Methodenartikel

Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/64490

⸱

21. Oktober 2022

 ,  , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die eukaryotische DNA-Replikation ist ein stark regulierter Prozess, der sicherstellt, dass der genetische Bauplan einer Zelle vor der Chromosomentrennung korrekt dupliziert wird. Da DNA-Synthesedefekte Chromosomenumlagerungen zugrunde liegen, ist die Überwachung der DNA-Replikation unerlässlich geworden, um die Grundlagen der Genominstabilität zu verstehen. Saccharomyces cerevisiae ist ein klassisches Modell zur Untersuchung der Zellzyklusregulation, aber wichtige DNA-Replikationsparameter, wie der Anteil der Zellen in der S-Phase oder die S-Phasendauer, sind immer noch schwer zu bestimmen. Dieses Protokoll verwendet kurze und ungiftige Impulse von 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), einem Thymidinanalogon, in technisch hergestellten TK-hENT1-Hefezellen, gefolgt von seiner Detektion durch Click-Reaktion, um die Visualisierung und Quantifizierung der DNA-Replikation mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Diese Methode kann zuvor übersehene Defekte in der S-Phase und im Zellzyklusverlauf von Hefemutanten identifizieren und so die Charakterisierung neuer Akteure ermöglichen, die für die Gewährleistung der Genomstabilität unerlässlich sind.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Genomstabilität durch mitotische Teilung wird durch die Übertragung eines vollständigen und gleichen Chromosomensatzes auf die beiden produzierten Zellnachkommen gewährleistet. Dies beruht auf der genauen Fertigstellung einer Reihe von Ereignissen, die in einer bestimmten Zeit in jeder Phase des Zellzyklus auftreten. In G 1 werden die Replikationsursprünge nach der Rekrutierung mehrerer Lizenzfaktoren, einschließlich Cdc61, lizenziert. In der S-Phase wird die Duplikation des gesamten Genoms von mehreren aktiven Replikationsursprüngen initiiert und von Replikationsmaschinen durchgeführt, die sich in mikroskopisch sichtbaren Herden sammeln, die als Replikationsfabrikenbezeichnet werden 2. In der M-Phase werden duplizierte Schwesterchromatiden an der mitotischen Spindel befestigt und biorientiert, um ihre Segregation zu den entgegengesetzten Polen der mitotischen Zelle3 zu ermöglichen. Die Regulierung, der ordnungsgemäße Abschluss und die Dauer jeder Phase sind der Schlüssel zur Gewährleistung der Genomstabilität. Tatsächlich führt ein vorzeitiger Ausstieg aus einer dieser Phasen zu einer Instabilität des Genoms. Zum Beispiel wird ein kürzeres G1, das durch Deletion des knospenden Hefe-CDK-Inhibitors Sic1 oder durch die Überexpression vonG1-Cyclinen induziert wird, die nachfolgende S-Phase 4,5,6 verändern. Folglich führen diese Deregulierungen, die mit Replikationsstress verbunden sind oder nicht, zu Chromosomenbrüchen, Umlagerungen und Fehltrennungen 4,5,6. Daher kann die Überwachung der Dauer der S-Phase und allgemeiner der Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus entscheidend sein, um die Defekte zu identifizieren, die in verschiedenen Mutanten und unter verschiedenen Stressbedingungen auftreten.

Eine traditionelle Methode zur Messung der Zellzyklusphasendauer umfasst die einfache DNA-Inhaltsdurchflusszytometrie (Abbildung 1A) und basiert auf einem geeigneten Algorithmus (verfügbar in den meisten Zytometrie-Software), der verwendet wird, um die Population in G1, S und G2 + M-Phasenfraktionen von den 1C- und 2C-Peaks zu trennen. Die Brüche werden dann mit der Populationsverdopplungszeit7 multipliziert. Diese Methode liefert jedoch nur geschätzte Werte, erfordert eine homogene Zellgrößenverteilung innerhalb eines gegebenen Bruchteils und ist nicht auf synchronisierte Kulturen anwendbar. Um die S-Phasendauer in Säugetierzellen zu untersuchen, wurden mehrere Thymidinanaloga entwickelt und weit verbreitet, einschließlich EdU. Ihre Aufnahme aus dem extrazellulären Medium und die Phosphorylierung durch Thymidinkinase (im Folgenden als TK bezeichnet) machen sie für DNA-Polymerasen verfügbar, um sie an Orten der DNA-Synthese (Replikation, Rekombination, Reparatur) einzubauen. Um das Fehlen des TK-Gens in Saccharomyces cerevisiae-Zellen zu umgehen, wurden Hefestämme so entwickelt, dass sie eine stabile und konstitutive Expression des Herpes-simplex-Virus TK8 und des humanen equilibrativen Nukleosidtransporters (hENT1)9 ermöglichen. Einmal in die DNA eingebaut, wird EdU durch die selektive Click-Reaktion nachgewiesen, die seinen Alkinanteil chemisch an azidmodifizierte Fluorochrome10 koppelt.

