Methodenartikel

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

DOI:

10.3791/64499

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3. Februar 2023

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1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

Zusammenfassung

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Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die aus Gewebe gewonnen werden, können den funktionellen Status der Quellzellen und die Eigenschaften des interstitiellen Raums des Gewebes widerspiegeln. Die effiziente Anreicherung dieser sEVs ist eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion und ein Schlüssel für die Entwicklung klinischer Nachweistechniken und therapeutischer Trägertechnologien. Es ist schwierig, sEVs aus Gewebe zu isolieren, da sie in der Regel stark kontaminiert sind. Diese Studie liefert eine Methode zur schnellen Anreicherung von hochwertigen sEVs aus Leberkrebsgewebe. Das Verfahren umfasst einen vierstufigen Prozess: die Inkubation von Verdauungsenzymen (Kollagenase D und DNase Ι) mit Gewebe, die Filtration durch ein 70-μm-Zellsieb, die differentielle Ultrazentrifugation und die Filtration durch einen 0,22-μm-Membranfilter. Aufgrund der Optimierung des differentiellen Ultrazentrifugationsschritts und der Hinzufügung eines Filtrationsschritts ist die Reinheit der mit diesem Verfahren erhaltenen sEVs höher als diejenige, die durch die klassische differentielle Ultrazentrifugation erreicht wird. Es liefert eine wichtige Methodik und unterstützende Daten für die Untersuchung von aus Gewebe gewonnenen sEVs.

Einleitung

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Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) haben einen Durchmesser von etwa 30 nm bis 150 nm und werden von verschiedenen Zellensezerniert 1. Sie können mit Gewebezellen kommunizieren und die lokale oder entfernte Mikroumgebung regulieren, indem sie wichtige biologische Moleküle wie Lipide, Proteine, DNA und RNA zu verschiedenen Organen, Geweben, Zellen und intrazellulären Teilen transportieren. Somit können sie auch das Verhalten von Empfängerzellen 2,3 verändern. Die Isolierung und Aufreinigung spezifischer sEVs ist eine wesentliche Voraussetzung, um ihr biologisches Verhalten während der E....

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Protokoll

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Menschliches Leberkrebsgewebe wurde von Patienten gesammelt, bei denen im First Affiliated Hospital der Gannan Medical University eine maligne Lebererkrankung diagnostiziert wurde. Alle Patienten unterschrieben eine Einverständniserklärung, und die Entnahme von menschlichen Gewebeproben wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Gannan Medical University genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereitung

  1. Stellen Sie den Transferentfärbungsschüttler in den Inkubator und stell....

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Ergebnisse

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sEVs aus menschlichem Leberkrebsgewebe haben eine entscheidende Rolle bei der Diagnose, Behandlung und Prognose von Patienten mit Leberkrebs gespielt. Bei dieser Methode wurden gängige Laborinstrumente verwendet, um sEVs aus Leberkrebsgewebe zu isolieren und zu reinigen. Dies kann eine methodische Unterstützung für die Untersuchung von sEVs bieten. Abbildung 2 veranschaulicht den allgemeinen Prozess der Anreicherung von sEVs aus Leberkrebsgewebe. sEVs in den Interzellularräumen von Geweben w.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt eine wiederholbare Methode zur Extraktion von sEVs aus Leberkrebsgewebe. Hochwertige sEVs werden durch scharfe Gewebeisolierung, Behandlung mit Verdauungsenzymen, differentielle Ultrazentrifugation und 0,22-μm-Filtermembranfiltration und -reinigung erhalten. Für die nachgeschaltete Analyse ist es äußerst wichtig, die hohe Reinheit der sEVs sicherzustellen. Bei der differentiellen Zentrifugation erscheint eine Schicht weißer Substanzen (unbekannte Zusammensetzung) auf der Oberfläche des Übersta.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem First Affiliated Hospital der Gannan Medical University für die Unterstützung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Fördernummern 82260422).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m MembranfiltereinheitMillexSLGPR33RB 1 mL
Sterile SpritzeHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2 % UranylacetatElektronenmikroskopie Sciences22400-2
4,7 mL ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter361621
6-Well-ZellkulturplatteLABSELECT11110
50 mL BecherTianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales CompanyCF2100800
70 µ m ZellsiebBiosharpBS-70-XBS
100 mm ZellkulturschaleCELL TERCS016-0128
600 µ L ZentrifugenröhrchenAxygenMCT060C
Thermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini Trans-BlotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 AntikörperAbcamab134045
CD9 AntikörperAbcamab263019
Zentrifuge 5430REppendorf5428HQ527333
ReinigungslösungNanoFCMC1801
Kollagenase DRoche11088866001
KupfernetzHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
TrockenthermostatHangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti Human CD9 AntikörperElabscienceE-AB-F1086C
Glycin SolarbioG8200
Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelter sekundärer Anti-Maus-AntikörperProteintechSA00001-1
Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelter sekundärer Anti-Kaninchen-AntikörperProteintechSA00001-2
MethanolShanghai Zhenxing Chemical Company
Nanopartikel-DurchflusszytometerNanoFCM INCFNAN30E20112368
Phosphatase-Inhibitoren (PhosSTOP)Roche4906845001
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)ServicebioG4202
Polyvinyliden-Difluorid-MembranSolarbioISEQ00010
QC BeadsNanoFCMQS2502
RPMI-1640 BasismediumBiologische Industrie 
SkalpellGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
Siliziumdioxid-NanokugelnNanoFCMS16M-Exo
Übertragungsentfärbungsschüttler TS-8Kylin-BellE0018
TransmissionselektronenmikroskopThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101 AntikörperProteintech28283-1-AP
PinzetteGuangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X
BCA-Proteinquantifizierungskit C11875500BT

Referenzen

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  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods ....

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Schlagwörter

Vesikelanreicherungdifferenzielle UltrazentrifugationMembranfiltrationenzymatischer AufschlussDurchflusszytometrieTransmissionselektronenmikroskopieProteinmarkerWestern Blot

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