Bewertung der Auswirkungen von Biotoxinen auf die Funktion von Immunzellen im Zebrafisch

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt durchflusszytometrische Assays, mit denen die Auswirkungen der Toxinexposition auf die endozytären Funktionen verschiedener Subpopulationen von Zebrafisch-Leukozyten bewertet werden können. Die Verwendung spezifischer funktioneller Inhibitoren im Assay ermöglicht die Differenzierung der veränderten endozytären Mechanismen.

Zusammenfassung

Eine Vielzahl von biologischen Toxinen kann in der aquatischen Umwelt in schädlichen Mengen vorhanden sein. Cyanobakterien sind eine vielfältige Gruppe von prokaryotischen Mikroorganismen, die Cyanotoxine in der aquatischen Umwelt produzieren. Bei diesen Biotoxinen kann es sich um Hepatotoxine, Dermatoxine oder Neurotoxine handeln, die Fische und Säugetiere befallen können. In hohen Konzentrationen sind diese Verbindungen tödlich. Auf nicht-letaler Ebene wirken sie heimtückisch und beeinträchtigen die Funktionen der Immunzellen. Zu den von Algen produzierten Biotoxinen gehören Microcystin und Anatoxin A. Wassertiere können auch Material aufnehmen, das mit Botulinum-Neurotoxin E (BoNT/E) kontaminiert ist, das von Clostridium botulinum produziert wird, was ebenfalls zum Tod oder zu einer verminderten Immunfunktion führt. Mit Hilfe von Zebrafischen kann untersucht werden, wie Toxine die Funktionen von Immunzellen beeinflussen. In diesen Studien können Toxinexpositionen in vivo oder in vitro durchgeführt werden. In vivo-Studien wird der Zebrafisch dem Toxin ausgesetzt, und dann werden die Zellen isoliert. Diese Methode zeigt, wie das Gewebemilieu die Leukozytenfunktion beeinflussen kann. In den In-vitro-Studien werden die Zellen zunächst isoliert und dann in Kulturvertiefungen dem Toxin ausgesetzt. Die Leukozyten werden durch Nierenmarkextraktion gewonnen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation. Wie Leukozyten Krankheitserreger internalisieren, wird durch endozytäre Mechanismen bestimmt. Durchflusszytometrische Phagozytose-Assays zeigen, ob die endozytären Mechanismen durch die Toxinexposition verändert wurden. Studien mit isolierten Leukozyten, um festzustellen, wie Toxine Immundysfunktionen verursachen, fehlen. Die in diesem Artikel beschriebenen Verfahren ermöglichen es Laboratorien, Zebrafische zu verwenden, um die Mechanismen zu untersuchen, die beeinflusst werden, wenn ein Umweltgift die endozytären Funktionen von Immunzellen verringert.

Einleitung

Es gibt viele Arten von Biotoxinen und Immunsuppressiva. Algenblüten, die bakterielle Giftstoffe enthalten, treten in Binnengewässern auf und können auch als Biofilme auftreten¹. Cyanobakterien (Blaualgen) kommen natürlicherweise in allen Süßwasserökosystemen vor. Cyanobakterienblüten haben in Süßwassersystemen erheblich zugenommen². Zu bestimmten Zeiten können die Cyanobakterien Giftstoffe produzieren, die für Wasser- und Landtiere schädlich sind. Diese Toxine können die Leber, die Haut und die Schleimhäute und/oder das Nervensystem angreifen. Zwei Verbindungen, die von Cyanobakterien produziert werden, sind Microcystin und Anatoxin A. Microcystin ist ein zyklisches Heptapeptid³. Anatoxin A ist ein Alkaloid⁴. Botulinum-Neurotoxin E (BoNT/E) ist ein weiteres Toxin, das in aquatischen Systemen vorkommt. Es wird von Clostridium botulinum produziert und kann von Wassertieren aufgenommen werden⁵.

Die Exposition gegenüber Umweltgiften wirkt sich auf Fische aus und kann auch die Tiergesundheit beeinträchtigen und das Auftreten von Krankheiten erhöhen⁶. Das Verständnis, wie sich diese Toxine auf Immunzellen auswirken, ist von grundlegender Bedeutung für die Bestimmung der Risiken, die mit der Exposition gegenüber diesen Substanzen verbunden sind. Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um die Auswirkungen von Umweltgiften auf Immunzellen zu untersuchen⁷. Die Entwicklung einer Methode, die Durchflusszytometrie und Zebrafisch-Leukozyten nutzt, ist von großem Nutzen. Zebrafische haben eine physiologische Relevanz für den Menschen, und diese Methode kann auf ein breites Spektrum von Forschungsbereichen angewendet werden, von der grundlegenden Toxikologie und Immunologie bis hin zur Wirkstoffforschung und Entwicklungsbiologie. Da es sich bei Zebrafischen um Wasserorganismen handelt, eignen sie sich besonders gut, um die Auswirkungen von Umweltgiften im Wasser zu untersuchen⁷. Die Verwendung von Zebrafischen ist kostengünstiger als bei anderen Wirbeltiermodellen, und ihre Verwendung wirft weniger ethische Bedenken auf.

