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Methodenartikel

Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel

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DOI:

10.3791/64563

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23. Dezember 2022

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1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, Verarbeiten, Färben, Markieren und Untersuchen ganzer Sphäroide und Organoide unter verschiedenen Mikroskopen, während sie in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät intakt bleiben.

Zusammenfassung

Organoide und Sphäroide, dreidimensionale Wachstumsstrukturen in Zellkulturlaboren, werden zunehmend als überlegene Modelle im Vergleich zu zweidimensionalen Kulturmodellen anerkannt, da sie den menschlichen Körper besser nachahmen und Vorteile gegenüber Tierversuchen haben. Diese Studien haben jedoch häufig Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Konsistenz. Während der langen experimentellen Prozesse - mit Transfers von Organoiden und Sphäroiden zwischen verschiedenen Zellkulturgefäßen, Pipettieren und Zentrifugieren - werden diese anfälligen und fragilen 3D-Wachstumsstrukturen oft beschädigt oder gehen verloren. Letztendlich werden die Ergebnisse erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Die hier beschriebenen Methoden minimieren diese stressigen Schritte und gewährleisten eine sichere und konsistente Umgebung für Organoide und Sphäroide während des gesamten Verarbeitungsablaufs, während sie sich noch in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät befinden. Die Forscher können die Struktur von Organoiden oder Sphäroiden unter verschiedenen High-Tech-Instrumenten, vom Konfokal- bis zum Elektronenmikroskop, mit einem einzigen Mehrzweckgerät züchten, einfrieren, auftauen, verarbeiten, färben, markieren und dann untersuchen. Diese Technologie verbessert die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Gültigkeit der Studien und sorgt gleichzeitig für eine stabile und schützende Umgebung für die 3D-Wachstumsstrukturen während der Verarbeitung. Darüber hinaus minimiert die Eliminierung stressiger Schritte Handhabungsfehler, reduziert den Zeitaufwand und verringert das Kontaminationsrisiko.

Einleitung

Die Zukunft der Zellforschung und -therapie liegt in 3D-Zellkulturen 1,2,3. Organoid- und Sphäroidmodelle schließen die Lücke zwischen In-vitro-Experimenten und Tiermodellen, indem sie bessere Modelle schaffen, die die Entwicklung, Physiologie und Krankheiten des menschlichen Körpers nachahmen 4,5,6,7,8,9. Die Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit dieser Modelle bleibt jedoch eine Herausforderung. Darüber hinaus führt die Handhabung, Ernte, Übertragung und Zentrifugierung dieser Strukturen mit aktuellen Technologien unter vielen Bedingungen zu Verlust oder Beschädigung der Organoide und Sphäroide, was die Ergebnisse erheblich beeinflusst.

Trotz vieler Protokolle für histologische Färbung, immunhistochemische Färbung, Immunfluoreszenzmarkierung und Kryokonservierung gibt es keinen universellen Ansatz zur Standardisierung experimenteller Bedingungen, zur Handhabung und Verarbeitung dieser empfindlichen Strukturen, ohne sie zu verlieren oder zu beschädigen. Aktuelle Protokolle sind auch unglaublich lang, wechseln sich von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen ab und beinhalten komplexe Verfahren mit verschiedenen Reagenzien 10,11,12,13,14. Darüber hinaus verursachen das Ernten, Pipettieren, Zentrifugieren und Übertragen von 3D-Wachstumsstrukturen zwischen Zellkulturgefäßen und Kryozellen Veränderungen in der Positionierung der Strukturen und mechanischen Kräfte und beeinflussen letztendlich die Differenzierung und Reifung der Organoide und Sphäroide. Es wurde berichtet, dass die Gewebetopologie, die Positionierung der Zellen und mechanische Kräfte die Zelldifferenzierung und -reifung signifikant beeinflussen 6,15,16,17.

Daher ist es wünschenswert, die derzeitigen konventionellen Technologien zur Erzeugung von Organoiden und Sphäroiden mit stabiler Qualität zu verbessern. Eine Methode/Vorrichtung, die die Zentrifugation und andere oben beschriebene Schritte überspringt und das Material von Anfang bis Ende der verschiedenen Prozesse in einer einzigen sicheren Umgebung bereitstellt, wäre von Vorteil, um die konsistentesten und zuverlässigsten Daten zu erhalten. Darüber hinaus reduziert dies Zeit-, Arbeits- und Kostenbeschränkungen.

Das hier beschriebene Mehrzweckgerät (MD) bietet eine einzige sichere Umgebung für mehrere Prozesse von Organoiden und Sphäroiden (ergänzende Abbildung 1). Dieses Gerät und ergänzende Protokolle eliminieren die Schritte Ernten, Pipettieren, Übertragen und Zentrifugieren. Die Organoide und Sphäroide bleiben während der sequentiellen Prozesse in ihrer in vitro Umgebung. Diese Umgebung besteht hauptsächlich aus natürlichen oder synthetischen extrazellulären Matrixkomponenten, wie handelsübliche Hydrogele. Mit anderen Worten, die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es, eine ganze Probe von Organoiden / Sphäroiden zu verarbeiten, zu untersuchen und einzufrieren, während sie sich noch in einem Hydrogeltropfen befindet.