Dieser Artikel bietet zwei optimierte umfassende Protokolle zur Pulsmarkierung asynchroner und synchroner TK-hENT1-Zellen mit EdU, um die Dauer und Dynamik der DNA-Replikation sowie die Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie präzise zu visualisieren und zu messen.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellkultur von S. cerevisiae

HINWEIS: Die verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.

HINWEIS: Die S-Phasendauer kann auf verschiedene Arten überwacht werden. Je nach Fragestellung können die Zellen nach demG1-Arrest asynchron oder synchron gezüchtet werden.

  1. Aus asynchron wachsenden S. cerevisiae-Zellen
    HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des Prozentsatzes der Zellen in der S-Phase in einer asynchron wachsenden Zellpopulation. Durch Bestimmung der Verdopplungszeit kann die Dauer der S-Phase (und der anderen Phasen) extrapoliert werden.
    1. Impfung von S. cerevisiae-Zellen in 10 ml synthetischem vollständigem (SC) Medium bei niedriger Zellkonzentration (5 × 104 Zellen/ml) für eine Nachtkultur bei 30 °C mit orbitaler Bewegung bei 130 U/min.
      HINWEIS: Die Konzentration wird mit einem Zellzähler gemessen. Um die Verdopplungszeiten effizient zu berechnen, wird empfohlen, die Kultur aus einer Nachtkultur zu impfen, die sich noch in der exponentiellen Phase befindet (d.h. idealerweise unter 2 × 107 Zellen / ml). Das Züchten von Zellen in Rich Medium (YPD) wird nicht empfohlen, da der EdU-Nachweis nicht effizient ist.
    2. Am nächsten Tag werden die Zellen in 20 ml frischem SC-Medium mit der Endkonzentration von 5 × 105 Zellen/ml verdünnt.
    3. Kultur der Zellen bei 30 °C in einem Schüttelwasserbad mit horizontalem Schütteln bei 120 U/min.
    4. Messen Sie die Zellkonzentration jede Stunde, bis sie 1 × 107 Zellen / ml erreicht.
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht eine grafische Darstellung des Anstiegs der Zellkonzentration im Laufe der Zeit. Die Formel zur Berechnung der Verdopplungszeiten wird in der Legende von Tabelle 2 erläutert.
    5. Fahren Sie parallel zu Schritt 2 für die EdU-Markierung fort, wenn die Zellkonzentration etwa 2 × 10 6-5 × 106 Zellen / ml beträgt.
  2. Aus G 1-synchronisierten S. cerevisiae-Zellen
    HINWEIS: Mit dieser Methode kann mittels Durchflusszytometrie und/oder Mikroskopieanalysen bestimmt werden, wann die S-Phase beginnt und endet.
    1. Impfung von S. cerevisiae-Zellen in 10 ml SC-Medium bei niedriger Zellkonzentration (5 × 104 Zellen/ml) für eine Nachtkultur bei 30 °C mit orbitaler Bewegung bei 130 U/min.
      HINWEIS: Siehe die Hinweise nach Schritt 1.1.1.
    2. Am nächsten Tag werden die Zellen in 20 ml frischem SC-Medium bei einer Endkonzentration von 2 × 10 6-3 × 106 Zellen/ml verdünnt.
    3. Fügen Sie 40 μL 1 mg/ml α-Faktor in Wasser verdünnt hinzu.
    4. Kultur der Zellen bei 30 °C mit orbitalem Rühren bei 130 U/min für 1 h.
    5. Fügen Sie erneut 40 μL 1 mg/ml α-Faktor in Wasser verdünnt hinzu.
    6. Kultur der Zellen bei 30 °C mit orbitalem Rühren bei 130 U/min für 1 h.
    7. Visualisieren Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um denG1-Arrest zu überwachen. Fahren Sie fort, wenn mehr als 90% der Zellen einen Shmoo aufweisen und die anderen abgerundete, nicht knospnete Zellen sind.
      HINWEIS: Je nach verwendetem Hintergrund wird empfohlen, die Zellen vor der Shmoo-Visualisierung zu beschallen. Für den W303-Hintergrund 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
    8. 3 min bei 1.500 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    9. Resuspendieren Sie die Zellen in 20 ml SC-Medium.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.8-1.2.9 einmal.
      HINWEIS: Der α-Faktor wird mit diesen Schritten weggespült und die Zellen werden im Zellzyklus freigesetzt. Alternativ kann der α-Faktor weggespült werden, indem die Hefezellen mit einem 1,2-μm-Nitrozellulosefilter unter Verwendung eines Trichters auf einem Seitenarmkolben gefiltert werden, der mit einer Vakuumpumpe verbunden ist.
    11. Sammeln Sie 2x alle 5 Minuten 1 ml Zellen und fahren Sie mit Schritt 2 für die EdU-Kennzeichnung fort.
      HINWEIS: Markieren Sie die Zellen von nur einem der beiden Röhrchen mit EdU pulsierend. Die nicht pulsmarkierten Zellen werden verwendet, um EdU-positive von EdU-negativen Zellen auf einem bivariaten Propidiumiodid (PI)-EdU-Graphen zu unterscheiden.
    12. Fügen Sie 400 μL 1 mg/ml α-Faktor in Wasser 30 min nach der Freisetzung hinzu.
      HINWEIS: Diese hohe Dosis des α-Faktors ist erforderlich, um die Zellen in derG1-Phase des nächsten Zellzyklus zu stoppen und zu verhindern, dass die Zellen wieder in die nachfolgende S-Phase eintreten.