Weiße Blutkörperchen oder Leukozyten sind die erste Verteidigungslinie der Zellen gegen krankheitserregende Organismen. Endozytose ist der Prozess, bei dem eine Zelle eine Flüssigkeit oder ein Partikel aufnimmt oder internalisiert, das sich außerhalb der Zelle befindet. Dies wird dadurch erreicht, dass die Zelle die Verbindung in einem Vesikel⁸ einschließt. Leukozyten nutzen diesen Prozess als ersten Schritt, um Krankheitserreger abzutöten und eine Abwehr gegen Krankheiten vorzubereiten. Die Phagozytose ist eine Form der Endozytose und war eine der ersten Methoden, mit der die Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf die Gesundheit der Fische untersucht wurden⁹. Das Petrie-Hanson-Labor hat Methoden entwickelt, bei denen Zebrafisch-Leukozyten verwendet werden, um Biotoxine auf ihre potenzielle Fähigkeit zu untersuchen, die endozytären und phagozytären Funktionen von Leukozyten zu beeinträchtigen und die Immunabwehr zu beeinflussen. Die Arten der Endozytose, die in diesen Methoden enthalten sind, sind Pinozytose, Phagozytose, Kalziumabhängige Rezeptor-vermittelte Phagozytose und Mannoserezeptor-vermittelte Phagozytose. Methoden der Durchflusszytometrie mit Zebrafischen wurden erstmals im Petrie-Hanson-Labor⁹ beschrieben und werden routinemäßig zur Untersuchung von aquatischen Toxinen und Krankheitserregern eingesetzt. Rag1^-/- mutierte Zebrafische besitzen keine T- und B-Zellen¹⁰ und können zur gezielten Untersuchung von Zellmechanismen des angeborenen Immunsystems herangezogen werden.

Die Durchflusszytometrie ist laserbasiert und kann zur Bestimmung der physikalischen Eigenschaften von Zellen verwendet werden. Der Vorwärtspunkt- oder FSC-Wert wird auf der X-Achse dargestellt und stellt die Größe der Zelle dar. Die Seitenstreuung (SSC) wird auf der Y-Achse aufgetragen und stellt die zytoplasmatische Granularität der Zelle dar. Das resultierende Diagramm zeigt Populationen von Zellen mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften, die gruppiert sind, wobei die verschiedenen Zelltypen an verschiedenen Positionen in einem Streudiagramm angezeigt werden. Diese Populationen können ihre Position im Streudiagramm ändern, wenn sich die physikalischen Eigenschaften der Zellen ändern⁹. Die Verwendung dieser Technik mit Zebrafisch-Leukozyten ermöglicht es den Forschern, Veränderungen in Zellpopulationen als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich Umweltgifte, zu beurteilen.

Das Durchflusszytometer ist mehrdimensional, und bei der Auswertung können mehrere Arten von Fluorophoren verwendet werden, um die Zellen und ihre Aktivität weiter zu charakterisieren. In den in diesem Protokoll beschriebenen Assays wird die Endozytose durch Messung der Menge an fluoreszierendem Material charakterisiert, die eine Zelle internalisiert hat. Ob und wie sich die Toxinexposition auf endozytäre Mechanismen auswirkt, kann durch einen Vergleich der Fähigkeit von toxinexponierten Zellen, das Material aufzunehmen, mit der Fähigkeit von nicht toxinexponierten Zellen mittels Durchflusszytometrie verglichen werden. Zu den endozytären Prozessen, die auf diese Weise ausgewertet werden können, gehören die Pinozytose, die Rezeptor-vermittelte Endozytose und die Phagozytose.