Das biokompatible Gerät ist beständig gegen Temperaturen zwischen 60 °C und -160 °C, wodurch es möglich ist, die Organoide/Steroide in einem Flüssigstickstofftank bei -160 °C wiederherzustellen oder Harzblöcke für die Elektronenmikroskopie bei 60 °C vorzubereiten. Die Nische im Gerät wurde entwickelt, um einen begrenzten Raum für 3D-Wachstumsstrukturen zu definieren und die Bildung von Sphäroiden oder Organoiden basierend auf den vorherigen Studien 18,19,20,21,22,23 zu stimulieren. Dieser Teil des Geräts ist transparent und enthält einen spezifischen Kunststoff, der eine hohe optische Qualität bietet (Brechungsindex: 1,43; Abbe-Wert: 58; Dicke: 7,8 mil [0,0078 Zoll oder 198 μm]). Sowohl die Nische als auch der umgebende "Seitenteil" verursachen Autofluoreszenz. Die transparente Nische in der Mitte hat eine Fläche von 80 mm 2, während der Seitenteil 600 mm2 beträgt. Die Tiefe des Behälters beträgt 15 mm und die Dicke 1,5 mm. Diese Merkmale sowie die Größe und das Design des Geräts ermöglichen es, Beobachtungen unter verschiedenen Arten von High-Tech-Mikroskopen durchzuführen und die Proben für elektronenmikroskopische Untersuchungen vorzubereiten (Abbildung 2). Das Schließsystem des Geräts bietet zwei Positionen, eine im Gefrierschrank und die andere für den Gasfluss im Inkubator. CCK8-Proliferations- und Zytotoxizitätstests zeigen ähnliche Wirkungen auf Zellen im Vergleich zu den traditionellen Zellkulturschalen (ergänzende Abbildung 2). Der Trypanblau-Exschlusstest zeigt eine hohe Zelllebensfähigkeit (94%) während der Zellkultur in der MD (Abbildung 3).

Die Prozesse, die für eine Probe in der einzelnen Vorrichtung durchgeführt werden können, umfassen (1) Kultivierung, (2) histologische Färbung, (3) Immunfärbung, einschließlich immunhistochemischer und Immunfluoreszenzmarkierung, (4) Einfrieren, (5) Auftauen, (6) Untersuchung unter optischen Mikroskopen wie Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Konfokal- und hochauflösenden Mikroskopen, (7) Beschichtung und Untersuchung direkt unter einem Rasterelektronenmikroskop oder (8) Vorbereitung auf die Transmissionselektronenmikroskopie ( Abbildung 2).

Es gibt verschiedene Methoden für histologische Färbung, immunhistochemische Markierung oder fluoreszierende Markierung von Organoiden und Sphäroiden 10,11,12,13,14,24,25. Die Ernte aus dem Hydrogel ist der erste und wichtigste Schritt der aktuellen Technologie. Nach diesem Schritt ermöglichen einige Methoden eine Whole-Mount-Immunmarkierung. Die geernteten Organoide werden in Paraffin eingebettet, geschnitten und für die Färbung und Immunfärbung in anderen markiert. Die Abschnitte stellen jedoch möglicherweise nicht die gesamte Stichprobe dar und liefern nur begrenzte Daten zur 3D-Architektur der Struktur. Darüber hinaus sind Schäden an diesen 3D-Strukturen und der Verlust der Antigenität bekannte Nebenwirkungen dieser Technologien.

Die ergänzenden neuen Protokolle für mikroskopische Untersuchungen in diesem Artikel ermöglichen eine Analyse ganzer Proben, die sich noch in einem Hydrogel befinden. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen zwei neu entwickelte Formulierungen: Lösung für Immunhistochemie (S-IHC) und Lösung für Immunfluoreszenzmarkierung (S-IF). Die Methoden mit diesen Lösungen ermöglichen es den Forschern, genauere Daten zu gewinnen, da traditionelle Arbeitsabläufe wie Zentrifugieren, Pipettieren und Übertragen der empfindlichen Strukturen keine schädlichen Auswirkungen haben. Das hier beschriebene Protokoll eliminiert auch die Notwendigkeit von Ernte-, Blockierungs-, Clearing- und Antigen-Retrieval-Schritten und verkürzt den gesamten Vorgang auf 6-8 h. Darüber hinaus ermöglicht die Methodik die gleichzeitige Zugabe von ein bis drei Antikörpern zu demselben S-IF. Daher ist es möglich, die Ergebnisse auch nach den mehrfachen Markierungsexperimenten noch am selben Tag zu erhalten, was ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist; Herkömmliche Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Markierungsprotokolle dauern typischerweise zwischen 3 Tagen und mehreren Wochen 10,11,12,13,14.

