Die Immunmarkierung abnormaler Prionproteine unter Verwendung immunhistochemischer Protokolle erfordert spezifische Methoden zur Herstellung von Proben- und Anti-PrP-Antikörpern. Das vorliegende Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Epitop-Demaskierung, um eine korrekte PrP-Immunmarkierung sicherzustellen und die unspezifische Hintergrundfärbung zu minimieren. Dieser Ansatz berücksichtigt auch Biosicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung immunhistochemischer Studien mit den Prionen-infizierten Geweben.
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Methodenartikel
Nachweis von abnormalem Prionprotein durch Immunhistochemie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Abnorme Prionproteine (PrPSc) sind die krankheitsassoziierte Isoform des zellulären Prionproteins und diagnostische Marker für transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE). Diese neurodegenerativen Erkrankungen betreffen Menschen und verschiedene Tierarten und umfassen Scrapie, zoonotische bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), chronische Auszehrungskrankheit von Hirschen (CWD) und die neu identifizierte Kamel-Prionen-Krankheit (CPD). Die Diagnose von TSE beruht auf dem Immunnachweis von PrPSc durch Anwendung sowohl der Immunhistochemie (IHC) als auch der westlichen Immunoblot-Methoden (WB) auf Enzephalongewebe, nämlich den Hirnstamm (Obex-Spiegel). IHC ist eine weit verbreitete Methode, die primäre Antikörper (monoklonal oder polyklonal) gegen Antigene von Interesse in Zellen eines Gewebeschnitts verwendet. Die Antikörper-Antigen-Bindung kann durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht werden, die in dem Bereich des Gewebes oder der Zelle, auf den der Antikörper gerichtet wurde, lokalisiert bleibt. Daher werden die immunhistochemischen Techniken bei Prionenerkrankungen, wie auch in anderen Forschungsgebieten, nicht nur zu diagnostischen Zwecken, sondern auch in Pathogenesestudien eingesetzt. Solche Studien beinhalten den Nachweis der PrPSc-Muster und -Typen aus den zuvor beschriebenen, um die neuen Prionenstämme zu identifizieren. Da BSE den Menschen infizieren kann, wird empfohlen, Einrichtungen und/oder Praktiken des Biosicherheitslabors der Stufe 3 (BSL-3) für den Umgang mit Rindern, kleinen Wiederkäuern und Hirschproben zu verwenden, die in die TSE-Überwachung einbezogen werden. Darüber hinaus werden nach Möglichkeit Containment- und Prionengeräte empfohlen, um die Kontamination zu begrenzen. Das PrPSc IHC-Verfahren besteht aus einem Ameisensäure-Epitop-Demaskierungsschritt, der auch als Prioneninaktivierungsmaßnahme fungiert, da formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe, die in dieser Technik verwendet werden, infektiös bleiben. Bei der Interpretation der Ergebnisse muss darauf geachtet werden, die unspezifische Immunmarkierung von der Zielmarkierung zu unterscheiden. Zu diesem Zweck ist es wichtig, Artefakte der Immunmarkierung zu erkennen, die bei bekannten TSE-negativen Kontrolltieren erhalten wurden, um diese von spezifischen PrP Sc-Immunmarkierungstypen zu unterscheiden, die zwischen TSE-Stämmen, Wirtsspezies und prnp-Genotyp variieren können, die hierin näher beschrieben werden.
Einleitung
Nach der Prionenhypothese ist die abnorme Isoform (PrPSc) die primäre oder einzige Komponente des Infektionserregers bei transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE). Die Bestätigung für die Diagnose von TSE beruht auf dem Immunnachweis von PrPSc durch Anwendung von immunhistochemischen (IHC) Protokollen und/oder westlichen Immunoblot-Methoden (WB) von Enzephalongeweben1.
IHC ist eine Methode, bei der monoklonale oder in einigen Fällen polyklonale Antikörper (als primäre Antikörper) als erster Schritt bei der Immunfärbung von spezifisch zielgerichteten Antigenen von Interesse, die sich in Zellen eines Gewebeschnitts befinden, verwendet werden. Jede effektive primäre Antikörper-Antigen-Bindung wird dann unter Verwendung von Sekundärantikörpern visualisiert, die für die primären Antikörper spezifisch sind. Diese sekundären Antikörper sind an Enzyme wie Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) konjugiert. Die Visualisierung wird dann erreicht, indem diesen Enzymen ein Substrat hinzugefügt wird, wodurch unlösliche Farbprodukte entstehen, die in Bereichen lokalisiert sind, in denen die primären Antikörper an die Zielantigene gebunden sind. Eine verbesserte Visualisierung kann durch Gegenfärbung erreicht werden, wobei ein Farbstoff verwendet wird, um einen Kontrast zwischen immunmarkiertem und nicht immunmarkiertem Gewebezu erzeugen 2.