Pinozytose ist die Aufnahme löslicher Bestandteile und verwendet keine Zellrezeptoren. Die Aufnahme beinhaltet die zytoplasmatische Umlagerung durch Mikrofilamente und Mikrotubuli zur Bildung kleiner Vakuolen. Luciferase Yellow (LY) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der zur Messung der Flüssigkeitsaufnahme durch nicht-selektive Pinozytose verwendet wird¹¹. Die Rezeptor-vermittelte Endozytose beinhaltet die selektive Aufnahme großer Moleküle. Zur Bewertung dieses Prozesses kann Fluorescein (FITC)-markiertes Dextran (DX) 40 verwendet werden. Phagozytose ist eine Form der Endozytose, bei der Partikel mit einer Größe von mehr als 0,5 Mikrometern aufgenommen werden. Dieser Prozess wird durch Verfahren mit FITC-DX70 und FITC-Eschericia coli untersucht. DX40 und DX70 haben Molekulargewichte von 40.000 bzw. 70.000. FITC-E. coli ist der Standard-Laborstamm von E. coli , der an ein Fluor gebunden ist, das mit dem Durchflusszytometer gemessen werden kann. Viele Formen der Rezeptor-vermittelten Endozytose benötigen Calcium als Signalmolekül und für die Umlagerung des Zytoskeletts⁹. Eine andere Art der Rezeptor-vermittelten Endozytose ist die Mannoserezeptor (MR)-vermittelte Endozytose. Mannose-Rezeptoren sind Transmembranproteine, die Formen von Mannan auf mikrobiellen Zelloberflächen erkennen⁹. Um diese Verfahren zu optimieren, sollte mit jedem Toxin eine Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt werden, um die zu verwendenden Dosen festzulegen. Für LY, FITC-DX40, FITC-DX70 und FITC-E. coli sollte eine Sättigungskurve durchgeführt werden, um die richtige Konzentration zu bestimmen.

Die Mechanismen, mit denen Leukozyten verschiedene Partikel internalisieren, können variieren. Um festzustellen, welche Komponente des Prozesses durch die Toxinexposition beeinflusst werden kann, können Inhibitoren hinzugefügt werden, um die phagozytären Mechanismen zu blockieren. Cytochalasin D (CCD) hemmt die Bewegung der Mikrotubuli und damit die Pinozytose. CCD hat keinen Einfluss auf die Rezeptor-vermittelte Endozytose¹¹. EDTA blockiert die Calcium (Ca2⁺)-abhängige Rezeptor-vermittelte Endozytose. Mannan ist ein natürlicher Ligand für die MRT. Mannan wird als Mannoserezeptor-Inhibitor verwendet, um zu beurteilen, ob Phagozytose oder Pinozytose Mannose-Rezeptor-vermittelt ist⁹.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Verfahren zur Bestimmung zu demonstrieren, ob die Toxinexposition die Fähigkeit phagozytärer Leukozyten, Krankheitserreger aufzunehmen, beeinflusst hat. Diese Protokolle können auch erkennen, ob ein bestimmter endozytärer Mechanismus betroffen ist. Die Durchführung dieser Assays auf dem Durchflusszytometer ermöglicht eine weitere Unterscheidung durch Auswahl von Leukozytenpopulationen basierend auf Größe und zytoplasmatischer Granularität, um festzustellen, ob Leukozyten-Subpopulationen unterschiedlich beeinflusst wurden. Diese Methode beruht auf dem elektronischen Gating von Zellpopulationen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Mississippi State University Institutional Animal Care and Use Committee (MSU-IACUC) genehmigt. Alle in dieser Studie verwendeten Zebrafische wurden aus einer homozygoten Kolonie von rag1^-/- mutierten Zebrafischen gezüchtet, die zuvor in der spezifischen pathogenfreien Brutstätte des College of Veterinary Medicine der Mississippi State University (MSU)¹⁰ etabliert worden waren. In dieser Brutstätte wurden auch Wildtyp-Zebrafische vermehrt. In diesen Studien können Toxinexpositionen in vivo oder in vitro durchgeführt werden. In vivo-Studien wird der Zebrafisch dem Toxin ausgesetzt, woraufhin die Leukozyten isoliert werden, was darauf hinweist, wie das Toxin und die Mikroumgebung des Gewebes interagieren und die Leukozytenfunktion beeinflussen können. In den In-vitro-Studien werden die Leukozyten isoliert und die Zellen dann in Kulturvertiefungen dem Toxin ausgesetzt.

