Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, Verarbeiten, Färben, Markieren und Untersuchen ganzer Sphäroide und Organoide unter verschiedenen Mikroskopen, während sie in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät intakt bleiben.

Zusammenfassung

Organoide und Sphäroide, dreidimensionale Wachstumsstrukturen in Zellkulturlaboren, werden zunehmend als überlegene Modelle im Vergleich zu zweidimensionalen Kulturmodellen anerkannt, da sie den menschlichen Körper besser nachahmen und Vorteile gegenüber Tierversuchen haben. Diese Studien haben jedoch häufig Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Konsistenz. Während der langen experimentellen Prozesse - mit Transfers von Organoiden und Sphäroiden zwischen verschiedenen Zellkulturgefäßen, Pipettieren und Zentrifugieren - werden diese anfälligen und fragilen 3D-Wachstumsstrukturen oft beschädigt oder gehen verloren. Letztendlich werden die Ergebnisse erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Die hier beschriebenen Methoden minimieren diese stressigen Schritte und gewährleisten eine sichere und konsistente Umgebung für Organoide und Sphäroide während des gesamten Verarbeitungsablaufs, während sie sich noch in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät befinden. Die Forscher können die Struktur von Organoiden oder Sphäroiden unter verschiedenen High-Tech-Instrumenten, vom Konfokal- bis zum Elektronenmikroskop, mit einem einzigen Mehrzweckgerät züchten, einfrieren, auftauen, verarbeiten, färben, markieren und dann untersuchen. Diese Technologie verbessert die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Gültigkeit der Studien und sorgt gleichzeitig für eine stabile und schützende Umgebung für die 3D-Wachstumsstrukturen während der Verarbeitung. Darüber hinaus minimiert die Eliminierung stressiger Schritte Handhabungsfehler, reduziert den Zeitaufwand und verringert das Kontaminationsrisiko.

Einleitung

Die Zukunft der Zellforschung und -therapie liegt in 3D-Zellkulturen ^1,2,3. Organoid- und Sphäroidmodelle schließen die Lücke zwischen In-vitro-Experimenten und Tiermodellen, indem sie bessere Modelle schaffen, die die Entwicklung, Physiologie und Krankheiten des menschlichen Körpers nachahmen 4,5,6,7,8,9. Die Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit dieser Modelle bleibt ....

Protokoll

1. Kultivierung von Organoiden und Sphäroiden

1. Legen Sie das Hydrogel über Nacht auf Eis (in einem Kühlschrank oder einem Kühlraum), um aufzutauen.
2. Das handelsübliche Mehrzweckgerät (MD; siehe Materialtabelle) 1 Tag vor dem Versuch (37 °C, 5% CO₂) zum Erwärmen in den Inkubator stellen.
3. Sterile Pipettenspitzen mit breitem Ende bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
   HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.3 sind an Tag 0 und die Schritte 1.4-1.11 an Tag 1 durchzuführen.
4. Legen Sie das Hydrogel für 15 min in eine Laminar-Flow-Haube.
   1. Optional: Verdünnen Sie das Hydrogel in kaltem Zellkulturmedi....

Ergebnisse

Der vorliegende Artikel stellt ein Mehrzweckgerät (MD) dar und ergänzt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, histologischen Färben, immunhistochemischen Färben, Immunfluoreszenzmarkierung, Beschichten und Verarbeiten ganzer Organoide oder Sphäroide, während sie sich noch in einem Hydrogel in einer einzigen, einzigartig gestalteten Umgebung befinden. Die aktuelle Studie wurde entwickelt, um HepG2-Leberkrebs-Sphäroide in 35 Hydrogel-Tropfen in 35 MDs herzustellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung.......