Bei IHC unter Verwendung von formalinfixiertem Paraffingewebe (FFPE) kann die Formalinfixierung die Wirksamkeit von Primärantikörpern aufgrund der Vernetzung durch Formaldehyd und Erwärmung und Dehydratisierung während der Paraffineinbettung zunichte machen. Diese verändern die Konformation von Proteinen, zerstören, denaturieren oder maskieren die Epitope, wodurch ihre Erkennung verringert oder aufgehobenwird 3. Dies erfordert daher eine Antigen-Retrieval (AR). Die AR-Techniken stören die Vernetzung der Formaldehyd-verwandten chemischen Gruppen in den antigenen Molekülen und stellen so die ursprüngliche Antigen-Protein-Konformation wieder her oder entlarven sie. Dies führt zur Wiederherstellung der Antikörper-Antigen-Affinität (Epitop) für die Immunmarkierung. Die letztendliche Wirksamkeit von AR hängt von den Eigenschaften des Zielantigens und/oder des Primärantikörpers2 ab.
Die Hitze-induzierte Antigen (Epitop) Retrieval (HIER) ist ein Verfahren von AR3 und wird routinemäßig für den PrPSc IHC-Nachweis verwendet, wie hierin beschrieben. IHC ist essentiell für die Diagnose und wird in Forschungslabors verwendet, um die Gewebeverteilung eines pathologieassoziierten Antigens zu bestimmen. Es wird unter anderem häufig bei der Diagnose und Erforschung von Krebs, Neurowissenschaften und Infektionskrankheiten4 eingesetzt. Bei TSE spielt IHC eine wichtige Rolle in der Diagnose und Forschung zur Bestätigung und Untersuchung der PrPSc-Verteilung in natürlichen Wirten und experimentellen Modellen. IHC trägt zu Prionen-Pathogenese-Studien und zur Analyse von PrP-Sc-Ablagerungstypen und -mustern bei, insbesondere in neuralen Geweben5, um Abweichungen von routinemäßig beschriebenen Infektionen zu erkennen und mutmaßliche neue Prionenstämme zu identifizieren.
Da Prionen der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) den Menschen infizieren können, können bestimmte Laborprotokolle, die an der Arbeit mit BSE beteiligt sind, die Verwendung von BSL-3-Einrichtungen und -Praktiken erfordern6. Dazu gehört die Verwendung eines versiegelten Sekundärbehälters für den Transport potenziell BSE-infizierter Gewebeproben innerhalb des Instituts und des Labors. Dazu gehört auch die Ausweisung von Eindämmungsbereichen und Prionen-Spezialgeräten für die BSE-Forschung und -Analyse, wann immer dies möglich ist. Dies geschieht, um eine Kontamination außerhalb des Arbeitsbereichs zu verhindern und einen begrenzten Raum zu schaffen, da Dekontaminationsverfahren erforderlich werden.
Dementsprechend befolgt das Labor für Pathologie des INIAV die empfohlenen Einrichtungen und Praktiken der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) 6, um potenziell mit Prionen infizierte Gewebeproben von Rindern, kleinen Wiederkäuern und Hirschen im Zusammenhang mitder TSE-Überwachung zu verwalten.
Formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe, die in TSE-Diagnose- oder Forschungsverfahren enthalten sind, insbesondere im Zentralnervensystem, können potenziell infektiös sein. Daher müssen diese fixierten Gewebe vor der Gewebeverarbeitung mit Ameisensäure behandelt werden, um die Infektiosität von Prionen, falls vorhanden, zu verringern. Dies geschieht durch Einlegen von fixierten, beschnittenen Geweben (ca. 2-4 mm Dicke) in eine Verarbeitungskassette. Die Kassette wird dann in 98% Ameisensäure getaucht (für 1 h). Nach dem Eintauchen werden die Kassetten mit Taschentüchern 30 Minuten lang in fließendem Leitungswasser gewaschen und vor der weiteren Verarbeitung in das Fixiermittel zurückgeführt. Wenn Gewebeschnitte vor der Verarbeitung nicht behandelt werden, müssen postmikrotomische Gewebeschnitte vor der histologischen Färbung mindestens 5 Minuten lang in unverdünnte Ameisensäure getaucht werden7. Das IHC-Protokoll für PrPSc enthält einen routinemäßigen Ameisensäure-Epitop-Demaskierungsschritt, der auch zur Inaktivierung von Prionen7 dient. Nach diesen Prion-Inaktivierungsschritten kann das resultierende fixierte Gewebe dann an BSL-2 unter Verwendung von Standard-BSL-2-Praktiken verarbeitet werden.