Paraffineinbettung, ein weiterer schädlicher Schritt, der die Antigenität reduziert, wird ebenfalls weggelassen. Die 3D-Struktur bleibt von Anfang bis Ende der mikroskopischen Untersuchung in ihrer In-vitro-Umgebung . Da die 3D-Struktur in ihren Wachstumsbedingungen bleibt, ahmen die Proteinexpressions- und Lokalisierungsdaten die In-vivo-Bedingungen besser nach. Es werden genauere Ergebnisse erwartet, da die Methodik die Schritte eliminiert, die die Antigenexpression der Probe beeinflussen. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen, wie diese neuen Protokolle Schritte eliminieren, Zeit und Arbeit im Labor sparen und Kosten und Abfallprodukte im Vergleich zu herkömmlichen Arbeitsabläufen reduzieren.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen entscheidenden Schritten besteht ein weiteres Problem darin, ein Kryokonservierungsmedium und eine Methode zur Erhaltung der 3D-Struktur der Probe mit höheren Zelllebensfähigkeitsratenbereitzustellen 26,27,28,29,30,31. Kryokonservierung ist unerlässlich, um ein stabiles Modellsystem zu schaffen und das Biobanking von Organoiden und Sphäroiden zu ermöglichen32,33. Biobanking der gesamten ursprünglichen 3D-Struktur ermöglicht eine getreuere Rekapitulation des natürlichen Gesundheits- oder Krankheitszustands. Die wichtigsten Überlegungen sind die Bequemlichkeit und Zuverlässigkeit der Kryokonservierung und das Auftauen von Organoiden / Sphäroide. Die Organoidrückgewinnung nach dem Auftauen ist in den meisten aktuellen Technologien sehr gering, oft weniger als 50%. Neuere Studien haben jedoch vielversprechende Ergebnisse mit verbesserten Überlebensratengezeigt 26,27,28,29. Lee et al. zeigten, dass 78% der Sphäroidzellen nach der Kryokonservierung überlebten, wenn sie die Lösung der University of Wisconsin verwendeten, die 15% DMSO28 enthielt. Die Zellüberlebensrate stieg in der Studie von Arai et al.29 auf 83%. Die Ergebnisse nach der Kryokonservierung werden jedoch erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Darüber hinaus sind serumfreie Reagenzien für die gute Herstellungspraxis in pharmazeutischen und diagnostischen Umgebungen erforderlich. Traditionelle Arbeitsabläufe verwenden ein Medium, das fetales Rinderserum (FBS) und Dimethylsulfoxid (DMSO) für die langsame Gefriermethode enthält, die beide mit Behinderungen verbunden sind. FBS ist ein tierisches Produkt und kann Chargenvariationen aufweisen. DMSO ist ein sehr erfolgreiches Kryoprotektivum, aber eine langfristige Exposition, insbesondere während des Auftauens, kann zytotoxische Wirkungen verursachen30,31.

Dieser Artikel beschreibt auch die Gefrier-/Auftaumethode ganzer Organoide oder Sphäroide noch in einem Hydrogel. In der Studie werden zwei Formeln zum Einfrieren von Organoiden und Sphäroiden verwendet: (1) 10% DMSO mit herkömmlicher Gefrierlösung (FS) und (2) ein serum- und DMSO-freies Kryokonservierungsmedium. Dieses Kryokonservierungsmedium enthält extrazelluläre Matrixkomponenten, die sich von aktuellen Formeln unterscheiden. Die extrazelluläre Matrix umfasst zwei Hauptklassen von Makromolekülen, Proteoglykanen und faserigen Proteinen, die für das physikalische Gerüst der zellulären Bestandteile unerlässlich sind, aber auch Prozesse initiieren, die für die Morphogenese, Differenzierung und Homöostase des Gewebes erforderlich sind 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagene sorgen für Zugfestigkeit, regulieren die Zelladhäsion, unterstützen Chemotaxis und Migration und steuern die Gewebeentwicklung37. Darüber hinaus bieten Elastinfasern Rückstoß für Gewebe, die wiederholt gedehnt werden38. Ein drittes faseriges Protein, Fibronektin, steuert die Organisation der interstitiellen extrazellulären Matrix und spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Zellbindung und fungiert als extrazellulärer Mechanoregulator39. Du et al. haben die kryoprotektive Wirkung von Hühnerkollagenhydrolysat auf das natürliche Actomyosin-Modellsystem41 nachgewiesen. Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kollagenhydrolysat das Wachstum von Eiskristallen hemmen, die Proteingefrierdenaturierung und -oxidation ähnlich wie kommerzielle Kryoprotektiva reduzieren und nach Gefrier-Tau-Zyklen eine bessere Gelstruktur bieten kann. Daher bietet die Zugabe extrazellulärer Matrixkomponenten zu den Kryokonservierungsmedien eine sicherere und schützendere Umgebung für die Probe und unterstützt die Heilung der lebenden Strukturen nach dem Einfrieren und Auftauen.

Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Studie ein einfaches Protokoll zur Markierung von zytoplasmatischen Membranen und Kernen lebender Organoide und Sphäroide, während sie sich noch im Hydrogel befinden.

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Protokoll

1. Kultivierung von Organoiden und Sphäroiden

  1. Legen Sie das Hydrogel über Nacht auf Eis (in einem Kühlschrank oder einem Kühlraum), um aufzutauen.
  2. Das handelsübliche Mehrzweckgerät (MD; siehe Materialtabelle) 1 Tag vor dem Versuch (37 °C, 5% CO2) zum Erwärmen in den Inkubator stellen.
  3. Sterile Pipettenspitzen mit breitem Ende bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
    HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.3 sind an Tag 0 und die Schritte 1.4-1.11 an Tag 1 durchzuführen.
  4. Legen Sie das Hydrogel für 15 min in eine Laminar-Flow-Haube.
    1. Optional: Verdünnen Sie das Hydrogel in kaltem Zellkulturmedium gemäß der Empfehlung des Herstellers.
  5. Legen Sie das Röhrchen mit einem Pellet von HepG2-Zellen (kommerziell gewonnene hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie; siehe Materialtabelle) auf Eis.
  6. Platte 30-35 μL 100% Hydrogel in der Nische des vorgewärmten Geräts, um einen Geltropfen zu erzeugen.
  7. Platzieren Sie 10.000 HepG2-Zellen in der Mitte der Oberseite jedes Hydrogeltropfens (Abbildung 2) und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C.
  8. Bedecken Sie den Hydrogeltropfen mit 200 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% Fetal Bovine Serum.
  9. Decken Sie den Deckel des MD in der richtigen Position ab, um den Gasfluss zu ermöglichen, und legen Sie das Gerät in den Inkubator.
  10. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit 200 μL DMEM mit 10% FBS.
  11. Überprüfen Sie das Wachstum der Sphäroide unter einem inversen Mikroskop (Abbildung 3). Die Sphäroidbildung beginnt nach dem 3. Tag. Video 1 zeigt die Position von Sphäroiden auf verschiedenen Ebenen in einer Hydrogelkuppel.
    ANMERKUNGEN: Es wird dringend empfohlen, die Flüssigkeit, die das Hydrogel umgibt, vorsichtig abzusaugen und die neue Flüssigkeit langsam in die Umgebung einzubringen, um eine Beschädigung der Hydrogeltropfen zu vermeiden.

2. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung ganzer Organoide/Sphäroide in einem Hydrogel

  1. Erwärmen Sie das Fixiermittel (4% Paraformaldehyd; PFA), PBS und Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) bis 37 °C.
  2. Das Medium, das den Hydrogeltropfen umgibt, mit einer Pipette absaugen, 100-200 μL 4% PFA zur Fixierung hinzufügen und 15-20 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Die 4% PFA einsaugen und 200 μL PBS hinzufügen, um sie 3x für je 5 min bei 37 °C zu waschen. Dann saugen Sie das PBS ab und inkubieren Sie mit 200 μL Hämatoxylinlösung für 15-20 min bei 37 °C.
  4. Das Hämatoxylin wird abgesaugt und 200 μLdH2Ozugegeben, um 3x jeweils 10 min bei 37 °C zu waschen. DasdH2Oeinsaugen und mit 200 μL Ethanol 5-10 min bei 37 °C inkubieren.
  5. Das Ethanol einsaugen und mit 200 μL Eosin (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C inkubieren. Das Eosin absaugen und 200 μLdH2Ohinzufügen, um es 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu waschen.
  6. DasdH2Oeinsaugen und 100 μL Glycerin zugeben, um den Hydrogeltropfen als Trägermedium abzudecken.
  7. Optional: Montieren Sie die Nische mit einem Deckglas. Dieser Schritt kann entfallen, um ein Zusammendrücken von Organoiden/Sphäroiden beträchtlicher Größe zu vermeiden.
  8. Schließen Sie den Deckel von MD fest, um ein Austrocknen bis zur Untersuchung zu vermeiden. Die Probe ist für die Untersuchung für mindestens 6 Monate stabil.

3. Immunhistochemie von Organoiden/Sphäroiden in einem Hydrogel

  1. Die kommerziell gewonnene Lösung für die Immunhistochemie (S-IHC; siehe Materialtabelle) wird auf 37 °C erwärmt.
  2. Die Organoide oder Sphäroide im Hydrogel mit 3%igem Wasserstoffperoxid (H2O2) in 200 μLdH2O für 5 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Die Wasserstoffperoxidlösung wird abgesaugt und 5 min bei 37 °C indH2Ogewaschen. DasdH2Oeinsaugen und zweimal mit 100 μL S-IHC bei 37 °C für jeweils 10 min inkubieren.
  4. S-IHC einsaugen und mit 100 μL primärem Antikörper (siehe Materialtabelle) verdünnt in S-IHC für 1-2 h bei 37 °C inkubieren (gemäß den Empfehlungen des Herstellers zur Arbeitsverdünnung).
  5. Die primäre Antikörperlösung wird abgesaugt und mit 100 μL S-IHC 3x für je 5 min bei 37 °C inkubiert.
  6. 100 μL S-IHC aspirieren und mit einem biotinylierten sekundären Antikörper (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C inkubieren.
  7. Die sekundäre Antikörperlösung wird abgesaugt und mit 100 μL S-IHC 3x für je 5 min bei 37 °C inkubiert. Das S-IHC absaugen und mit 100 μL Meerrettichperoxidase (HRP) markiertem Streptavidin (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C inkubieren.
  8. Das HRP-markierte Streptavidin einsaugen und mit 100 μL S-IHC 3x für jeweils 5 min bei 37 °C inkubieren.
  9. Das S-IHC absaugen und mit 100 μL DAB/AEC-Chromogenlösungsgemisch (siehe Materialtabelle) 5-10 min bei 37 °C inkubieren.
  10. Überwachen Sie die Intensität der Färbung unter einem Lichtmikroskop.
  11. Mit dH 2 O 3x jeweils2min waschen.
  12. Optional: Inkubieren mit 100 μL Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) für die nukleare Gegenfärbung für 5 min bei 37 °C.
  13. Das Hämatoxylin absaugen und indH2O 5 min waschen.
  14. DasdH2Oeinsaugen und den Hydrogeltropfen mit 100 μL Glycerin als Befestigungsmedium abdecken.
  15. Schließen Sie den Deckel des MD fest bis zur mikroskopischen Untersuchung.
    ANMERKUNGEN: Antigen-Retrieval- und Proteinblockierungsschritte werden in diesem Protokoll weggelassen, da S-IHC diese Schritte eliminiert.