1. Vorbereitung des Reagenzes und der Lösung

1. FACS-Puffer (Fluorescent Activated Cells Sorting): (Hanks Balanced Salt Solution ohne Calcium oder Magnesium (HBSS) + 0,05 % Rinderserumalbumin (BSA)) (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie diese vor der Zellisolierung frisch zu.
2. Gewebekulturmedien (TCM): Verwenden Sie RPMI-1640, ergänzt mit Glutamax und 10 % fötalem Rinderserum (siehe Materialtabelle).
3. Cytochalasin D (CCD): Bereiten Sie die Stammlösung vor, indem Sie das im Handel erhältliche Produkt (siehe Materialtabelle) in 1 ml absolutem Ethanol mit 200 % resuspendieren. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie 20 μl CCD zu 980 μl FACS-Puffer hinzufügen, um die Endkonzentration von 2,5 μg/ml zu erhalten.
4. EDTA: Die Stammlösung beträgt 1 mg/ml. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie 100 μl der Stammlösung zu 900 μl FACS-Puffer hinzufügen, um die Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
5. Mannan: Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mg/ml vor (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie als Nächstes die Arbeitslösung vor, indem Sie 100 μl der Stammlösung zu 900 μl FACS-Puffer hinzufügen, um die Endkonzentration von 500 μg/ml zu erhalten.
6. Lucifer Yellow (10 μg/ml) (LY, ein Fluoreszenzfarbstoff), Dextran-40 (DX-40, 500 μg/ml) und Dextran-70 (DX-70, 500 μg/ml) werden separat hergestellt, indem jeweils eine 1 mg/ml-Lösung hergestellt wird, indem die handelsüblichen Reagenzien (siehe Materialtabelle) in sterilem Wasser resuspendiert werden.
7. Fluorescein (FITC)-Bakterien: Züchten Sie Escherichia coli DH5α (siehe Materialtabelle) durch Schütteln in 100 mL Luria Bertani (LB) Medien, ergänzt mit 50 μg/mL FITC, über Nacht bei 37 °C in einer lichtgeschützten Umgebung, um eine optische Dichte (OD) von 0,8 bei 540 nm zu erhalten.
   1. Bakterien (3x) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, durch Zentrifugation für 10 min bei 1000 x g und anschließendes Erhitzen bei 60 °C für 20 min. Noch 1 Mal waschen, dann die Bakterienkonzentration auf OD₅₄₀ 0,8 einstellen. Dies wird die Standardlösung sein.
   2. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung im Verhältnis 1:100 verdünnen (1 ml Stamm: 99 mL FACS-Puffer). Stellen Sie die Endkonzentration auf 1,8 x 10⁸ Zellen/ml ein.

2. Pflege des Zebrafisches

1. Halten Sie den Zebrafisch in einem einzigen Durchflusssystem mit entchlortem kommunalem Wasser und füttern Sie proteinreiches Fischmehl und lebende Artemia bis zur Sättigung.
2. Im Alter von 6 Monaten nehmen Sie gemischtgeschlechtliche Zebrafische aus ihren Becken und transportieren Sie sie zum Forschungslabor, um sie für das Experiment zu verwenden. Dies ist das beste Alter für die Isolierung einer optimalen Anzahl von Leukozyten aus dem Nierenmark⁹.

3. Isolierung der Zellen

1. 10 Zebrafische werden in Tricain (~100 ml, 4 mg/ml, phosphatgepuffertes Tricain, Methansulfonat/Liter Fischwasser) (siehe Materialtabelle) nach etablierten Methoden eingeschläfert⁹.
2. Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
3. Das Nierenmarkgewebe⁹ wird entnommen und in ein C-Röhrchen mit 3 mL Gewebekulturmedium gegeben und das Gewebe mit einem Gewebedissoziator homogenisiert. Dies ist das bevorzugte Verfahren.
4. Alternativ können Sie das Gewebe mit dem Gummiende einer 3-ml-Spritze in einem Zellsieb aufbrechen. Nachdem das Gewebe homogenisiert (oder aufgebrochen) wurde, gießen Sie die Suspension durch ein 40-μm-Zellsieb, das auf ein konisches 50-ml-Röhrchen gelegt wird.
5. Die filtrierte Suspension wird bei 500 x g 5 min bei 16 °C zentrifugiert. Den Überstand abgießen. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml TCM. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
6. Schichten Sie die Zellen vorsichtig auf 3 mL sterilfiltriertes Medium mit Dichtegradient (1,077 g/ml) bei Raumtemperatur.
7. Anschließend bei 800 x g für 20 min bei 16 °C zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Bremse auf der niedrigsten Stufe befindet, damit die Zellen beim Stillstand der Zentrifuge nicht wieder aufgehängt werden.
8. Entfernen Sie die undurchsichtige Buffy-Schicht von der Schnittstelle zu einem 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
9. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 5 mL TCM hinzufügen und mit einer Pasteurpipette mischen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 16 °C.
10. Wiederholen Sie den Schritt, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in TCM, um etwa 1 x 10⁶ Zellen/ml zu erhalten.