Die Mindestanforderung an die Gewebeentnahme für die TSE-Diagnose bei jedem Tier, das in die TSE-Überwachung einbezogen wird, ist die Entnahme des Hirnstamms (auf obex-Ebene). Darüber hinaus wird empfohlen, zum Nachweis von atypischer BSE und Scrapie auch einen Teil des Kleinhirns zu sammeln 1,8. Für die CWD-Diagnose sollten sowohl Hirnstamm (Obex) als auch retropharyngeale Lymphknoten getestet werden, da PrP Sc in lymphatischen Geweben ohne nachweisbares PrPSc in Obex9 nachgewiesen werden konnte, überprüft von Machado et al.10.
Der obex-Teil des Hirnstamms umfasst diagnostische TSE-Zielstellen, nämlich den dorsalen Vaguskern (DVN), den solitären Traktkern (STN) und den spinalen Traktkern des Trigeminusnervs (V). In diesen Bereichen kommt es auch in den frühen Stadien von BSE und klassischer Scrapie durchweg zu einer bilateralen PrP-Sc-Akkumulation. In klinischen Fällen von fortgeschrittener TSE zeigen alle Bereiche der grauen Substanz innerhalb des Hirnstamms eine weit verbreitete PrPSc-Verteilung 11.
Vor dem Schneiden und Verarbeiten werden die Hirnproben ausgewertet (Abbildung 1), um den Grad der Autolyse und das Vorhandensein von Gewebeschäden zu ermitteln, die möglicherweise die Eignung der Probe für eine IHC-basierte Bestätigungsdiagnose beeinträchtigen8. Um die Integrität der präparativen Protokolle und der Analyseergebnisse zu validieren, werden die TSE-positiven und -negativen Gewebeproben als Kontrollen in Verbindung mit der Präparation von Geweben aus Testfällen in jeden Assay einbezogen.
Abbildung 1: Das PrPSc IHC-Verfahren. Darstellung des schrittweisen Ablaufs des PrPSc IHC-Verfahrens von der Entparaffinisierung von Gewebeschnitten bis zur eventuellen Immunfärbung und Detektion (FFPE - Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettet; Mab - monoklonaler Antikörper; DAB - 3,3' Diaminobenzidin). Diese Figur wurde BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Protokoll
Das hier beschriebene IHC-Verfahren ist Bestandteil des Forschungsprojekts FAIRJ-CT98-7021, "Aufbau eines europäischen Netzwerks zur Überwachung von Wiederkäuern TSE und Standardisierung und Harmonisierung des Verfahrens und der Kriterien zur Identifizierung von Verdachtsfällen". Es folgt den Diagnosekriterien, die von der Weltorganisation für Tiergesundheit (WOAH) (vormals Office International des Épizooties, OIE)1 und dem Europäischen Referenzlabor für TSE bei Tieren 8,11 festgelegt wurden. Das beschriebene IHC-Verfahren ist seit 2008 auch nach NPISOIEC17025 (Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien) akkreditiert. Eine solche Akkreditierung setzt ein qualitativ hochwertiges Managementsystem voraus, das Standardarbeitsanweisungen, qualifiziertes Personal, genau kalibrierte Geräte, strenge Kontrolle von Daten und Reagenzien, die Teilnahme an Ringversuchen zwischen Laboratorien, nicht konforme Arbeiten und Risikobewertungen umfasst, um die Wirksamkeit des Managementsystems zu erhöhen, bessere Ergebnisse zu erzielen und Laborgefahren zu vermeiden. Es wurden Prion-infizierte Gewebekontrollen mit BSE, klassischer Scrapie, atypischer Scrapie und CWD (formalinfixiert, paraffineingebettet, FFPE) aus verschiedenen Quellen gesammelt. Die Rinder- und Schafabschnitte stammen aus den Fällen, die im Rahmen eines TSE-Überwachungsprogramms für Tiere diagnostiziert wurden. Die CWD-Abschnitte stammen aus den Kontrollproben, die freundlicherweise von Professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) im Jahr 2003 zur Verfügung gestellt wurden, und aus dem CWD-Ringversuch 2008, der vom Europäischen Referenzlabor für TSE (APHA, Weybridge) organisiert wurde.