4. Immunfluoreszenzmarkierung von Organoiden/Sphäroiden in einem Hydrogel

  1. Folgende Materialien werden auf 37 °C aufgewärmt: 4% PFA, PBS, S-IF, primäre Antikörperlösung in S-IF, sekundäre Antikörperlösung in S-IF, Kernfärbung und Glycerin (siehe Materialtabelle).
  2. Das Zellkulturmedium einsaugen und mit 200 μL 4% PFA für 15-30 min bei 37 °C fixieren. Das Fixiermittel einsaugen und in S-IF 3x für je 10 min bei 37 °C waschen.
  3. Fügen Sie dH2O an der Seite hinzu, die die Nische umgibt, um während der folgenden Schritte Feuchtigkeit zu erzeugen.
  4. Das S-IF, das den Hydrogeltropfen umgibt, wird abgesaugt und der Hydrogeltropfen mit 100 μL primärer Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) in S-IF für 30-60 min bei 37 °C inkubiert.
  5. Die primäre Antikörperlösung einsaugen und in S-IF 3x jeweils 10 min bei 37 °C waschen.
  6. Das S-IF einsaugen und mit 100 μL sekundärer Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) in S-IF für 30-60 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
  7. Die sekundäre Antikörperlösung einsaugen und mit PBS 3x jeweils 10 min bei 37 °C im Dunkeln waschen.
  8. Das PBS einsaugen und mit 100 μL nuklearer DNA-Färbung mit Montagemedium oder Glycerin bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
  9. Füllen Sie die Nische mit Glycerin, um ein Austrocknen zu vermeiden.
  10. Optional: Decken Sie die Nische mit einem Deckglas ab. Dieser Schritt kann weggelassen werden, um ein Zusammendrücken der Organoide/Sphäroide zu vermeiden.
  11. Schließen Sie den MD fest. Proben in MDs können bei 4 °C im Dunkeln für mindestens 6 Monate mit minimalem Fluoreszenzverlust gelagert werden.
  12. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die konfokalmikroskopische Untersuchung: Stellen Sie den Lochwert aller Kanäle auf 20,1 ein, halten Sie die Verstärkungsmasterkonstante bei 550 für 488 nm, 485 für 550 nm und 450 für 594 nm, halten Sie die Laserleistung für alle Experimente konstant und den niedrigsten Prozentsatz bei 2,0.
    ANMERKUNGEN: Primäre Antikörper: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumin (1:50), Anti-Beta-Galactosidase (1:25), Antimitochondrialer Antikörper (1:100), Anti-Golgi-Antikörper (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6-Antikörper (1:100). Sekundäre Antikörper: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)- 488, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-550, Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-488, Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-550, Ziegen-Anti-Hühner-IgY(H+L)-647. Die Verdünnung für alle sekundären Antikörper beträgt 1:100. Zusätzlich wird FITC-Phalloidin (1:100), ein konjugierter Antikörper, verwendet (siehe Materialtabelle).

5. Plasmamembran- und Kernmarkierung lebender Organoide und Sphäroide in einem Hydrogel

  1. Etikettierlösung mit Alexa Fluorweizenkeimagglutinin (5,0 μg/ml) und Hoechst (2 μM) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) gemäß den Empfehlungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) herstellen und auf 37 °C erwärmen.
  2. Das Zellkulturmedium absaugen und 100 μL Markierungslösung hinzufügen, um den Hydrogeltropfen abzudecken. 15-30 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Entfernen Sie die Etikettierlösung und waschen Sie sie zweimal in PBS 2x für je 10 min bei 37 °C. Optional: Mit 200 μL 4% Formaldehyd für 15 min bei 37 °C fixieren.
  4. Decken Sie den Hydrogeltropfen mit Glycerin als Montagemedium ab. Optional: Montieren Sie die Nische mit einem Deckglas.
  5. Schließen Sie den Deckel des MD fest und bewahren Sie ihn im Dunkeln bis zur fluoreszenz- / konfokalmikroskopischen Untersuchung im Kühlschrank auf. Es ist für mindestens 6 Monate stabil.

6. Einfrieren und Auftauen ganzer Organoide/Sphäroide in einem Hydrogel

  1. Frieren Sie die Organoide ein, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Die handelsüblich gewonnene Gefrierlösung (FS; siehe Materialtabelle) wird auf 37 °C erwärmt.
    2. Saugen Sie die Zellkulturmedien, die die Hydrogelkuppel umgeben, vorsichtig ab.
    3. Fügen Sie 200 μL FS vorsichtig hinzu. Die Probe mit FS bei 37 °C für 1 h inkubieren.
    4. Schließen Sie den Deckel des Geräts fest und legen Sie ihn in eine Schaumstoffbox. Legen Sie diese Schaumstoffbox in eine andere Schaumstoffverpackung, wie in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Schließen Sie beide Schaumstoffkästen fest. Zwei ineinander liegende Schaumstoffkästen bieten einen Temperaturkühlgradientenbereich von 1 bis 2°C/min der Probe in einem -20 °C Gefrierschrank.
    5. Stellen Sie die Box bei -20 °C für 2 h. Die Box in einen -80 °C Gefrierschrank geben und über Nacht stehen lassen.
    6. Nehmen Sie die Probe aus den Kartons. Die Probe im MD kann 6 Monate im -80 °C Gefrierschrank aufbewahrt werden.
    7. Die MD, die die Probe enthält, wird zur längerfristigen Lagerung in den Flüssigstickstofftank überführt.
  2. Tauen Sie die Organoide auf, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Nehmen Sie den MD mit der Probe aus dem Gefrier-/Stickstofftank und legen Sie ihn direkt in einen Inkubator bei 37 °C. 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. 200 μL warmes Kulturmedium in die Nische geben (das Verhältnis von FS zu Zellkulturmedium beträgt 1:1) und 30 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Mehr warmes Kulturmedium in die Nische geben (das Verhältnis von FS zu Zellkulturmedium ist 1:2) und 30 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Das Medium und die FS-Mischung vorsichtig absaugen. Fahren Sie mit der Rasterelektronenmikroskopie (Schritt 7) und der Transmissionselektronenmikroskopie (Schritt 8) fort, um die gesamten Organoide / Sphäroide im Hydrogel abzubilden.