Diskussion

Der MD, der die hier beschriebenen Formulierungen und Protokolle ergänzt, ermöglicht ein schnelles und spontanes 3D-Wachstum von Organoiden und Sphäroiden in einer kontrollierteren Umgebung und setzt das Experiment unter den gleichen Bedingungen fort. Die Probe bleibt während des gesamten Prozesses in der gleichen Umgebung, und fast 100% der 3D-Wachstumsarchitekturen bleiben im Container intakt. Dies verbessert die Homogenität während der sequentiellen Experimente und ermöglicht eine verlängerte Kulturperiode. Darüber hi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Absolutes Ethanol (EtOH)	Merck	8187602500	dH2O zu 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 96 % Lösung verdünnen und bei RT
Aceton	Merck	8222512500
Fluor-Weizenkeim-Agglutinin und Hoechst in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) bei RT Alexa lagern	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE Plasmamembran- und Nuklearmarkierungskit, lagern bei -20 μg; C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) konzentrierter und vorverdünnter polyklonaler Antikörper	Biocare Medical	CP 028 A	Bei +4 ° lagern C
Anti-Albumin-Antikörper	Abcam	EPR20195	Bei +4 ° lagern C, Verdünnung: 1:50
Anti-Beta-Galactosidase-Antikörper, polyklonales Hühnchen-Abcam		134435	Bei +4 &/° lagern; C, Verdünnung: 1:25
Anti-Cytokeratin 5	Abcam	53121	Bei +4 ° C, Verdünnung: 1:100
Arginase-1 konzentrierter und vorverdünnter monoklonaler Kaninchen-Antikörper	Biocare Medical	ACI 3058 A, B	Bei +4 & Grad lagern; C, Verdünnung: 1:50
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma	C1016-500G	In Karnovsky's Fixiermittel auflösen, um 2 mM CaCl2 herzustellen; lagern im RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)	Abcam	ab228554
Zentrifugenröhrchen, 15 mL	Nest	601051
Zentrifugenröhrchen, 50 mL	Nest	602052
Klasse II Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2 Inkubator	Panasonic	KM-CC17RU2
Kupfergitter	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	G100-Cu	Ultradünne Schnitte auf den Gittern; 100 Linien/Zoll Quadratmasche
Kritischer Punkttrockner	Leica	EM CPD300	Zur Trocknung biologischer Proben für REM-Anwendungen in absolutem Aceton
DAB/AEC-Chromogenlösungsgemisch	Sigma Aldrich	AEC101	Store bei +4 ° C
Diamantmesser	Diatomee	Ultra 45°, 40-US	Verwendung für ultradünne Schnitte für TEM
Dimethylsulfoxid für die Molekularbiologie	Biofroxx	67-68-5
Einweg-Pasteur-Pippettes	aus
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle	Medium Gibco	41966-029	Lagern bei +4 ° C
Eosin Y Lösung Alkoholisch	Heller Objektträger	2.BS01-105-1000
Epon-Harz	Sigma	45359-1EA-F	Epoxid-Einbettmedium-Kit, Lagerung bei +4 > C
Fötales Rinderserum mit Zusatzstoff	Pan Biotech	P30-3304	Bei +4 ° lagern C
Gefrierlösung (FS)	Cellorama	CellO-F	Bei +4 > lagern C
Glasmessermacher	Leica	EM KMR3	Für die Herstellung von Glasmessern in 8 mm Dicke
Glasmesserstreifen (Größe 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)	Leica	7890-08	Verwendung für ultra- oder halbdünne Schnitte für TEM
Glutaraldehyd Wässrige Lösung, EM-Qualität, 25%	Elektronenmikroskopie Sciences	16210	In dH2O verdünnen, um eine 2,5%ige Lösung herzustellen und bei +4 & Grad; C
Glycerinlösung	Sigma Aldrich	56-81-5	Bei -20 C lagern, Verdünnung :1:100
Ziege Anti-Hühner IgY (H+L) Sekundärantikörper, Alexa, 647	Invitrogen	A32933	Bei RT aufbewahren
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, DyLight, 488	Invitrogen	35502	Gelagert bei +4 &Grad; C,  Verdünnung: 1:50
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, DyLight, 550	Invitrogen	84540	Bei +4 ° lagern; C,  Verdünnung: 1:50
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, DyLight, 488	Invitrogen	35552	Bei +4 ° lagern; C,  Verdünnung: 1:50
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, DyLight, 550	Invitrogen	84541	Bei +4 ° lagern; C
Hämatoxylin Harris	Bright Slide	2.BS01-104-1000
HepG2-Zellen	ATCC	HB-8065	Im Stickstofftank aufbewahren
Mensch/Ratte OV-6 Antikörper Monoklonale Maus IgG1 Klon # OV-6	R & D Systems	MAB2020	Lager bei -20 > C