1. Gewebeschnitt und Objektträgervorbereitung
- Schneiden Sie Abschnitte von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Geweben mit einer Dicke von 3-5 μm mit einem Mikrotom.
- Schwimmabschnitte auf gereinigtem Wasser mit einer Temperatur von ca. 10 °C unter dem Schmelzpunkt des verwendeten Paraffins. Heben Sie die Schnitte aus dem Wasser auf speziell behandelte Objektträger (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Wasser gründlich von den Objektträgern ablaufen.
- Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 50 °C, um die Haftung des Objektträgers zu verbessern.
HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frisch geschnittene Gewebe für IHC-Protokolle vorzubereiten, obwohl TSE-Positiv- und Negativkontrollabschnitte im Voraus vorbereitet und gelagert werden können. Die Schritte 2 bis 4 müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
2. Entparaffinisierung und Rehydratisierung
- Legen Sie die Objektträger mit den Gewebeschnitten in einen Edelstahl-Färbekorb (siehe Materialtabelle). Tauchen Sie den Korb für 3 Minuten in ein Xylolbad (Edelstahl-Färbebehälter), nehmen Sie ihn heraus und tauchen Sie ihn erneut ein.
- Entfernen Sie Xylol und rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie 3 Minuten lang in ein absolutes Ethanolbad tauchen. Herausnehmen und erneut eintauchen.
- Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft und legen Sie sie 1 Minute lang in ein 90%iges Ethanolbad. Für eine weitere Minute in ein 70%iges Ethanolbad überführen, gefolgt von einer abschließenden Übergabe in ein 50%iges Ethanolbad für 1 min. Bewegen Sie den Objektträgerkorb bei jeder Ethanolbadbehandlung zweimal vorsichtig und entleeren Sie den Korb vor dem nächsten Transfer.
3. Epitop-Retrieval
- Tauchen Sie die Gewebeschnitte vorsichtig 30 Minuten lang in 98% ige Ameisensäure bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in Leitungswasser und spülen Sie sie anschließend zweimal in destilliertem Wasser ab.
ACHTUNG: Ameisensäure ist stark ätzend. Schutzbrille und Handschuhe müssen getragen werden. - Führen Sie den hitzeinduzierten Antigenabruf (HIER) durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
ANMERKUNG: Dieser Schritt wird durch hydratisiertes Autoklavieren bei 121 °C für 30 Minuten in einer bestimmten Druckkammer durchgeführt (siehe Materialtabelle).- Der Citratpuffer (10 mM, pH 6,1, siehe Materialtabelle) wird bei 98 °C für ca. 20 min in einem Edelstahl-Färbebehälter vorgewärmt, der sich in der mit 500 ml destilliertem Wasser gefüllten Druckkammer befindet.
ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie war der Programm-Sollwert 1 (SP1) für die spezifische verwendete Ausrüstung. - Nachdem der Alarm anzeigt, dass das Gerät die programmierte Zeit und Temperatur erreicht hat, tauchen Sie den Korb mit Objektträgern ein und starten Sie das Programm auf Sollwert 2 (121° C für 30 Minuten). Legen Sie zur Qualitätskontrolle einen Abschnitt des selbstklebenden Autoklaven-Anzeigebandes auf den Korb, um die Temperatur und den Druck zu überwachen, und zeichnen Sie den Anfangs- und Enddruck dieses Programms auf.
- Wenn die Anzahl der Objektträger, die immungefärbt werden sollen, die Kapazität des Korbs nicht erreicht, verwenden Sie saubere, leere Objektträger, um leere Positionen zu belegen. Lassen Sie die Kammer nach Beendigung des Programms passiv auf Umgebungsdruck zurückkehren (mindestens 30 min).
HINWEIS: Längere Zeiträume können unspezifische Hintergrundfärbungen reduzieren. - Übertragen Sie den Objektträgerkorb vorsichtig für 5 Minuten in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Edelstahlfärbebehälter.