7. Rasterelektronenmikroskopie von ganzmontierten Organoiden/Sphäroiden

  1. Erwärmen Sie Karnovskys fixierende und postfixative Lösung (siehe Materialtabelle) auf Raumtemperatur (RT).
  2. Asspirieren Sie das Zellkulturmedium, das das Hydrogel in der MD umgibt. Legen Sie die Probe für 15 min in den MD auf Eis in der Laminar-Flow-Haube.
  3. Das verflüssigte Hydrogel, das die Organoide/Sphäroide umgibt, sehr vorsichtig absaugen. Eine begrenzte Menge Matrigel kann in der Nische bleiben, um eine Beschädigung und den Verlust der Probe zu vermeiden.
  4. Fixieren Sie mit Karnovskys Fixiermittel (2% PFA, 2,5% Glutaraldehyd in 0,15 M Cacodylatpuffer und 2 mM CaCl2; siehe Materialtabelle) bei RT für 1 h.
  5. Das Fixiermittel vorsichtig absaugen und mit destilliertem Wasser (dH2O) 3x für jeweils 15 min waschen.
  6. DasdH2Owird vorsichtig abgesaugt und mit einer postfixativen Lösung (1% wässriges Osmiumtetroxid [OsO4]; siehe Materialtabelle) bei RT für 1 h fixiert.
  7. Das Nachfixiermittel vorsichtig absaugen und mit destilliertem Wasser (dH2O) 3x jeweils 15 min waschen.
  8. Dehydrieren Sie in einer abgestuften Reihe von Ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), Mischung aus Ethanol / Aceton (1: 1; 1: 2) und absolutem Aceton bei RT für jeweils 15 min.
  9. Mit einem kritischen Punkttrockner trocknen.
  10. Beschichten Sie die Probe im Gerät mit 6 nm Gold/Palladium mit einem Sputtercoater (siehe Materialtabelle) für 90 s.
  11. Beobachten Sie unter einem Rasterelektronenmikroskop mit einem Sekundärelektronendetektor in der Linse bei 2-3 kV im Vakuummodus (5 x 10-6 mA). Nehmen Sie Bilder mit einem Arbeitsabstand von 8,1-8,2 mm und mit 675-facher, 1050-facher und 1570-facher Vergrößerung auf.
    HINWEISE: Alle Schritte werden in der MD ausgeführt. Verwenden Sie 200-250 μL Lösung für jeden Schritt.

8. Transmissionselektronenmikroskopie von ganzmontierten Organoiden/Sphäroiden in einem Hydrogel

  1. Karnovskys Fixiermittel auf 37 °C aufwärmen. Asspirieren Sie das Zellkulturmedium, das das Hydrogel in der MD umgibt.
  2. Fixieren Sie die Probe mit Karnovskys Fixiermittel bei RT für 1 h. Mit dH2O 3x jeweils 15 min waschen.
  3. Post-fix mit 2% wässrigemOsO4 und 2,5% Kaliumferrocyanid bei RT für 45 min. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  4. Inkubieren in 0,5% Thiocarbohydrazid (TCH; siehe Materialtabelle) bei RT für 30 min. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  5. Inkubation in 2% wässrigemOsO4 bei RT für 30 min. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  6. In 2%iger Uranylacetatlösung (siehe Materialtabelle) bei RT für 1 h inkubieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt können Sphäroide über Nacht bei 4 °C gehalten werden.
  7. In Bleiaspartatlösung (siehe Materialtabelle) bei 60 °C für 45 min inkubieren. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  8. Dehydrieren Sie in einer abgestuften Reihe von Ethanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) und absolutem Aceton bei RT für jeweils 15 min.
  9. Mit einer Mischung aus (1:1; 1:2) Aceton/Eponharz und reinem Eponharz (siehe Materialtabelle) bei RT jeweils 2 h behandeln.
  10. Polymerisieren Sie das Harz bei 60 °C über Nacht (mindestens 16 h). Entfernen Sie nach der Polymerisation den Harzblock aus dem MD, wie in ergänzender Abbildung 4 dargestellt.
  11. Befestigen Sie den Harzblock mit einem Harzkleber an einem größeren. Schneiden Sie den Block und erreichen Sie die Position von Organoiden oder Sphäroide.
  12. Erhalten Sie halbdünne (1.000 nm) und ultradünne Schnitte (60 nm) mit einem Ultramikrotom (siehe Materialtabelle).
  13. Legen Sie die ultradünnen Schnitte auf 100 Mesh-Kupfergitter und beobachten Sie unter einem Rasterelektronenmikroskop mit einem STEM-Detektor bei einer Beschleunigungsspannung von 30 kV. Nehmen Sie Bilder mit einem Arbeitsabstand von 44 mm und einer Vergrößerung von 2580x, 5020x und 6060x auf.
    ANMERKUNGEN: Verwenden Sie 200-250 μL Lösung für jeden Schritt. Die Schritte 8.1-8.10 werden in der MD ausgeführt.

