Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Veredelung von Keimlingen, die keine Vorkenntnisse oder Schulungen erfordert und mit sehr geringen Kosten unter Verwendung von Materialien durchgeführt werden kann, die in den meisten molekularbiologischen Labors leicht zugänglich sind.
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Methodenartikel
Skalierbare, flexible und kostengünstige Keimlingsveredelung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Veredelung von Sämlingen im Frühstadium ist zu einem beliebten Werkzeug in der Molekulargenetik geworden, um Wurzel-Spross-Beziehungen innerhalb von Pflanzen zu untersuchen. Die Veredelung von Sämlingen der kleinen Modellpflanze Arabidopsis thaliana im Frühstadium ist aufgrund der Größe und Zerbrechlichkeit ihrer Sämlinge technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Eine wachsende Sammlung von veröffentlichten Methoden beschreibt diese Technik mit unterschiedlichen Erfolgsraten, Schwierigkeitsgraden und damit verbundenen Kosten. In diesem Artikel wird ein einfaches Verfahren beschrieben, um ein internes wiederverwendbares Pfropfgerät unter Verwendung einer Silikonelastomermischung herzustellen, und wie dieses Gerät zum Pfropfen von Sämlingen verwendet wird. Zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung kostet die Herstellung jedes wiederverwendbaren Pfropfgeräts nur 0,47 US-Dollar an Verbrauchsmaterialien. Mit dieser Methode können Anfänger ihre ersten erfolgreich gepfropften Sämlinge in weniger als 3 Wochen von Anfang bis Ende erhalten. Dieses leicht zugängliche Verfahren wird es Labors für Pflanzenmolekulargenetik ermöglichen, die Keimlingsveredelung als normalen Teil ihres experimentellen Prozesses zu etablieren. Aufgrund der vollen Kontrolle, die die Benutzer bei der Erstellung und Gestaltung dieser Pfropfvorrichtungen haben, kann diese Technik auf Wunsch leicht für den Einsatz in größeren Pflanzen wie Tomaten oder Tabak angepasst werden.
Einleitung
Das Pfropfen ist eine alte Gartenbautechnik, die um 500 v. Chr. zu einer etablierten landwirtschaftlichen Praxis wurde1. Das Pfropfen verschiedener Sorten von Kulturpflanzen zur Verbesserung der Erträge war die erste Anwendung dieser Technik und wird auch heute noch zu diesem Zweck eingesetzt. In den letzten zehn Jahren hat die Veredelung als Werkzeug für Molekularbiologen zur Untersuchung von Fernsignalen in Pflanzen zunehmend Aufmerksamkeit erregt 2,3,4,5. Während das Pfropfen erwachsener Pflanzen relativ einfach ist, ist das Pfropfen von Pflanzen kurz nach der Keimung eine Herausforderung. Trotzdem ist es manchmal erforderlich, die Auswirkungen von Fernsignalen auf Prozesse wie Pflanzenentwicklung, Umweltreaktionen und Blüte zu bewerten 6,7,8.
Arabidopsis thaliana hat sich aus vielen Gründen als Modellorganismus in der Pflanzenbiologie etabliert, unter anderem wegen seiner relativ geringen Größe, die es einfach macht, ihn in einem Labor zu züchten. Die geringe Größe und Zerbrechlichkeit von Arabidopsis-Sämlingen macht das Pfropfen junger Sämlinge jedoch sehr schwierig. In vielen Fällen ist ein umfangreiches praktisches Training erforderlich, um erfolgreich Sämlingstransplantate zu erhalten. Im Laufe der Jahre gab es viele methodische Verbesserungen, die ideale Wachstumsbedingungen und neue Techniken zur Erhöhung der Erfolgsrate der Sämlingsveredelung identifizierthaben 9,10,11. Das zuletzt eingeführte Werkzeug war ein Arabidopsis-Sämlings-Pfropfchip, der es auch unerfahrenen Anwendern ermöglicht, ein akzeptables Maß an Pfropferfolg zu erzielen12. Während dieser Fortschritt die technische Barriere der Keimlingsveredelung erheblich gesenkt hat, ist die Chip-Vorrichtung teuer, und die Anzahl der Transplantate, die parallel durchgeführt werden können, wird schnell unerschwinglich.