- Der Citratpuffer (10 mM, pH 6,1, siehe Materialtabelle) wird bei 98 °C für ca. 20 min in einem Edelstahl-Färbebehälter vorgewärmt, der sich in der mit 500 ml destilliertem Wasser gefüllten Druckkammer befindet.
4. Inaktivierung der endogenen Peroxidase
- Der Objektträgerkorb mit den Probenabschnitten wird 30 min lang in ein Bad aus 3%igem Wasserstoffperoxid (H2O2) in Methanol getaucht. Spülen Sie die Abschnitte unter fließendem Wasser ab (5 min). Die Abschnitte abtropfen lassen und weitere 5 Minuten in 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) tauchen.
5. Immundetektion
ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurde die Immundetektion unter Verwendung des Kapillarspaltformats7 unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Objektträgerclip-Montagesystems durchgeführt (siehe Materialtabelle). Andere immunhistochemische Objektträgersysteme sind ebenfalls anwendbar.
- Legen Sie jeden Objektträger auf einen handelsüblichen Abdeckplattenhalter (siehe Materialtabelle), der mit TBS vorbefeuchtet ist, und vermeiden Sie Blasen, wobei die Gewebeseite dem Halter zugewandt ist und die Objektträgerkanten mit den beiden unteren Punkten des Halters übereinstimmen.
- Halten Sie die Objektträgerhalterbaugruppe zwischen Daumen und Zeigefinger, wobei ein Finger oben auf dem Objektträger und der andere auf der Unterseite des Objektträgers liegt. Platzieren Sie dann die Baugruppe in der Galerie des Systems.
- Um sicherzustellen, dass das Set gut montiert ist, füllen Sie die Vertiefung zwischen dem Objektträger und dem Halter mit TBS, das nicht sofort überlaufen darf. Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass ca. 80 μl TBS zwischen der Halterung und dem Objektträger zurückgehalten werden müssen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.
- Um die Hintergrundfärbung vor der Behandlung mit primärem Antikörper (Anti-PrP, siehe Materialtabelle) zu verringern, werden die Objektträger mit 20 % normalem Serum derselben Spezies wie der sekundäre Antikörperwirt, der für die Immunfärbung verwendet wird (im vorliegenden Fall Pferdeserum), 30 Minuten lang in TBS vorinkubiert.
- Tauen Sie die Anzahl der zu verwendenden Aliquote von Antikörpern entsprechend der zu analysierenden Tierart, die Anzahl der zu untersuchenden Probenabschnitte und die Menge der Arbeitsverdünnung auf.
HINWEIS: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie 10 % normales Serum derselben Spezies als Quelle für den Sekundärantikörper und die Primärantikörperlösungen verwenden. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollte die Wirtsquelle des normalen Serums und des sekundären Antikörpers nach Möglichkeit von derselben Spezies stammen. - Ohne die Schnitte zu waschen, tragen Sie die primäre Antikörperlösung direkt (200 μl) in jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets auf und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Füllen Sie zum Waschen die Vertiefungen der Objektträger-Sets mit TBS und warten Sie 5 min. Zweimal wiederholen.
- Verdünnen Sie den biotinylierten Sekundärantikörper (monoklonales Anti-Maus-Pferd Ab, siehe Materialtabelle) bei 1/200 in TBS mit 10% Pferdeserum. Bereiten Sie das erforderliche Volumen in Abhängigkeit von der Anzahl der zu behandelnden Abschnitte vor.
- Tragen Sie die sekundäre Antikörperlösung (200 μl) auf jede Vertiefung des Objektträgerhalters auf. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie wie in Schritt 5.5 beschrieben.
- Für die Inkubation mit Avidin-Biotin-Komplex-Peroxidase (ABC/HRP-Komplex, siehe Materialtabelle) bereiten Sie das Reagenz 30 Minuten vor Gebrauch vor. Tragen Sie die komplexe ABC/HRP-Lösung (200 μl) in jede Vertiefung des Gleitplattenhaltersatzes auf. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie wie in Schritt 5.5 beschrieben.
6. Entwicklung mit DAB-Chromogen
ACHTUNG: DAB ist ein potenzielles Karzinogen. Daher ist bei der Arbeit mit diesem Reagenz eine angemessene Sorgfalt erforderlich, einschließlich Augenschutz, Laborkittel, Handschuhe und gute Laborverfahren. Entsorgen Sie die örtlichen Vorschriften.