2. EdU-Kennzeichnung

  1. 1 ml Zellkultur in ein 2,0 ml Mikrofugenröhrchen mit 1 μL 10 mM EdU überführen. Gut mischen durch Inversion.
    HINWEIS: Um die EdU-positiven Zellen von den EdU-negativen Zellen auf einem bivariaten PI-EdU-FACS zu unterscheiden, überführen Sie weitere 1 ml Zellkultur in ein 2,0-ml-Mikrofugenröhrchen, das 1 μL DMSO enthält.
  2. 3-5 min bei 30 °C unter Rühren in einem schüttelnden Wasserbad inkubieren.
    HINWEIS: Drei Minuten sind ausreichend für die EdU-Detektion mit einem Mikroskop; 5 min sind für eine optimale EdU-Detektion auf einem Durchflusszytometer erforderlich.
  3. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 μL 100% Ethanol.
    1. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 μL 20% Paraformaldehyd, wenn eine Zellgrößenmessung erforderlich ist.
      HINWEIS: Wenn die Kernarchitektur der mitotischen Zellen für weitere Analysen nach der Klickreaktion intakt gehalten werden soll, empfehlen wir, Zellen mit 2% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) zu fixieren, anstatt die Zellen auf Eis zu legen, da letzteres eine Mikrotubuli-Depolymerisation verursacht.
    2. Lassen Sie die Zellen 20 Minuten bei RT unter leichtem Rühren auf einer Wippe mit variabler Geschwindigkeit bei 20 Neigungen/min stehen, um die Zellen vor der Zugabe von 100 μL 100% Ethanol zu fixieren.

3. Zellfixierung und Permeabilisierung

  1. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
  2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL 70% Ethanol. Gut durch Wirbeln mischen.
  3. Lassen Sie für ≥1 h bei RT bei 20 Neigungen / min auf einer Wippe mit variabler Geschwindigkeit, um die Zellen zu permeabilisieren.
    HINWEIS: Zellen, die in SC-Medium gezüchtet werden, pelletieren nicht gut, da sie dazu neigen, an den Mikrofugenwänden zu haften. Die Zugabe von Ethanol verbessert die Pelletierung und reduziert den Zellverlust. Die Zellen können über Nacht bei 4 °C oder über einen längeren Zeitraum bei −20 °C gelagert werden.
  4. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
  5. Waschen Sie die Zellen 2x mit 500 μL 10% Ethanol in PBS.
    HINWEIS: Die Waschungen sind entscheidend, um nicht inkorporiertes EdU aus den Zellen zu entfernen.