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Ergebnisse

Der vorliegende Artikel stellt ein Mehrzweckgerät (MD) dar und ergänzt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, histologischen Färben, immunhistochemischen Färben, Immunfluoreszenzmarkierung, Beschichten und Verarbeiten ganzer Organoide oder Sphäroide, während sie sich noch in einem Hydrogel in einer einzigen, einzigartig gestalteten Umgebung befinden. Die aktuelle Studie wurde entwickelt, um HepG2-Leberkrebs-Sphäroide in 35 Hydrogel-Tropfen in 35 MDs herzustellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung...

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Diskussion

Der MD, der die hier beschriebenen Formulierungen und Protokolle ergänzt, ermöglicht ein schnelles und spontanes 3D-Wachstum von Organoiden und Sphäroiden in einer kontrollierteren Umgebung und setzt das Experiment unter den gleichen Bedingungen fort. Die Probe bleibt während des gesamten Prozesses in der gleichen Umgebung, und fast 100% der 3D-Wachstumsarchitekturen bleiben im Container intakt. Dies verbessert die Homogenität während der sequentiellen Experimente und ermöglicht eine verlängerte Kulturperiode. Darüber hi...

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Offenlegungen

Ranan Gulhan Aktas besitzt MD-, S-IHC-, S-IF- und FS-Patentanmeldungen. Olgu Enis Tok war an der Entwicklung dieser Produkte beteiligt. Olgu Enis Tok und Gamze Demirel sind Mitglieder des F&E-Teams des Unternehmens Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut und Ozgecan Kayalar haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Wir danken Dale Mertes von der University of Chicago für die Erstellung der Diagramme, Dr. Mehmet Serif Aydin für seine technische Unterstützung am Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies und Dr. Rana Kazemi von der Maltepe University für die Bearbeitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absolutes Ethanol (EtOH)Merck8187602500dH2O zu 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 96 % Lösung verdünnen und bei RT
AcetonMerck8222512500
Fluor-Weizenkeim-Agglutinin und Hoechst in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) bei RT Alexa lagern  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasmamembran- und Nuklearmarkierungskit, lagern bei -20 μg; C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) konzentrierter und vorverdünnter polyklonaler AntikörperBiocare MedicalCP 028 ABei +4 ° lagern C
Anti-Albumin-AntikörperAbcamEPR20195Bei +4 ° lagern C, Verdünnung: 1:50
Anti-Beta-Galactosidase-Antikörper, polyklonales Hühnchen-Abcam134435Bei +4 &/° lagern; C, Verdünnung: 1:25
Anti-Cytokeratin 5Abcam53121Bei +4 ° C, Verdünnung: 1:100
Arginase-1 konzentrierter und vorverdünnter monoklonaler Kaninchen-AntikörperBiocare MedicalACI 3058 A, BBei +4 & Grad lagern; C, Verdünnung: 1:50
Calciumchlorid (CaCl2)SigmaC1016-500GIn Karnovsky's Fixiermittel auflösen, um 2 mM CaCl2 herzustellen; lagern im RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Zentrifugenröhrchen, 15 mL Nest601051
Zentrifugenröhrchen, 50 mL Nest602052
Klasse II Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 InkubatorPanasonicKM-CC17RU2
KupfergitterElektronenmikroskopie WissenschaftG100-CuUltradünne Schnitte auf den Gittern; 100 Linien/Zoll Quadratmasche
Kritischer PunkttrocknerLeicaEM CPD300Zur Trocknung biologischer Proben für REM-Anwendungen in absolutem Aceton
DAB/AEC-Chromogenlösungsgemisch  Sigma AldrichAEC101Store bei +4 ° C
DiamantmesserDiatomeeUltra 45°, 40-USVerwendung für ultradünne Schnitte für TEM
Dimethylsulfoxid für die MolekularbiologieBiofroxx67-68-5
Einweg-Pasteur-Pippettesaus
DMEM - Dulbecco's Modified EagleMedium Gibco41966-029Lagern bei +4 ° C
Eosin Y Lösung AlkoholischHeller Objektträger2.BS01-105-1000
Epon-Harz Sigma45359-1EA-FEpoxid-Einbettmedium-Kit, Lagerung bei +4 > C
Fötales Rinderserum mit ZusatzstoffPan BiotechP30-3304Bei +4 ° lagern C
Gefrierlösung (FS)CelloramaCellO-FBei +4 > lagern C
GlasmessermacherLeicaEM KMR3Für die Herstellung von Glasmessern in 8 mm Dicke
Glasmesserstreifen (Größe 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)Leica7890-08Verwendung für ultra- oder halbdünne Schnitte für TEM
Glutaraldehyd Wässrige Lösung, EM-Qualität, 25% Elektronenmikroskopie Sciences16210In dH2O verdünnen, um eine 2,5%ige Lösung herzustellen und bei +4 & Grad; C
GlycerinlösungSigma Aldrich56-81-5Bei -20 C lagern, Verdünnung :1:100
Ziege Anti-Hühner IgY (H+L) Sekundärantikörper, Alexa, 647InvitrogenA32933Bei RT aufbewahren
