Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.
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Methodenartikel
Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Skelettmuskulatur beherbergt verschiedene Populationen adulter Stammzellen, die zur Homöostase und Reparatur des Gewebes beitragen. Skelettmuskelstammzellen (MuSCs) haben die Fähigkeit, neue Muskeln zu bilden, während fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) zum stromalen Stützgewebe beitragen und die Fähigkeit haben, Fibroblasten und Adipozyten zu bilden. Sowohl MuSCs als auch FAPs befinden sich in einem Zustand des verlängerten reversiblen Zellzyklusaustritts, der als Ruhezustand bezeichnet wird. Der Ruhezustand ist der Schlüssel zu ihrer Funktion. Ruhende Stammzellen werden üblicherweise aus mehreren Muskelgeweben gereinigt, die in einer einzigen Probe zusammengefasst sind. Neuere Studien haben jedoch deutliche Unterschiede in den molekularen Profilen und der Ruhetiefe von MuSCs gezeigt, die aus verschiedenen Muskeln isoliert wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Untersuchung von MuSCs und FAPs aus einzelnen Skelettmuskeln und stellt Strategien zur molekularen Analyse der Stammzellaktivierung vor. Es wird detailliert beschrieben, wie Muskeln unterschiedlichen Entwicklungsursprungs, Dicke und Funktionen isoliert und verdaut werden, wie z. B. Zwerchfell, Trizeps, Gracilis, Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GA), Soleus, Extensor digitorum longus (EDL) und die Massetermuskeln. MuSCs und FAPs werden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) aufgereinigt und mittels Immunfluoreszenzfärbung und 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Inkorporationsassay analysiert.
Einleitung
Die Skelettmuskulatur hat aufgrund des Vorhandenseins von Muskelstammzellen (MuSCs) eine hohe Regenerationsfähigkeit. MuSCs befinden sich auf den Myofasern unterhalb der Basallamina und befinden sich in einem Ruhezustand mit verlängertem, reversiblem Zellzyklusausgang 1,2,3,4. Bei einer Verletzung werden MuSCs aktiviert und treten in den Zellzyklus ein, um amplifizierende Vorläuferzellen entstehen zu lassen, die sich differenzieren und zu neuen Myofasern verschmelzen können 2,5. Früh....
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Protokoll
Das vorliegende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Tierpflegerichtlinien der Universität Aarhus und den örtlichen Ethikvorschriften durchgeführt.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Vorschriften der örtlichen Ethikkommission für Tierversuche und den Umgang mit postmortalen Nagetierproben einhalten. Mäuse sind eine potenzielle Quelle für Allergene; Falls vorhanden, schalten Sie die Abluft ein und platzieren Sie sie über dem Arbeitsbereich, um eine übermäßige Exposition gegenüber Allergenen zu vermeiden. Tragen Sie alternativ einen Mund-Nasen-Schutz, wenn das Experiment regelmäßig durchgeführt wird. Dieses Protokoll beinhaltet d....
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Ergebnisse
Nach dem Protokoll zur individuellen Skelettmuskelisolation (Abbildung 2) wurden die Gracilis-, TA-, EDL-, GA-, Soleus-, Trizeps-, Masseter- und Zwerchfellmuskeln aus drei männlichen Schweizer Mäusen isoliert, die aus einem lokalen Zuchtprogramm ausgezüchtet worden waren (Abbildung 2). Nach Gewebedissoziation und Antikörperfärbung wurden MuSCs und FAPs aus den einzelnen Muskeln mittels FACS aufgereinigt (Abbildung 3). Das anfänglich.......