4. Assay zur Zellviabilität

1. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen, bewerten Sie den Zelltod mit Hilfe der Propidiumiodid (PI)-Färbung.
   1. Fügen Sie PI (200 μg/ml) in einer Konzentration von 5 μl/ml der zu analysierenden Zellen hinzu. Lesen Sie auf dem Kanal PE/Texas Red.
      HINWEIS: Propidiumiodid diffundiert durch die Löcher in den Membranen abgestorbener Zellen und färbt sie dadurch. Die evaluierte Lebensviabilität lag in der vorliegenden Studie bei 85%.

5. Inkubation von Toxinen

1. Aliquotieren Sie 200 μl Zellen aus der isolierten Zellsuspension in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte (3 Wells für die Kontrolle und 3 Wells für die Toxinexposition). Auf diese Weise können Replikate in dreifacher Ausfertigung ausgeführt werden.
2. Geben Sie 2 mL TCM in jede Vertiefung.
3. Geben Sie Toxin (~2,5 μg/ml) in die drei Vertiefungen.
   HINWEIS: Die Toxinkonzentration sollte vor Beginn des Experiments optimiert werden und hängt von dem für den Assay verwendeten Toxin ab.
4. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatte für die gewünschte Expositionszeit. Die gewünschte Expositionszeit sollte vor Beginn des Experiments optimiert werden und hängt von dem für den Assay verwendeten Toxin ab. In der vorliegenden Studie betrug die Expositionszeit ~1 h.
5. Legen Sie die Gewebekulturplatte nach der Expositionszeit 10 Minuten lang auf Eis.
6. Pipettieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung auf und ab und achten Sie darauf, anhaftende Zellen von der Platte zu entfernen.
7. Nehmen Sie die Zellen aus der Platte in ein 14-ml-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden.
8. Die Zellen bei 300 x g für 5 min bei 16 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml FACS-Puffer. Wiederholen Sie den Schritt zweimal.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 1,5 ml FACS-Puffer.
   HINWEIS: Für die In-vivo-Studien setzen Sie den Zebrafisch dem Toxin aus (in einer ähnlichen Konzentration wie oben erwähnt) und isolieren Sie dann die Zellen.

6. Endozytose-Test

1. Aliquotieren Sie 100 μl Zellen auf 5 mL Durchflusszytometrie-Röhrchen. Die Röhrchen werden wie folgt mit vier Replikatröhrchen aus jeder Vertiefung markiert: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Fluoreszenzfarbstoff wie in Schritt 1.6 und Schritt 1.7 angegeben in die entsprechenden Röhrchen geben: 50 μl LY in das Röhrchen (1), 50 μl DX40 in das Röhrchen (2); 50 μL DX70 auf Röhrchen (3); 50 μl FITC-E. coli in das Röhrchen (4).
3. 1 h inkubieren. Geben Sie 200 μl FACS-Puffer in jedes Röhrchen.
4. Die Zellen werden bei 400 x g für 5 min bei 16 °C zentrifugiert. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Führen Sie die durchflusszytometrische Analyse durch.