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, DyLight, 488Invitrogen35502Gelagert bei +4 &Grad; C,  Verdünnung: 1:50
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, DyLight, 550Invitrogen84540Bei +4 ° lagern; C,  Verdünnung: 1:50
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, DyLight, 488Invitrogen35552Bei +4 ° lagern; C,  Verdünnung: 1:50
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, DyLight, 550Invitrogen84541Bei +4 ° lagern; C
Hämatoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2-ZellenATCCHB-8065Im Stickstofftank aufbewahren
Mensch/Ratte OV-6 Antikörper Monoklonale Maus IgG1 Klon # OV-6R & D SystemsMAB2020Lager bei -20 > C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basalmembran-Matrix mit hoher Konzentration (HC), LDEV-frei, 10 mL, Lagerung bei -20 & Grad; C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basalmembranmatrix, LDEV-frei, 10 mL, Lagerung bei -20 & Grad; C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-freie Basalmembran-Matrix-Hydrogel mit reduziertem Wachstumsfaktor
Biotechne, R& D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Lager bei -20 ° C
Karnovsky's Fixiermittel%2 PFA, %2,5 Glutaraldehyd in 0,15 M Cacodylatpuffer, 2 mM CaCl2; frisch zubereiten; Verwendung für TEM & REM-Proben
L-AsparaginsäureSigma11189-100GBei RT lagern
Blei-Aspartat-Lösung40 mg Asparaginsäure in 10 mL ddH2O auflösen und 66 mg Bleinitrat zugeben. Lösung stabilisiert sich bei 60 & Grad; C und stellen Sie den pH-Wert auf 5 ein; Bereiten Sie frisches
BleinitratElektronenmikroskopie Sciences17900Store at RT
Leica Konfokales MikroskopLeicaDMi8
LSM 700 Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeiss
Mikroplatten-ReaderBiotek Synergy
Mehrzweckgerät (MD)CelloramaCellO-M
Kern-DNA-FärbungInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrat (Bis-Benzimid) - 10 mg/ml Lösung in Wasser, lagern bei +4 &de; C
Nuklear-DNA-FärbungThermoFischer Scientific62248DAPI-Lösung, Lagerung bei +4 &Grad; C
Osmiumtetroxid (OsO4) ,4%Elektronenmikroskopie Sciences19190In dH2O verdünnen, um eine 2%ige Lösung herzustellen; lagern bei +4 &Grad; C und in luftdichtem Behälter; schützen leichte
Ov6-AntikörperR& D systemsMAB2020Lagern bei +4 > C
Paraformaldehyd (PFA)-Lösung, 4% Sigma1.04005.10004% PFA in dH2O lösen und kochen, abkühlen und aliquotieren; lagern bei -20 &/�; C
Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Bei +4 ° C
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), TablettenMP Biomedicals, LLC2810305
Postfixative Lösung%2 OsO4, %2,5 Kaliumferrocyanid in dH2O; bereiten Sie frische
wässrige Kalium-Ferrocyanid-Lösung vor, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverses Hellfeldmikroskop - ZEISSZeissArtikelNr.: 491206-0001-000
Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, 2 mLNest620611
Rasterelektronenmikroskopie mit STEM-AufsatzZeissGeminiSEM 500Wir verwenden einen Inlens Secondary Electron (SE)-Detektor bei 2-3 kV für Rasterelektronenmikroskopaufnahmen und einen aSTEM-Detektor bei 30 kV für Transmissionselektronenmikroskopien.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Lagern bei +4 &Grad; C
Natrium-Cacodylat-Puffer, 0,4 M, pH 7,2Elektronenmikroskopie Sciences11655dH2O zu 0,2 M verdünnen und bei +4 &/2 Grad lagern; C
Natrium/Kalium-ATPase alpha 1 Antikörper [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871lagern bei -20 &de; C
Lösung für die Immunfluoreszenzmarkierung (S-IF)CelloramaCellO-IFBei +4 ° C
Lösung für die Immunhistochemie (S-IHC)CelloramaCellO-Pbei +4 ° C
ProbentrimmgerätLeicaEM TRIM2Zur Vorbereitung von Epon-Probenblöcken auf Ultramikrotome
Sputter-CoaterLeicaEM ACE200Beschichten Sie die REM-Proben mit 6 nm Gold/Palladium für 90 s
Thiocarbohydrazid (TCH)Sigma223220-5GVerdünnen Sie in dH2O, um 0,5%ige Lösung herzustellen und filtrieren Sie mit 0,22 & Mikro; M Membranfilter; bei RT speichern; Frische
Trypan Blue Lösung vorbereiten, 0,4%Gibco15250061
Ultra Gel SekundenkleberPattexPSG2CZum Kleben polymerisierter Epon-Block mit Probe in den Halter Epon-Block
UltramikrotomLeicaEM UC7Zur Herstellung hochwertiger ultra- oder halbdünner Schnitte für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Universal-Pipettenspitzen, 10 & Mikro; LNest171215-1101
Universal-Pipettenspitzen, 1000 & micro; LIsolabL-002
Universal-Pipettenspitzen, 200 & Mikro; L Nest110919HA01
UranylacetatElektronenmikroskopie Sciences22400dH2O verdünnen, um eine 2%ige Lösung herzustellen und mit 0,22 & Mikro zu filtrieren; M Membranfilter; Behälter dicht verschlossen halten Lager bei RT
In lagern Kunststoff Nest In In

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