4. Click-it-Reaktion

  1. Für die zytometrische Analyse
    1. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    2. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μL PBS, das 0,1 mg/ml RNase A und 0,2 mg/ml Proteinase K enthält.
    3. Inkubieren für 1-2 h bei 50 °C mit gelegentlichem Schütteln (oder über Nacht bei 37 °C).
    4. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    5. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL PBS.
    6. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS + 1% Rinderserumalbumin (BSA). Inkubieren Sie für 30 min bei RT.
      HINWEIS: Längere Zeiten sind nicht notwendig und beeinträchtigen sogar die Effizienz von Klickreaktionen.
    8. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    9. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Verteilen Sie die Zellen auf zwei Röhrchen: 200 μL in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Click-Reaktion und 100 μL in einem weiteren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Sytox Green-Färbung.
    11. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    12. Für Sytox Green Färbung
      HINWEIS: Wir empfehlen dringend, ein Aliquot für Sytox Green Färbung (ohne Klick) zu nehmen, um qualitativ hochwertige DNA-Referenzprofile zu erhalten. Tatsächlich löscht die Click-Reaktion die Interkalantenfluoreszenz, einschließlich der Sytoxgrün- und PI-Fluoreszenz, stark. Folglich kann die Klickreaktion das Lesen des DNA-Inhalts verzerren.
      1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μL PBS.
      2. 10-30 μL (abhängig von der Zellkonzentration) in ein Durchflusszytometerröhrchen mit 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,5 μM Sytox Green überführen.
      3. Sonicate 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
      4. Im Dunkeln lassen, bis die Proben auf einem Durchflusszytometer verarbeitet werden.
        HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium für einige Tage bei 4 °C gehalten werden.
    13. Für die Klickreaktion
      1. Bereiten Sie einen frischen Azidfarbstoffpuffer vor, indem Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge mischen (Menge für ein Röhrchen): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 MCuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5-Azid und 2 μL 1 M Ascorbinsäure.
        HINWEIS: Es ist möglich, eine Mastermischung des Azidfarbstoffpuffers herzustellen. Die Reagenzien müssen in der gleichen Reihenfolge wie oben beschrieben gemischt werden.
      2. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 40 μL frisch hergestellter Azidfarbstoffmischung. Bei RT im Dunkeln 60 min inkubieren.
      3. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
      4. Waschen Sie die Zellen 3x mit 300 μL 10% Ethanol in PBS.
        HINWEIS: Die Waschungen sind entscheidend, um das gesamte lösliche EdU-Cy5-Azid zu entfernen.
      5. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL von 50 μg / ml PI in PBS. 10 min im Dunkeln stehen lassen.
      6. 10-30 μL der Zellsuspension (abhängig von der Zellkonzentration) in ein Durchflusszytometerröhrchen mit 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 überführen.
      7. Sonicate 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
      8. Im Dunkeln lassen, bis die Proben auf einem Zytometer verarbeitet werden.
        HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium für einige Tage bei 4 °C gehalten werden.
    14. Lesen Sie die Sytox Green-Proben mit einem blauen Anregungslaser bei 488 nm und einem 530/30 BP-Filter ab. Typische Ergebnisse finden Sie in Abbildung 1A . Lesen Sie die bivariaten PI-EdU-Proben in einem Punktdiagramm mit einem blauen Anregungslaser bei 488 nm und einem 615/20 BP-Filter für den PI (x-Achse) und einem roten Anregungslaser bei 640 nm und einem 660/20 BP-Filter (y-Achse). Typische Ergebnisse finden Sie in Abbildung 1B .
      HINWEIS: Abbildung 1C zeigt das typische bivariate PI-EdU-FACS-Ergebnis für EdU-negative Zellen. Es ermöglicht die Unterscheidung der EdU-negativen Zellen von den EdU-positiven Zellen.
  2. Für die Mikroskopie-Analyse