Darüber hinaus kann dieses Gerät nur für Arabidopsis-Sämlinge verwendet werden, deren Hypokotylabmessungen denen von Wildtyp-Sämlingen ähneln. Während Arabidopsis die Schlüsselart in der Welt der pflanzlichen Molekulargenetik ist, wurden neuere Arbeiten bei anderen Arten unter Verwendung der Sämlingspfropfung durchgeführt. Beispiele hierfür sind die Veredelung von Sojabohnen und der gemeinen Bohne, Tabak zu Tomaten und Raps zu Arabidopsis und die anschließende Probenahme beider Gewebe auf kleine RNAs13,14. Daher ist eine Pfropfmethode, die für die meisten Laboratorien zugänglich ist und ohne größere technische Änderungen leicht an eine Vielzahl von Pflanzenarten angepasst werden kann, sehr wünschenswert.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine einfache Pfropfvorrichtung im eigenen Haus hergestellt wird, die die vollständige Anpassung des Durchmessers und der Länge des Pfropfkanals ermöglicht, um die Morphologie der Sämlinge bei den meisten Pflanzenarten zu berücksichtigen. Die Herstellung dieser Geräte ist sehr kostengünstig und hochgradig skalierbar, da die einzigen Komponenten, die benötigt werden, Silikonelastomer, Kabel oder Schläuche der richtigen Größe, eine hochpräzise Klinge und ein Behälter sind, der als Form dient. Nach dem hier beschriebenen Pfropfprotokoll können Anwender erfolgreiche Pfropfraten von 45% (n = 105) erreichen, vergleichbar mit den zuvor berichteten Pfropfergebnissen10,12.
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Protokoll
1. Vorbereitung des Geräts
- Stellen Sie die Silikonpfropfvorrichtung her, indem Sie die Silikonelastomerlösung in eine quadratische Petrischale (100 mm x 100 mm) gießen. Bereiten Sie 15 ml der Elastomerlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
HINWEIS: Silikonelastomer-Kits enthalten typischerweise eine Flüssigkeit auf Silikonbasis und ein Härtungsmittel, die beim Mischen das Silikon verfestigen lassen. - Bereiten Sie die quadratische Petrischale vor, indem Sie vier gerade Stücke 29-g-Draht in die quadratische Petrischale legen, die gleich weit voneinander entfernt sind (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass der Draht bündig mit dem Boden der Form abschließt. Um den Draht vollständig zu begradigen, rollen Sie ihn auf einer harten, gleichmäßigen Oberfläche mit einem schweren und flachen Gegenstand (z. B. einem Metallrohrgestell).
HINWEIS: Kabelbinder enthalten oft 29 G Draht und können nach dem Entfernen der äußeren Papierbeschichtung mit Aceton verwendet werden. - Gießen Sie die gemischte Silikonelastomerlösung auf die Drähte und bedecken Sie sie mit der Oberseite der Petrischale. Lassen Sie das Silikon 24-48 h bei Raumtemperatur aushärten.
- Entfernen Sie die Silikonfolie mit einer sauberen Pinzette aus der Petrischale und bewegen Sie sie auf eine saubere, ebene Fläche.
- Entfernen Sie die Drähte von der Silikonfolie. Entfernen Sie die dünne Silikonschicht, die auf der Außenseite des Kanals verbleibt, mit einer Zange, damit der Kanal auf einer Seite offen ist (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie die Silikonfolie senkrecht zu den Kanälen mit einer sauberen Schere in 3 mm dicke Streifen. Legen Sie jeden Streifen in einen Aluminiumfolienumschlag und verschließen Sie ihn mit Autoklavenband.
- Autoklavieren Sie die Streifen mindestens 30 Minuten lang bei 121 °C und lagern Sie sie bis zur Verwendung.
2. Vorbereitung des Sämlings
- Samen sterilisieren und vernalisieren.
- Suspendieren Sie bis zu 100 Arabidopsis-Samen in 1 ml 50%iger Bleichlösung, die 0,1% Tween 20 enthält, in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 5-10 Minuten lang. Entfernen Sie die Bleichlösung durch Pipettieren oder Aspirieren unter sterilen Bedingungen. Spülen Sie die Samen mit 1 ml sterilisiertem dH2O. Achten Sie darauf, die Röhrchen umzudrehen, um die Samen ausreichend zu spülen, und entfernen Sie alle Bleichlösung, die oben im Röhrchen verbleibt. Wiederholen Sie das Spülen 4x.
- Lassen Sie ca. 0,25 ml Wasser in den Röhrchen mit den Samen und lagern Sie sie 3 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln.
- Tellern Sie die Samen in Vorbereitung auf das Pfropfen.