7. Durchflusszytometrie

1. Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Zellpopulationen zu visualisieren und Daten zu sammeln. Weitere Informationen finden Sie in Hohn et ^al.9 .
2. Identifizieren Sie im ersten Schritt die Zielzellpopulationen. Verwenden Sie die Seitenstreuung (SSC) (in der Regel die vertikale Achse), um Ablagerungen und kleine, pyknotische Zellen auf der linken Seite zu entfernen, und die Vorwärtsstreuung (FSC) (in der Regel die horizontale Achse), um die gleichen Ablagerungen am unteren Rand der Fläche zu entfernen.
3. Eliminieren Sie die Dublett-Reads (doppelt gezählte Zellen). Dies geschieht unter Verwendung eines Pulsgeometrie-Gates (FSC-H x FSC-A).
4. Bestimmen Sie das Hintergrundsignal. Führen Sie nur die Zellen zur Fluoreszenzkontrolle und eine Isotyp-Fluoreszenzkontrolle für jedes verwendete Fluorochrom durch, um die Hintergrundfluoreszenzwerte zu identifizieren.
   HINWEIS: Jedes Fluorochrom hat seine eigene einzigartige Hintergrundfluoreszenz, die durch die Autofluoreszenz der Zellen und die unspezifische Bindung beeinflusst wird. Dabei wird zwischen echten positiven Signalen und Hintergrundfluoreszenz unterschieden. Bei der Identifizierung und dem Gating von Zellpopulationen auf der Grundlage der Fluoreszenz werden diese Kontrollwerte von der Anzahl der positiven Ereignisse subtrahiert, und die resultierende Zahl ist die Zahl, die für die Analyse verwendet wird.
5. Führen Sie die Stichproben durch und identifizieren Sie die Zellpopulationen, die kontrolliert werden sollen. Verwenden Sie FSC und SSC, um verschiedene Zellpopulationen innerhalb einer Zellmischung morphologisch zu charakterisieren und zu identifizieren.
   HINWEIS: FSC hängt in erster Linie mit der Größe der Zelle zusammen. Größere Zellen streuen mehr Licht in Vorwärtsrichtung, was zu höheren FSC-Werten führt, während kleinere Zellen weniger Licht streuen und niedrigere FSC-Werte aufweisen. Unterschiedlich große Zellen werden in Clustern gruppiert. Zum Beispiel können Lymphozyten, die kleiner sind, als separater Cluster mit niedrigeren FSC-Werten im Vergleich zu Granulozyten erscheinen. SSC hängt mit der Granularität, Komplexität und internen Struktur der Zelle zusammen. Zellen mit einer höheren zytoplasmatischen Granularität haben höhere SSC-Werte. Ähnliche Zellen gruppieren sich. Zum Beispiel haben Neutrophile zytoplasmatische Granula und clustern mit einem höheren SSC-Wert als Lymphozyten.
6. Führen Sie alle Proben durch und wenden Sie auf der Grundlage von FSC/SSC Gates auf Zellpopulationen an, die weiter analysiert werden sollen. Gated Areas werden basierend auf der Zelldichte und den interessierenden Populationen angewendet.
7. Zeichnen Sie Gated Areas in Histogrammen auf, um die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von FITC in jedem Gate für die Fluoreszenz bei 495 nm / 519 nm mit dem blauen Laser zu analysieren.
8. Exportieren Sie die von der Software ermittelte Zellenanzahl, um sie im Analyseprogramm zu übertreffen.
9. Analysieren Sie die Daten in einer Statistiksoftware (siehe Materialtabelle).
10. Vergleichen Sie die MFI jeder Population von Kontrollzellen mit der MFI von Zellpopulationen, die Toxinen ausgesetzt waren.

8. Wirkung des Toxins auf die endozytären Mechanismen und Wirkung der Inhibitoren CCD, EDTA und Mannan auf die endozytären Mechanismen

HINWEIS: Um Flüssigkeiten oder Partikel aufzunehmen, bewegt sich das Zytoplasma der Zelle aktiv. Diese Bewegung erfordert mehrere Strukturelemente und Signalwege. Biotoxine können jedes dieser Elemente oder Wege beeinflussen. Der Vergleich der Wirkungen spezifischer charakterisierter Inhibitoren kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie das Biotoxin wirken könnte¹¹.

1. Führen Sie Zellisolierungen durch, wie in Schritt 3 beschrieben.
2. Aliquotieren Sie 100 μl Zellen in 5 ml-Durchflusszytometrieröhrchen (mit vier Replikatröhrchen aus jeder Vertiefung).
   HINWEIS: Röhrchen wie folgt markieren: (5) CCD + LY (CCD hemmt die Pinozytose durch Hemmung der Umlagerung von Mikrofilamenten und Mikrotubuli; LY wird verwendet, um die Flüssigkeitsaufnahme durch Mikropinozytose zu beurteilen)⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA blockiert die Ca2⁺ -abhängige Rezeptor-vermittelte Phagozytose und Mikropinozytose; die Messung, ob die Aufnahme einen Kalzium-abhängigen Mechanismus beinhaltet). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Mannan + DX40 (Mannan hemmt die spezifische Aufnahme durch den Mannoserezeptor und misst die MR-abhängige Endozytose⁹). (10) Mannan + DX70. (11) Mannan + FITC-E. coli.
3. Inhibitoren hinzufügen: 1 μl CCD in das Röhrchen (5); 10 μl EDTA auf Röhrchen (6-8); 100 μl Mannan auf Röhrchen (9-11). Befolgen Sie die in Schritt 1 genannten Konzentrationen. 5 Min. inkubieren.
4. Fluoreszenz-Sekundärleuchtstoffröhren in die entsprechenden Röhrchen geben: 50 μl LY in die Röhrchen (1) und (5); 50 μl DX40 in das Röhrchen (2), (6) und (9); 50 μl DX70 in das Röhrchen (3), (7) und (10); 50 μl FITC-E. coli in das Röhrchen (4), (8) und (11). 30 min inkubieren.
5. Geben Sie 200 μl FACS-Puffer in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 400 x g bei 16 °C für 5 min.
6. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer. Wiederholen Sie die Schritte 8.5-8.6 zweimal.
7. Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer nach Schritt 7 durch.