    1. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    2. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μL PBS + 1% BSA. Inkubieren Sie für 30 min bei RT.
    3. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    4. Bereiten Sie einen frischen Azidfarbstoffpuffer vor, indem Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge mischen (Menge für ein Röhrchen): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 MCuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530-Azid, 2 μL 1 M Ascorbinsäure.
      HINWEIS: Eine Mastermischung des Azidfarbstoffpuffers kann frisch hergestellt werden, indem die Reagenzien in der oben genannten Reihenfolge gemischt werden.
    5. Resuspendieren Sie das Pellet mit 40 μL frisch hergestelltem Azidfarbstoffpuffer. Bei RT im Dunkeln 60 min inkubieren.
    6. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    7. Waschen Sie die Zellen 2x mit 300 μL 10% Ethanol in PBS.
      HINWEIS: Die Waschungen sind entscheidend, um alle löslichen Dy-530-Azide zu entfernen.
    8. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    9. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 0,5 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in PBS. 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen lassen.
    10. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    11. Mit 300 μL PBS waschen, um überschüssiges DAPI zu entfernen.
    12. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    13. Resuspendieren Sie das Pellet mit 10-50 μL PBS in Abhängigkeit von der Zellkonzentration.
    14. Sonicate 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
      HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium für einige Tage bei 4 °C gehalten werden.
    15. 1,7 μL der Zellen auf einen Glasobjektträger pipettieren und mit einem sauberen Deckglas abdecken.
    16. Sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop mit DAPI und TexasRed oder Cy3 Filtern beobachten.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zur Bestimmung der S-Phasendauer und allgemeiner der Dauer vonG1 undG2+M (Protokollschritt 1.1) wurden S. cerevisiae W303 Wildtypzellen (WT, Tabelle 1) asynchron in SC-Medium für 7 h gezüchtet. Stündlich wurde die Zellkonzentration überwacht, um die Verdopplungszeit zu bestimmen (Abbildung 2B). Unter diesen Wachstumsbedingungen betrug die berechnete Verdopplungszeit 120 min ± 13 min bei 25 °C (Tabelle 2). Wenn sich die Zellen i...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hefe ist ein erstklassiger Modellorganismus für Zellzyklusstudien, aber die Charakterisierung seiner S-Phase wurde lange Zeit durch seine Unfähigkeit behindert, exogene Nukleoside wie BrdU aufzunehmen, die als Tracer der DNA-Replikation verwendet werden. Die Ausstattung der Hefe mit einer hohen Expression von Herpes-simplex-Thymidinkinase (TK) und die Zugabe eines humanen Nukleosidtransporters (hENT) hat dieses Problem weitgehend gelöst15,16. EdU ist vielseitiger...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Agence Nationale de la Recherche (ANR) und der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) für die PhD-Stipendien an J.d.D.B.T. und der Agence Nationale pour la Recherche (ANR) für die finanzielle Unterstützung (Stipendium ANR-18-CE12-0018-01). Zytometrie und Mikroskopie wurden in der Montpellier MRI BioCampus Bildgebungsanlage durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
α-Faktor GenescriptRP01002
Rinderserumalbumin (BSA)Euromedex04-100--812-E
KupfersulfatSigmaC1297
DAPISigmaD9542
Di-Sulfo-Cyanin5-Azid (Cy5-Azid)InterchimFP-JV6320Alternative zu Alexa647-Azid
Dy-530 Azid Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridin)CarbosynthNE08701
Ethanol absoluteCarlo Erba ReagenzienP013A10D16oder gleichwertige
L-AscorbinsäureSigmaA4544
PropidiumiodidSigmaP4864
Proteinase KEuromedexEU0090
RnaseSIGMAR5000
Sytox GreenInvitrogenS-7020
Equipment
Cell CounterOLSCASY
DurchflusszytometerAgilentNovoSampler Pro
SchüttelinkubatorInfors444-4230oder gleichwertig
Schüttelwasser BadJulaboSW22oder gleichwertig
SonicatorSonicsVibra-Zelle
WeitfeldmikroskopieLeicaTHUNDER Imageroder gleichwertig

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).

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