- Bereiten Sie eine 1%ige Agar-MS-Platte wie folgt vor: Mischen Sie für 1 l MS (0,5% Saccharose) festes Medium 4,4 g MS-Salz, 5 g Saccharose und 10 g Agar in 800 ml Wasser, stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,7 ein und bringen Sie dann das Gesamtvolumen mit zusätzlichem Wasser auf 1 l. Autoklavieren Sie mindestens 20 Minuten, bevor Sie ~25 ml in die quadratischen Petrischalen gießen.
- Bewegen Sie unter sterilen Bedingungen die entsprechende Anzahl der vorbereiteten Samen auf den Teller, wobei Sie eine 20-μl-Pipettenspitze verwenden, um die Samen abzusaugen und zu übertragen.
- Legen Sie einen sterilen Streifen auf die Plattenoberfläche, um die Samenpositionierung zu steuern, sodass die Samen mit den Kanälen auf dem Streifen ausgerichtet sind. Entfernen Sie den Streifen, sobald die Samen plattiert sind.
HINWEIS: Eine quadratische Platte mit den Maßen 100 mm x 100 mm kann zwei Reihen von Sämlingen aufnehmen (Abbildung 1B). - Sobald die Platten aufstehen, lassen Sie die Flüssigkeit aus dem festen Medium verdampfen und sammeln Sie sich am Boden der Platte. Nachdem die Samen auf den Teller gelegt wurden, legen Sie den Tellerdeckel auf und versiegeln Sie eine Seite des Tellers, die parallel zu den beiden Samenreihen verläuft (gekennzeichnet durch den blau hervorgehobenen Bereich in Abbildung 1B), mit Parafilm. Wickeln Sie atmungsaktives Klebeband auf den Parafilm und um alle anderen Kanten der Platte.
- Stellen Sie zwei Platten vorsichtig mit der mit Parafilm versiegelten Seite nach unten auf. Trennen Sie die beiden Platten an der Unterseite, indem Sie ein horizontales 15-ml-Zentrifugenröhrchen dazwischen legen und mit einem Gummiband sichern. Stellen Sie sicher, dass die Plattenoberflächen einen Winkel von 100°-110° zur Tischoberfläche bilden (Abbildung 1C).
- Lagern Sie die Platten in dieser Ausrichtung für 72 h in völliger Dunkelheit bei 21 °C, damit die Hypokotyle des Keimlings ~5 mm lang werden können. Entfernen Sie die Platten nach 72 h aus der Dunkelheit und wachsen Sie vor dem Pfropfen unter 16 h Licht (Intensität von 100 μE m-2 sec-1) und 8 h Dunkelzyklen für weitere 2-4 Tage bei der gleichen Temperatur.
- Pfropfen Sie die Sämlinge zwischen 5 und 7 Tagen nach dem Anplattieren. Legen Sie einen Pfropfstreifen über die Sämlinge und passen Sie ihre Hypokotyle in die Kanäle an. Positionieren Sie den Sämling vorsichtig so, dass der Wurzel-Hypokotyl-Übergang am unteren Rand des Silikonstreifens positioniert ist, um den Sämling für den Schnitt vorzubereiten (Abbildung 1D).
3. Pfropfverfahren
- Bereiten Sie eine sterile Arbeitsumgebung vor, indem Sie ein Dissektionsrohr mit 70% Ethanol desinfizieren und zwei Paar Pinzetten mit feiner Spitze und einen Skalpellgriff autoklavieren. Führen Sie alle Pfropfvorgänge in einer sterilen Haube und bei Bedarf mit Hilfe eines Dissektionszielfernrohrs durch. Führen Sie den größten Teil der Transplantation mit einer 10,5-fachen Vergrößerung durch.
- Bereiten Sie die Sprossen vor. Verwenden Sie eine frische Skalpellklinge, um das Hypokotyl senkrecht zu schneiden, um einen geraden, sauberen Schnitt zu erzielen. Schieben Sie die Klinge nach vorne, anstatt sie nach unten in die Pflanze zu drücken, um zu verhindern, dass der Sämling in den Agar gedrückt wird (Video 1).
- Entfernen Sie den Trieb. Achten Sie darauf, den geschnittenen Teil des Triebs mit Feuchtigkeit zu versorgen, indem Sie den Kontakt mit der Medienoberfläche sicherstellen. Alternativ können Sie den Spross bis zur Verwendung in einen dafür vorgesehenen Haltebereich bringen, z. B. auf die Oberseite einer mit sterilemdH 2O gefüllten Petrischale.