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Diskussion
Mehrere Schritte sind bei der Ausführung dieses Protokolls entscheidend, um gute Erträge zu erzielen. Die einzelnen Muskeln haben ein kleines Volumen im Vergleich zu der Muskelmenge, die bei Bulk-Isolationsprotokollen verwendet wird. Dadurch besteht die Gefahr, dass der Muskel während der Dissektion austrocknet, was die Ausbeute verringert. Um dies zu verhindern, ist es wichtig, den Muskeln unmittelbar nach der Präparation Medium zuzuführen. Wenn die Präparation länger dauert, kann die Haut von einer Gliedmaße nach der a.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Zellsortierung wurde an der FACS Core Facility der Universität Aarhus, Dänemark, durchgeführt. Die Figuren wurden mit Biorender.com erstellt. Wir danken Dr. J. Farup für die Bereitstellung des Kaninchen-Anti-PDGFRa-Antikörpers. Diese Arbeit wurde durch einen AUFF Starting Grant an E.P. und Start Package Grants von NovoNordiskFonden an E.P. (0071113) und an A.D.M. (0071116) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Röhrchen (PCR performance getestet, PP, 30.000 xg, DNA/DNase-/RNase-frei, geringe DNA-Bindung, steril ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1,5 mL Röhrchen |
| 15 mL Röhrchen (PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-frei, Nicht zytotoxisch, pyrogenfrei, steril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL Röhrchen |
| 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS-Röhrchen ohne Siebdeckel |
| 5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe | Falcon, Fisher Scient | 352235 | FACS-Röhrchen mit Siebkappe |
| 5 mL Röhrchen (PP, unsteril autoklavierbar) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL Röhrchen |
| 50 mL Röhrchen( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-frei, nicht zytotoxisch, pyrogenfrei, steril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL Röhrchen |
| Alexa Fluor 555 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Los: 2387458 (Kat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 Esel-Anti-Maus IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Los: 2420713 (Kat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core Facility Universität Aarhus | |
| Zentrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Zentrifuge |
| Click-iT EdU Zellproliferationskit für die Bildgebung, Alexa Fluor 488 Farbstoff | Invitrogen, Thermo Fisher | Los: 2387287 (Kat# C10337) | Zellproliferationskit |
| Kollagen aus Kalbsleder | Bioreagenz, Sigma Aldbsp; | Quelle: SLCK6209 (Kat# C8919) | |
| Kollagenase Typ II | Worthington, Fisher Scientific | Los: 40H20248 (Kat# L5004177 ) | Kollagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Los: 2309415 (Kat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey Serum (unsteril) | Sigma Aldrich, Merck | Los: 2826455 (Kat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Gerade Pinzette mit feinen Spitzen |
| Dumont Nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Gebogene Pinzette |
| F-10 Nährstoffmischung (Schinken) (1x), +L-Glutamin | Gibco, Fisher Scientific | Los: 2453614 (Kat# 31550-023) | |
| FITC Anti-Maus CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Kat # 102506) | |
| FITC Anti-Maus CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Kat# 103108) | |
| Eisessig (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Katze # 1000631000) | |
| Kopf über Kopf Mini-Rohr-Rotator | Fisher Wissenschaftlich | 15534080 (Modell-Nr. 88861052) | Kopf über Kopf Mini-Röhren-Rotator |
| Pferdeserum | Gibco, Fisher Scientific | Los 2482639 (Kat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Schüttelwasserbad |
| MS2 Mini-Shaker | IKA | Vortex-Einheit | |
| Nadel 20 G (0,9 mm x 25 mm) | BD Mikrolanze, Fisher Scient | 304827 | 20G Nadel |
| Neutraler Formalinpuffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Los: 03822014 (Kat # HOU/1000.1002) | |
| Nicht-pyrogenes Zellsieb (40 & Mikro; M) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Zellsieb |
| Pacific Blue Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 Primärantikörper | DSHB | Los: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x Pulverkonzentrat | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 Anti-Maus CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM. A) (Kat # 105720) | |
| Kugelschreiber/Streptokokken | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (Kat# 11548876 ) | |
| Pipettenspitzen p10 | Art Spitzen, selbstklebende Barriere, Thermo Scientific | 2140-05 | Geringe Retention, vorsterilisiert, Filterspitzen |
| Pipettenspitzen p1000 | Art Spitzen, selbstklebende Barriere, Thermo Scientific | 2279-05 | Geringe Retention, vorsterilisiert, Filterspitzen |
| Pipettenspitzen p20 | Art Spitzen, selbstklebende Barriere, Thermo Scientific | 2149P-05 | Geringe Retention, vorsterilisiert, Filterspitzen |
| Pipettenspitzen p200 | Art Spitzen, selbstdichtende Barriere, Thermo Scientific | 2069-05 | Geringe Retention, vorsterilisiert, Filterspitzen |
| Schutzunterlage | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 Schichten |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipetten (P10, P20, P200, P1000) |
| Rekombinantes anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Skalpell (Schaft Nr. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Skalpell |
| Skalpellklinge Nr. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Skalpell |
| Scanlaf mars | Labogene | Schrank der Klasse 2: Mars | Flow Bank |
| ScanR | Olympus | Mikroskop, Core Facility Universität Aarhus | |
| Schere | FST | 14568-09 | |
| Serie 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Inkubator |
| Serologische Pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, pyrogenfreie |
| serologische Pipette 5 mL | VWR, Avantor geliefert von VWR | 612-3702 | Sterile, pyrogenfreie |
| Spritze 5 mL, Luer-Spitze (6%), steril | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Spritze |
| TC Schale 100, Standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petrischale |
| Mit Gewebekultur (TC) behandelte Oberfläche, schwarzes Polystyrol, flacher Boden, steril, Deckel, 20er-Pack | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-Well-Halbbodenplatte |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Quelle: SLCJ6163 (Kat # T8787) |
Referenzen
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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Nachdrucke und Genehmigungen
