||
| Gmmacell 40 Exactor | Beste Theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry Mäuse (C57BL/6J Hintergrund) | N/A | N/A | Gezüchtet in unserem Labor |
| IgG aus Rattenserum, technische Qualität, >=80% (SDS-PAGE), gepufferte wässrige Lösung | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| Isofluran | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Säulen | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lyse-Puffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Mikrotiterplatte für Gewebekultur (für Adhäsionszelle) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Maus-Pie-Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Mehrzweck-Kühlzentrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mischlösung | nacalai | 26253-84 | |
| Porzellanmörtel φ 120mm mit Stößel | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Röhrchen 1,5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Edelstahl Skalpellklinge | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Suspension für Mäuse Standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml konzentrische Luer-Slip-Spritze | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Injektionsnadel 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Referenzen
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
