Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.
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Methodenartikel
Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die eukaryotische DNA-Replikation ist ein stark regulierter Prozess, der sicherstellt, dass der genetische Bauplan einer Zelle vor der Chromosomentrennung korrekt dupliziert wird. Da DNA-Synthesedefekte Chromosomenumlagerungen zugrunde liegen, ist die Überwachung der DNA-Replikation unerlässlich geworden, um die Grundlagen der Genominstabilität zu verstehen. Saccharomyces cerevisiae ist ein klassisches Modell zur Untersuchung der Zellzyklusregulation, aber wichtige DNA-Replikationsparameter, wie der Anteil der Zellen in der S-Phase oder die S-Phasendauer, sind immer noch schwer zu bestimmen. Dieses Protokoll verwendet kurze und ungiftige Impulse von 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), einem Thymidinanalogon, in technisch hergestellten TK-hENT1-Hefezellen, gefolgt von seiner Detektion durch Click-Reaktion, um die Visualisierung und Quantifizierung der DNA-Replikation mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Diese Methode kann zuvor übersehene Defekte in der S-Phase und im Zellzyklusverlauf von Hefemutanten identifizieren und so die Charakterisierung neuer Akteure ermöglichen, die für die Gewährleistung der Genomstabilität unerlässlich sind.
Einleitung
Die Genomstabilität durch mitotische Teilung wird durch die Übertragung eines vollständigen und gleichen Chromosomensatzes auf die beiden produzierten Zellnachkommen gewährleistet. Dies beruht auf der genauen Fertigstellung einer Reihe von Ereignissen, die in einer bestimmten Zeit in jeder Phase des Zellzyklus auftreten. In G 1 werden die Replikationsursprünge nach der Rekrutierung mehrerer Lizenzfaktoren, einschließlich Cdc61, lizenziert. In der S-Phase wird die Duplikation des gesamten Genoms von mehreren aktiven Replikationsursprüngen initiiert und von Replikationsmaschinen durchgeführt, die sich in mikroskopisch sichtbaren Herden....
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Protokoll
1. Zellkultur von S. cerevisiae
HINWEIS: Die verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
HINWEIS: Die S-Phasendauer kann auf verschiedene Arten überwacht werden. Je nach Fragestellung können die Zellen nach demG1-Arrest asynchron oder synchron gezüchtet werden.
- Aus asynchron wachsenden S. cerevisiae-Zellen
HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des Prozentsatzes der Zellen in der S-Phase in einer asynchron wachsenden Zellpopulation. Durch Bestimmung der Verdopplungszeit kann die Dauer der S-Phase (und der anderen Phasen....
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Ergebnisse
Zur Bestimmung der S-Phasendauer und allgemeiner der Dauer vonG1 undG2+M (Protokollschritt 1.1) wurden S. cerevisiae W303 Wildtypzellen (WT, Tabelle 1) asynchron in SC-Medium für 7 h gezüchtet. Stündlich wurde die Zellkonzentration überwacht, um die Verdopplungszeit zu bestimmen (Abbildung 2B). Unter diesen Wachstumsbedingungen betrug die berechnete Verdopplungszeit 120 min ± 13 min bei 25 °C (Tabelle 2). Wenn sich die Zellen i.......
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Diskussion
Hefe ist ein erstklassiger Modellorganismus für Zellzyklusstudien, aber die Charakterisierung seiner S-Phase wurde lange Zeit durch seine Unfähigkeit behindert, exogene Nukleoside wie BrdU aufzunehmen, die als Tracer der DNA-Replikation verwendet werden. Die Ausstattung der Hefe mit einer hohen Expression von Herpes-simplex-Thymidinkinase (TK) und die Zugabe eines humanen Nukleosidtransporters (hENT) hat dieses Problem weitgehend gelöst15,16. EdU ist vielseitiger.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren danken der Agence Nationale de la Recherche (ANR) und der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) für die PhD-Stipendien an J.d.D.B.T. und der Agence Nationale pour la Recherche (ANR) für die finanzielle Unterstützung (Stipendium ANR-18-CE12-0018-01). Zytometrie und Mikroskopie wurden in der Montpellier MRI BioCampus Bildgebungsanlage durchgeführt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| α-Faktor | Genescript | RP01002 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
| Kupfersulfat | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-Sulfo-Cyanin5-Azid (Cy5-Azid) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative zu Alexa647-Azid |
| Dy-530 Azid Dyomics | 530-10 | ||
| EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba Reagenzien | P013A10D16 | oder gleichwertige |
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A4544 | |
| Propidiumiodid | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell Counter | OLS | CASY | |
| Durchflusszytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Schüttelinkubator | Infors | 444-4230 | oder gleichwertig |
| Schüttelwasser Bad | Julabo | SW22 | oder gleichwertig |
| Sonicator | Sonics | Vibra-Zelle | |
| Weitfeldmikroskopie | Leica | THUNDER Imager | oder gleichwertig |
Referenzen
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125....
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Nachdrucke und Genehmigungen