- Chromogen unmittelbar vor Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) verdünnen. Tragen Sie die Chromogenlösung (400 μl) auf jede Vertiefung des Slide-Plate-Sets auf.
- Bis zu 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In PrPSc positiven Schnitten ist in der Regel eine Inkubationszeit von 10 min ausreichend.
- Entfernen Sie die restliche Chromogenlösung, indem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser waschen. Entfernen Sie die Objektträger aus den Abdeckplattenhaltern und legen Sie sie in einen Plastikbehälter mit destilliertem Wasser.
7. Hämatoxylin-Gegenfärbung
- Tauchen Sie den Edelstahl-Färbekorb mit den Schnitten für 1 Minute in das Hämatoxylinlösungsbad (siehe Materialtabelle). 10 Minuten lang vorsichtig unter fließendem kaltem Wasser oder 5 Minuten in lauwarmem Wasser abspülen.
- Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie 1 Minute lang in 90% Ethanol legen, gefolgt von einem Bad in absolutem Ethanol für 1 Minute. Legen Sie dann die Objektträger für 1 Minute in ein Xylolbad.
- Montieren Sie die Profile mit einem handelsüblichen Montagemedium (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Diese Schritte werden in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur (19 °C-24 °C) durchgeführt. Dieses Verfahren umfasst ein Prüfprotokoll (Ergänzungsdatei 1), in dem die Durchführung aller Schritte, die verwendeten Geräte und der Labortechniker aufgezeichnet werden. Darüber hinaus wurde ein Arbeitsblatt (Ergänzungsdatei 2) erstellt, um die Volumina der Reagenzien anhand der Anzahl der Abschnitte in jedem Assay, der Arbeitsverdünnungen und der Anweisungen des Herstellers sowie die Raumtemperatur, die Ausrüstung und die Reagenzienchargen einfach zu bestimmen.
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Ergebnisse
Da eine unspezifische Ziel-Immunmarkierung möglich ist, ist es wichtig, das Ausmaß der unspezifischen Immunmarkierung bei bekannten TSE-negativen Kontrolltieren zu ermitteln. Dies ist ein wichtiger Schritt, um die spezifische PrPSc-Immunmarkierung richtig zu interpretieren7 (Abbildung 2). Es wurde festgestellt, dass die Nicht-Ziel-Markierung durch Anti-PrP-Antikörper als diskrete intraneuronale feinpartikuläre Färbung (deutlicher im Hypoglossusker...
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Diskussion
TSE sind potentielle Zoonosen. Nach dem Auftreten von BSE im Vereinigten Königreich im Jahr 1986 wurde Portugal zu einem der Mitgliedstaaten der Europäischen Union mit einer höheren Inzidenz dieser Krankheit14,15. Um diese Krankheit und andere TSE, die aufgetreten sind (klassische und atypische Traberkrankheit, BSE-Varianten und derzeit die Überwachung der chronischen Auszehrung bei Hirschen), zu kontrollieren, wurden von der Generaldirektion für Lebensmittel und...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Dieser Artikel wurde durch das Projekt POCI-01-0145-FEDER-029947 "Risikobewertung für chronische Auszehrungskrankheiten in Portugal" finanziert, das von FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020 unterstützt wird. Außerdem erhielten die Autoren der Forschungseinheit CECAV eine Förderung durch das FCT im Rahmen des Projekts UIDB/CVT/0772/2020.Wir danken Bruce C. Campbell, Forschungsdirektor (im Ruhestand), Western Regional Research Center, USDA, für seine Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Absolutes Ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Ungeachtet |
| nbsp; | 90%, 70% und 50% in destilliertem Wasser verdünnt | ||
| Avidin-Biotin-Komplex und Peroxidase Vectastain Elite ABC Kit Peroxidase | Vector Laboratories | PK-6100 | Vorbereiten und 30 Minuten vor Gebrauch gemäß den Anweisungen des Kits vorsichtig mischen. Nach dem Stehen nicht mischen. |
| Biotinylierter Sekundärantikörper (Pferde-Anti-Maus-IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Verdünnen Sie bei 1/200 in TBS mit 10% Pferdenormalserum. Bereiten Sie das erforderliche Volumen in Abhängigkeit von der Anzahl der Abschnitte vor. |
| Chromogen Diaminobenzidin-DAB, Substrat-Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Vor Gebrauch gemäß den Anweisungen des Kits vorbereiten. Verwenden Sie 400 & micro; L Lösung pro Abschnitt. |