- Bereiten Sie die Wurzelstöcke vor. Ziehen Sie vorsichtig an der Wurzel, indem Sie die Wurzel in dem Raum zwischen den geschlossenen Pinzetten fangen und drehen, wobei der geschnittene Abschnitt der Wurzelstöcke in der Mitte des Streifens verbleibt (Video 2).
HINWEIS: Die zerbrechliche Wurzel wird beschädigt, wenn sie direkt zwischen die geschlossene Pinzette gedrückt wird, so dass die Wurzel im scharfen Winkel der Pinzettenenden eingeklemmt werden muss, um das Gewebe zu manipulieren. - Nehmen Sie den gewünschten Trieb vorsichtig mit der Pinzette mit feiner Spitze auf und führen Sie ihn in die Oberseite des Kanals ein.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Kontakt zwischen den Sprossen und den Wurzelstöcken visuell zu bestätigen, um ein erfolgreiches Transplantat zu erhalten (Video 3). - Nachdem alle Transplantate hergestellt wurden, wickeln Sie die Platten mit Parafilm und atmungsaktivem Klebeband ein und stellen Sie die Platten wie zuvor auf, ohne die Sämlinge oder Silikonstreifen zu stören. Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine auf 26 °C eingestellte Wachstumskammer mit 16 h hellen/8 h dunklen Zyklen.
- Bewerten Sie die gepfropften Sämlinge nach 7-10 Tagen unter sterilen Bedingungen. Entfernen Sie den Silikonstreifen vorsichtig mit einer Pinzette, indem Sie eine Seite abziehen, damit die Kanäle die Sämlinge befreien können. Entfernen Sie alle zufälligen Wurzeln, die aus dem Spross wachsen, indem Sie sie mit einer frischen Skalpellklinge vom Spross abschneiden oder mit einer Pinzette mit feiner Spitze zerdrücken. Beurteilen Sie visuell, ob der Wurzelstock fest mit dem Spross verbunden ist, um ein erfolgreiches Transplantat zu bilden (Abbildung 2).
- Bewegen Sie erfolgreiche Transplantate in den Vermehrungsboden der Sämlinge, um so lange wie nötig zu wachsen. Decken Sie den Boden einige Tage lang mit transparentem Kunststoff ab, während sich die Sämlinge etablieren. Nachdem Sie die Pflanzen in den Boden gebracht haben, wachsen Sie unter den zuvor erwähnten Hell- und Dunkelzyklen bei 21 ° C.
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Ergebnisse
Verschiedene Aspekte des Designs des Pfropfstreifens wurden getestet, um die optimalen Pfropfbedingungen zu ermitteln, die das geringste Maß an technischem Geschick erforderten (Tabelle 1). Alle Pfropfversuche wurden mit 0,5% Saccharose-MS-Medium durchgeführt, von dem zuvor berichtet wurde, dass es sich um ein ideales Pfropfmediumhandelt 11,12.
Ein optimales Sämlingswachstum kann mit der Keimung auf dem Streife...
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Diskussion
Zusammenfassung und Bedeutung
Die Bildung einer Transplantatvereinigung ist entscheidend für eine erfolgreiche Pfropfung, die einen direkten und ungestörten Kontakt zwischen Wurzelstock und Spross erfordert. Die Miniaturgröße und Zerbrechlichkeit von Sämlingen kleiner Pflanzen wie Arabidopsis macht es technisch schwierig, diese Anforderung zu erfüllen. Eine Technik, die in frühen Arabidopsis-Sämlingspfropfmethoden entwickelt wurde, bestand darin, sowohl den Spross als auch den Wurzelstock in ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Vielen Dank an Javier Brumos für die Erstausbildung und Anleitung bei der Veredelung von Arabidopsis-Sämlingen .
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15 mL konische Röhrchen | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS-zertifiziertes Lösungsmittel) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silikonverkapselung klar 0,5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Saccharose (Molekularbiologie), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Mikrozentrifuge Flex-Tube Röhrchen (1,5 mL), Packung mit 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Skalpellgriff | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand bleifreies Autoklavenband | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand quadratische Petrischalen | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereomikroskop | Mikroskop Zentral | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige und Skoog Basal | Medium | Sigma M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| Kaliumhydroxid | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-Earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Chirurgisches Design Nr. 22 Carbon Skalpellklinge | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Pinzette DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