Hydrogel	Corning	354248	Matrigel, Basalmembran-Matrix mit hoher Konzentration (HC), LDEV-frei, 10 mL, Lagerung bei -20 & Grad; C
Hydrogel	Corning	354234	Matrigel, Basalmembranmatrix, LDEV-frei, 10 mL, Lagerung bei -20 & Grad; C
Hydrogel	ThermoFischer Scientific	A1413201	Geltrex, LDEV-freie Basalmembran-Matrix-Hydrogel mit reduziertem Wachstumsfaktor
	Biotechne, R& D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME, Lager bei -20 ° C
Karnovsky's Fixiermittel			%2 PFA, %2,5 Glutaraldehyd in 0,15 M Cacodylatpuffer, 2 mM CaCl2; frisch zubereiten; Verwendung für TEM & REM-Proben
L-Asparaginsäure	Sigma	11189-100G	Bei RT lagern
Blei-Aspartat-Lösung			40 mg Asparaginsäure in 10 mL ddH2O auflösen und 66 mg Bleinitrat zugeben. Lösung stabilisiert sich bei 60 & Grad; C und stellen Sie den pH-Wert auf 5 ein; Bereiten Sie frisches
Bleinitrat	Elektronenmikroskopie Sciences	17900	Store at RT
Leica Konfokales Mikroskop	Leica	DMi8
LSM 700 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss
Mikroplatten-Reader	Biotek Synergy
Mehrzweckgerät (MD)	Cellorama	CellO-M
Kern-DNA-Färbung	Invitrogen	H3569	Hoechst 33258, Pentahydrat (Bis-Benzimid) - 10 mg/ml Lösung in Wasser, lagern bei +4 &de; C
Nuklear-DNA-Färbung	ThermoFischer Scientific	62248	DAPI-Lösung, Lagerung bei +4 &Grad; C
Osmiumtetroxid (OsO4) ,4%	Elektronenmikroskopie Sciences	19190	In dH2O verdünnen, um eine 2%ige Lösung herzustellen; lagern bei +4 &Grad; C und in luftdichtem Behälter; schützen leichte
Ov6-Antikörper	R& D systems	MAB2020	Lagern bei +4 > C
Paraformaldehyd (PFA)-Lösung, 4%	Sigma	1.04005.1000	4% PFA in dH2O lösen und kochen, abkühlen und aliquotieren; lagern bei -20 &/�; C
Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Bei +4 ° C
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Tabletten	MP Biomedicals, LLC	2810305
Postfixative Lösung			%2 OsO4, %2,5 Kaliumferrocyanid in dH2O; bereiten Sie frische
wässrige Kalium-Ferrocyanid-Lösung vor, 5%	Electron Microscopy Sciences	26603-01	Store at RT
Primovert - Inverses Hellfeldmikroskop - ZEISS	Zeiss	ArtikelNr.: 491206-0001-000
Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, 2 mL	Nest	620611
Rasterelektronenmikroskopie mit STEM-Aufsatz	Zeiss	GeminiSEM 500	Wir verwenden einen Inlens Secondary Electron (SE)-Detektor bei 2-3 kV für Rasterelektronenmikroskopaufnahmen und einen aSTEM-Detektor bei 30 kV für Transmissionselektronenmikroskopien.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack	ScyTek Laboratories	SHP125	Lagern bei +4 &Grad; C
Natrium-Cacodylat-Puffer, 0,4 M, pH 7,2	Elektronenmikroskopie Sciences	11655	dH2O zu 0,2 M verdünnen und bei +4 &/2 Grad lagern; C
Natrium/Kalium-ATPase alpha 1 Antikörper [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	lagern bei -20 &de; C
Lösung für die Immunfluoreszenzmarkierung (S-IF)	Cellorama	CellO-IF	Bei +4 ° C
Lösung für die Immunhistochemie (S-IHC)	Cellorama	CellO-P	bei +4 ° C
Probentrimmgerät	Leica	EM TRIM2	Zur Vorbereitung von Epon-Probenblöcken auf Ultramikrotome
Sputter-Coater	Leica	EM ACE200	Beschichten Sie die REM-Proben mit 6 nm Gold/Palladium für 90 s
Thiocarbohydrazid (TCH)	Sigma	223220-5G	Verdünnen Sie in dH2O, um 0,5%ige Lösung herzustellen und filtrieren Sie mit 0,22 & Mikro; M Membranfilter; bei RT speichern; Frische
Trypan Blue Lösung vorbereiten, 0,4%	Gibco	15250061
Ultra Gel Sekundenkleber	Pattex	PSG2C	Zum Kleben polymerisierter Epon-Block mit Probe in den Halter Epon-Block
Ultramikrotom	Leica	EM UC7	Zur Herstellung hochwertiger ultra- oder halbdünner Schnitte für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Universal-Pipettenspitzen, 10 & Mikro; L	Nest	171215-1101
Universal-Pipettenspitzen, 1000 & micro; L	Isolab	L-002
Universal-Pipettenspitzen, 200 & Mikro; L	Nest	110919HA01
Uranylacetat	Elektronenmikroskopie Sciences	22400	dH2O verdünnen, um eine 2%ige Lösung herzustellen und mit 0,22 & Mikro zu filtrieren; M Membranfilter; Behälter dicht verschlossen halten Lager bei RT