| DakoCytomation Pascal Druckkammer | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich' s Hämatoxylin: | |||
| Hämatoxylin | Merck | 115938 | 2 g Hämatoxylin in 100 ml absolutem Ethanol auflösen. 100 ml destilliertes Wasser, 10 ml Eisessig und 15 g Kaliumalaun unter ständigem Rühren hinzufügen. Fügen Sie 100 ml Glycerin hinzu. Der natürliche Oxidationsprozess dauert 2 Monate, bevor er verwendet wird. |
| Absolutes Ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Eisessig | Merck | 101830 | |
| Kaliumalaun | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogene Peroxidase Blocklösung (3% Konzentration H2O2): | 40 mL Wasserstoffperoxid (30% w/w) in 360 mL Methanol. Vor Gebrauch vorbereiten | ||
| Wasserstoffperoxid (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Ameisensäure 98% | Merck | 1.00264.1000 | Unverdünntes |
| Mikrotom | Shandon-AS325 | Mikrotom | Shandon-AS325 |
| Eindeckmedium Entellan | Merck | 107960 | Gebrauchsfertig. |
| Normales Serum (20%) Blocklösung bei TBS: Pferd normales Serum | Gibco | 16050-122 | Bereiten Sie das endgültige Volumen entsprechend der Anzahl der Schnitte im Assay vor (200 & Mikro; L der Lösung pro Abschnitt). |
| Primärer Antikörper anti-PrP Maus MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Schaf einschließlich atypischer Scrapie, Cervine, Katzen. Nicht geeignet für Rinder. Je nach Anzahl der Schnitte im Assay (200 & Mikro; L der Lösung pro Abschnitt) und Antikörperverdünnung, bereiten Sie das endgültige Volumen in TBS vor, ergänzt mit 10 % normalem Serum der Spezies, in der der Sekundärantikörper aufgezogen wurde (normales Pferdeserum) Übliche Antikörperverdünnung: MAb 2G11 1/100, aber in jeder neuen Charge sollte eine Arbeitsverdünnung eingeführt werden, um die Konzentration zu erhalten, die die stärkste Markierung mit geringstem Hintergrund ergibt. Für die Lagerung aliquote Volumina von mindestens 10 μm einfrieren; L in sterile Mikroröhrchen füllen. Tauen Sie auf und verwenden Sie jeweils ein Aliquot |
| Primärer Antikörper anti-PrP Maus MAb 12F10 | Kaiman Chemisches Unternehmen | 189710 | PrP142-160 Rind, nicht geeignet für Schaf Übliche Antikörperverdünnung: 1/200, aber es sollte auch eine Arbeitsverdünnung eingestellt werden. Vorbereiten als MAb 2G11 |
| Shandon AbdeckplatteTM Kammer | Thermo Scientific | ||
| Shandon Sequenza® Zentrum für Immunfärbung | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrat Buffer (10 mM pH 6,1): | 2,55 g Trinatriumcitrat-Dihydrat und 0,255 g Zitronensäure in einem Liter gereinigtem Wasser. pH-Wert der Arbeitslösung mit 10 mM Zitronensäurelösung (1,05 g Zitronensäure in 500 mL gereinigtem Wasser) auf 6,1 einstellen Am Tag des Assays vorbereiten. | ||
| Trinatriumcitrat-Dihydrat | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Zitronensäure | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Färbeglas und -korb | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus Objektträger | VWR | 631-0108 | |
| Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0,8% NaCI; pH 7,6): | 10xTBS (Stammlösung 0,5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g und NaCl 80 g in 800 mL gereinigtem Wasser. Den pH-Wert der Stammlösung mit Salzsäure 37 % und das Endvolumen mit gereinigtem Wasser auf einen Liter einstellen (5± 3° C bis 2 Monate) TBS-Stammlösung am Probentag 1/10 verdünnen. | ||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylol | Panreac Applied Chem ITW Reagenzien | 251769 | unverdünnt |
Referenzen
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry). Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
- Orge, L., et al. Neuropathology of Animal Prion Diseases. Biomolecules. 11 (3), 466(2021).
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al. Identification of H-type BSE in Portugal. Prion. 9 (1), 22-28 (2015).
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. Atlas of veterinary pathology. Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).
- Pires, M. A., et al. Immunology protocols, didactic series. Applied Sciences. , 357(2010).
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