Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.

Abstract

Pluripotente Stammzellen können komplexe Gewebeorganoide erzeugen, die für In-vitro-Studien zur Modellierung von Krankheiten und für die Entwicklung regenerativer Therapien nützlich sind. Dieses Protokoll beschreibt eine einfachere, robuste und schrittweise Methode zur Erzeugung retinaler Organoide in einem hybriden Kultursystem, das aus adhärenten Monolayerkulturen besteht, während der ersten 4 Wochen der Netzhautdifferenzierung bis zum Auftreten von ausgeprägten, selbstorganisierten Augenfeld-Primordialclustern (EFPs). Darüber hinaus werden die Donut-förmigen, kreisförmigen und transluzenten neuro-retinalen Inseln innerhalb jedes EFP manuell gepflückt und unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturschalen in einem retinalen Differenzierungsmedium für 1-2 Wochen kultiviert, um mehrschichtige 3D-Optikschalen (OC-1M) zu erzeugen. Diese unreifen retinalen Organoide enthalten PAX6+ und ChX10⁺ proliferierende, multipotente retinale Vorläufer. Die Vorläuferzellen sind innerhalb der Organoide linear selbstorganisiert und erscheinen als ausgeprägte radiale Streifen. 4 Wochen nach der Suspensionskultur durchlaufen die retinalen Vorläuferzellen einen postmitotischen Arrest und eine Abstammungsdifferenzierung, um reife retinale Organoide (OC-2M) zu bilden. Die Vorläufer der Photorezeptorlinie entwickeln sich in den äußersten Schichten der retinalen Organoide. Diese CRX+- und RCVRN⁺-Photorezeptorzellen reifen morphologisch heran und zeigen innere segmentartige Fortsätze. Diese Methode kann zur Erzeugung retinaler Organoide unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) eingesetzt werden. Alle Schritte und Verfahren werden klar erklärt und demonstriert, um die Replizierbarkeit zu gewährleisten und für breitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und translationalen Forschung zu sorgen.

Introduction

Die Netzhaut ist ein lichtempfindliches Gewebe im hinteren Teil des Wirbeltierauges, das Lichtsignale durch ein biochemisches Phänomen, das als Phototransduktionsweg bekannt ist, in Nervenimpulse umwandelt. Die anfänglichen Nervenimpulse, die in den Photorezeptorzellen der Netzhaut erzeugt werden, werden an andere retinale Interneuronen und retinale Ganglienzellen (RGCs) weitergeleitet und erreichen den visuellen Kortex des Gehirns, was bei der Bildwahrnehmung und der visuellen Reaktion hilft.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind schätzungsweise 1,5 Millionen Kinder blind, davon 1 Million in Asien. Die erbliche Netzhautdy....

Protocol

Alle Experimente mit hiPS-Zellen wurden aseptisch, unter Einhaltung der Standardlaborpraktiken, ethischen und biologischen Sicherheitsrichtlinien und mit den Genehmigungen von Aufsichtsbehörden wie dem Institutional Ethics Committee (IEC), dem Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) und dem Institutional Bio-Safety Committee (IBSC) durchgeführt.

1. Präparation der iPSC-Kultur und des retinalen Differenzierungsmediums und der Reagenzien

1. iPSC-Kultur und Erhaltungsmedium
   1. Kultivieren und erhalten Sie die normale hiPSC-Linie²³ (hiPSC-F2-3F1) und eine CRISPR-editierte, RB1-....

Results

Die Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenlinien wird erreicht, indem die Zellen in verschiedenen Cocktails von Nährmedien, die Nahrungsergänzungsmittel und Wachstumsfaktoren enthalten, in aufeinanderfolgenden Schritten zu verschiedenen Zeitpunkten kultiviert werden, wie in Abbildung 1 beschrieben. Die hiPSC-Kulturen werden in Essential 8 Medium, dem pluripotenten Stammzellerhaltungsmedium, gehalten. Sobald sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben (Abbildung.......

Discussion

hiPS-Zellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Entwicklung von Organen und Geweben in vitro zu untersuchen. Die Rekapitulation des Krankheitsphänotyps durch die Unterscheidung gesunder und krankheitsspezifischer hiPS-Zellen gegenüber der Netzhautlinie kann dazu beitragen, neuere Einblicke in die Pathophysiologie verschiedener Formen vererbter Netzhautdystrophien zu gewinnen. Für die in vitro Differenzierung von PSCs in retinale Zelltypen wurden mehrere Protokolle beschrieben und angewendet. Die .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter	TPP	99722
15 mL Zentrifugenröhrchen	TPP	91015
50 mL Zentrifugenröhrchen	TPP	91050
6 Well Platten	TPP	92006
Anti-Chx10 Antikörper; Monoklonaler	Santa Cruz	SC365519	einer Verdünnung von 1:50
; Kaninchen monoklonal	Abcam	ab140603	:300 Verdünnung
Anti-MiTF Antikörper, Maus monoklonal	Abcam	ab3201	1:250 Verdünnung
Anti-Recoverin Antikörper; Kaninchen polyklonal	Millipore	AB5585	1:300 Verdünnung
B-27 Supplement (50x), serumfrei	Thermo	Fisher 17504044
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Zentrifuge 5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-qualifiziertes	Matrix Corning
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement (Basalmedium)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA Polymerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 Medium	Kit Thermo Fisher	A1517001
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon Nicht TC-behandelt behandelte Petrischale, 60 mm	Corning	351007
Fetal  Rind  Serum, qualifiziert, USA	Gibco	26140079
GelDocXR+ mit der Image-Laborsoftware	BIO-RAD		Agarose Gel Dokumentationssystem
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Ziege Anti-Maus IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1:300 Verdünnung
Ziege Anti-Maus IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 Verdünnung
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	1:300 Verdünnung
Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:300 Verdünnung
HistoCore MULTICUT	Leica		Zum Schneiden
KnockOut Serum Ersatz	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbinsäure	Sigma Aldrich	A92902
MEM Lösung nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 Ergänzung (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		Zur Quantifizierung
RNA-Paraformaldehyd-Qualitäten		23995
Pasteur-Pipetten, 9 Zoll, unsteril, nicht eingesteckt	Corning	7095D-9
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140-122
Rekombinanter Anti-Otx2-Antikörper, Kaninchen monoklonaler	Abcam	ab183951	:300 Verdünnung
Rekombinanter Anti-PAX6-Antikörper; Monoklonales	Kaninchen-Abcam	ab195045	:300 Verdünnung
Rekombinanter Anti-RPE65-Antikörper, Monoklonales	Kaninchen-Abcam	ab231782	:300 Verdünnung
Rekombinantes humanes Noggin-Protein	R& D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Serologische Pipetten 10 mL	TPP	94010
Serologische Pipetten 5 mL	TPP	94005
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	S7653
Natriumcitrat Tribasisches Dihydrat	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost ( silanbeschichtete) mikroskopische Objektträger	Knittel
SuperScript III Erststrangsynthesesystem	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III Erststrangsynthesesystem für RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol  Reagenz	Invitrogen	15596026
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratorien	H-1200
Vitronectin	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 Dihydrochlorid (Rho-Kinase-Inhibitor)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Konfokales Mikroskop