Ergebnisse

Endozytose-Assays verwenden gemischte Leukozyten, die aus Gradienten isoliert und für Phagozyten und Lymphozyten gesperrt wurden, um festzustellen, ob bestimmte zelluläre Mechanismen durch die Toxinexposition verändert wurden. Zunächst werden Zellen basierend auf Größe und Granularität¹⁰ abgegrenzt. Tote, fragmentierte oder sterbende Zellen werden in der unteren linken Ecke des Streudiagramms visualisiert und eliminiert, nicht auf Phagozytose analysiert. Das Phagozyten-Gate umfasst Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Granulozyten, während das Lymphozyten-Gate Lymphozyten, phagozytäre B-Zellen und unspezifische zytotoxische Zellen (NCCs) umfasst (Abbildung 1).

Die Phagozytose wird durch die Aufnahme von FITC-markierten Partikeln bestimmt, wie durch das Ablesen der Fluoreszenz bei 495 nm / 519 nm mit dem blauen Laser gezeigt wird. Hintergrund-Autofluoreszenz und unspezifische Bindungsfluoreszenz werden eliminiert, indem die von den Kontrollzellen und der Isotypkontrolle emittierte mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) berücksichtigt wird. Für jeden Inhibitor sollte eine Dosis-Wirkungs-Kurve durchgeführt werden, um die zu verwendenden Konzentrationen zu bestimmen. Wenn die Ergebnisse der Durchflusszytometrie von Zellen, die dem zu testenden Toxin ausgesetzt waren, mit denen von Zellen übereinstimmen, die einem Inhibitor ausgesetzt waren, dann verursacht das Toxin eine ähnliche Wirkung und hemmt möglicherweise diesen endozytären Mechanismus. Wenn die Reaktionen des Toxins und des Inhibitors additiv sind, deutet dies darauf hin, dass das Toxin die Endozytose durch einen anderen Mechanismus als der Inhibitor hemmt.

Es werden Vergleiche zwischen nicht behandelten Zellen und Zellen, die mit dem zu testenden Toxin behandelt wurden (Abbildung 2), Zellen, die mit Toxin oder Inhibitor behandelt wurden (Abbildung 3A) und Zellen, die nur mit dem Inhibitor behandelt wurden (Abbildung 3B). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass Zellen, die mit Microcystin behandelt wurden, ähnlich wie Zellen, die mit CCD behandelt wurden, gehemmt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Microcystin die Flüssigkeitsaufnahme durch Mikropinozytose hemmt. Gated Cells werden mittels unidirektionaler ANOVA analysiert, und die Ergebnisse sollten als mittlere Anzahl von Zellen angegeben werden, die positiv für FITC sind.

Abbildung 1: Repräsentatives Durchflusszytometrie-Streudiagramm von Leukozyten, die aus Wildtyp-Zebrafisch-Nierengewebe isoliert wurden, basierend auf den Merkmalen der Vorwärtsstreuung (FSC) und der Seitenstreuung (SSC). Das Fresszellentor umfasst Makrophagen/Monozyten und Granulozyten (23% der Gated Cells. Das Lymphozyten-Gate umfasst Lymphozyten, phagozytäre B-Zellen und unspezifische zytotoxische Zellen (NCCs) (26% der Gated Cells). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von phagozytären Zellen in Abbildung 1 nach Exposition gegenüber Toxinen. Die Röhre (1) zeigt ungefärbte Zellen, während die Zellen in der Röhre (2) durch die Aufnahme von LY Fluoreszenz emittieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von Phagozyten in Abbildung 1. Aufnahme von Luzifergelb (LY) ohne Vorhandensein von Cytochalasin D (CCD)-Hemmer (A); Aufnahme von LY in Gegenwart von CCD. Röhrchen (1) zeigt ungefärbte Zellen, während Zellen in Röhrchen (2) durch die Aufnahme von LY Fluoreszenz emittieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Überblick über die Schritte des Protokolls. *Die Dauer und das Ausmaß, in dem die Fische einem Biotoxin ausgesetzt sind, variieren je nach verwendetem Biotoxin und den Vorschriften und Protokollen der Tierpflege und der Biosicherheit verschiedener Institutionen. **Die gewünschte Konzentration und die verwendete Expositionszeit sollten vor dem Versuch optimiert werden und hängen vom verwendeten Toxin ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Anwendung der Durchflusszytometrie mit Zebrafisch-Leukozyten bietet einen leistungsstarken und vielseitigen Ansatz, um das Immunsystem im Detail zu untersuchen, die Auswirkungen von Umweltgiften zu bewerten und die toxikologische Forschung zu erleichtern. Es bietet eine Möglichkeit, die Auswirkungen von Toxinen auf Immunzellen und die Immunantwort schnell und effektiv zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen humorale Faktoren auf und deuten darauf hin, wie die Physiologie und der Stoffwechsel der Fische mit Biotoxinen aus der Umwelt interagieren. Die Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 4 dargestellt.

Diese Methoden haben jedoch Einschränkungen. Die Vorbereitung von Zebrafisch-Leukozyten für die Durchflusszytometrie kann im Vergleich zu anderen Modellen komplexer sein. Die geringe Größe des Zebrafisches kann die Blutmenge und die Anzahl der für die Analyse verfügbaren Leukozyten begrenzen ^9,10. Diese Verfahren erfordern die Disssoziation von Geweben, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, und die Zellviabilität kann die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen. Im Vergleich zu Modellen wie Mäusen ist die Palette der verfügbaren immunologischen Werkzeuge, wie z. B. Antikörper, die für Zebrafisch-Zellmarker spezifisch sind, für Zebrafische begrenzter. Diese Einschränkung kann die Analysetiefe einschränken, die an Zebrafisch-Leukozyten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus erfordert die Interpretation von Durchflusszytometrie-Daten Fachwissen, insbesondere wenn es sich um komplexe Immunantworten handelt. Die Fehlinterpretation von Daten kann zu falschen Schlussfolgerungen führen, insbesondere im Zusammenhang mit den Auswirkungen von Umweltgiften.

Die Ergebnisse von Zellproben ohne Zugabe von Inhibitoren können mit Zellproben mit den Inhibitoren verglichen werden. Die Ergebnisse von Zellproben, denen das Toxin zugesetzt wurde, sollten mit Zellproben mit den Inhibitoren verglichen werden. Wenn die Umlagerung des Zytoskeletts betroffen ist, kommt es zu einer begrenzten LY-Aufnahme. Wenn das Toxin die Aufnahme von DX-40 oder DX-70 hemmt, werden unterschiedliche Partikelgrößen nicht phagozytiert. Wenn die Zellen die FITC-E. coli nicht aufnehmen, dann hat das Toxin die Phagozytose gehemmt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Zebrafische ein hervorragendes Modell sind, um die Auswirkungen von Umweltgiften auf Immunzellen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der Durchflusszytometrie und Zebrafisch-Leukozyten zum Screening von Biotoxinen verwendet werden, mit besonderem Schwerpunkt auf Endozytose- und Phagozytoseprozessen¹¹. Ziel dieser Studie ist es, herauszufinden, ob die Toxinexposition die Fähigkeit phagozytärer Leukozyten beeinflusst, Krankheitserreger aufzunehmen und mögliche Auswirkungen auf spezifische endozytäre Mechanismen zu erkennen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% fötales Rinderserum	Gibco	A3160501
14 mL Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden	BD Biosciences	352059
40 µ m Zell-Siebe	Corning	07-201-430
5 mL Durchflusszytometrie-Röhrchen	BD Biosciences	352235
50 mL konisches Zentrifugenröhrchen	Corning	14-959-49A
Absolutes Ethanol	Fisher	BP2818-500
Automatisierter Zellzähler	Life Technologies Countess II FL		zur Untersuchung der Zellviabilität
Rind Serumalbumin (BSA)	Sigma	A3059
Cytochalasin D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dextran 40	Sigma	FD40-100MG
Dextran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5α (oder ein anderer Laborbakterienstamm)	New England Biolabs	C29871
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma	ED4SS
Software für die Durchflussanalyse	Novoacea Software
Durchflusszytometer	Novocyte 3000
Fluorescein	Fluka BioChemica	46950
Stränge ausgewogene Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer	Yellow	Sigma L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P3813
RPMI-1640 mit GlutaMax	Gibco	61870036
Statistiksoftware	SPSS
Toxin
Tricain	Western Chemical Inc	NC0342409