Methodenartikel

In Silico Identifizierung und Charakterisierung von circRNAs während Wirt-Pathogen-Interaktionen

DOI:

10.3791/64565

⸱

21. Oktober 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR), Universiti Malaya

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das hier eingereichte Protokoll erläutert die vollständige In-silico-Pipeline , die für die Vorhersage und funktionelle Charakterisierung von circRNAs aus RNA-Sequenzierungs-Transkriptomdaten zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen erforderlich ist.

Zusammenfassung

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Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine Klasse nicht-kodierender RNAs, die durch Back-Sppleißen gebildet werden. Diese circRNAs werden vor allem auf ihre Rolle als Regulatoren verschiedener biologischer Prozesse untersucht. Bemerkenswert ist, dass neue Erkenntnisse zeigen, dass Wirts-circRNAs bei einer Infektion mit Krankheitserregern (z. B. Influenza und Coronaviren) differentiell exprimiert werden können, was auf eine Rolle von circRNAs bei der Regulierung der angeborenen Immunantwort des Wirts hindeutet. Untersuchungen zur Rolle von circRNAs bei pathogenen Infektionen sind jedoch begrenzt durch die Kenntnisse und Fähigkeiten, die erforderlich sind, um die notwendigen bioinformatischen Analysen durchzuführen, um DE-circRNAs aus RNA-Sequenzierungsdaten (RNA-seq) zu identifizieren. Die bioinformatische Vorhersage und Identifizierung von circRNAs ist von entscheidender Bedeutung vor jeder Verifizierung und funktionellen Studien mit kostspieligen und zeitaufwändigen Nasslabortechniken. Um dieses Problem zu lösen, wird in diesem Manuskript ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur In-silico-Vorhersage und Charakterisierung von circRNAs unter Verwendung von RNA-seq-Daten bereitgestellt. Das Protokoll kann in vier Schritte unterteilt werden: 1) Vorhersage und Quantifizierung von DE-circRNAs über die CIRIquant-Pipeline; 2) Annotation mittels circBase und Charakterisierung von DE circRNAs; 3) Vorhersage der CircRNA-miRNA-Interaktion durch die Circr-Pipeline; 4) Analyse der funktionellen Anreicherung von circRNA-Elterngenen unter Verwendung von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Diese Pipeline wird nützlich sein, um die zukünftige In-vitro - und In-vivo-Forschung voranzutreiben, um die Rolle von circRNAs bei Wirt-Pathogen-Interaktionen weiter zu entschlüsseln.

Einleitung

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Wirt-Pathogen-Interaktionen stellen ein komplexes Zusammenspiel zwischen den Krankheitserregern und den Wirtsorganismen dar, das die angeborenen Immunantworten des Wirts auslöst, die schließlich zur Entfernung eindringender Krankheitserreger führen 1,2. Bei pathogenen Infektionen wird eine Vielzahl der Immungene des Wirts reguliert, um die Vermehrung und Freisetzung von Krankheitserregern zu hemmen. Zu den häufigen Interferon-stimulierten Genen (ISGs), die bei pathogenen Infektionen reguliert werden, gehören ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I und OASL 3,4

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Protokoll

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In diesem Protokoll wurden de-identifizierte ribosomale RNA (rRNA)-depletierte RNA-seq-Bibliotheksdatensätze, die aus den mit dem Influenza-A-Virus infizierten menschlichen Makrophagenzellen erstellt wurden, aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank heruntergeladen und verwendet. Die gesamte bioinformatische Pipeline von der Vorhersage bis zur funktionellen Charakterisierung von circRNAs ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Jeder Teil der Pipeline wird in den folgenden Abschnitten näher erläutert.

1. Vorbereitung, Download und Einrichtung vor der Datenanalyse

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Ergebnisse

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Das im vorherigen Abschnitt aufgeführte Protokoll wurde modifiziert und konfiguriert, um dem Linux-Betriebssystem gerecht zu werden. Der Hauptgrund dafür ist, dass die meisten Modulbibliotheken und Pakete, die an der Analyse von circRNAs beteiligt sind, nur auf der Linux-Plattform funktionieren können. In dieser Analyse wurden de-identifizierte ribosomale RNA (rRNA)-depletierte RNA-seq-Bibliotheksdatensätze, die aus den mit dem Influenza-A-Virus infizierten menschlichen Makrophagenzellen hergestellt wurden, aus der GEO-D.......

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Diskussion

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Um den Nutzen dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurde RNA-seq aus mit dem Influenza-A-Virus infizierten humanen Makrophagenzellen als Beispiel verwendet. CircRNAs, die als potentielle miRNA-Schwämme in Wirt-Pathogen-Interaktionen fungieren, und ihre GO- und KEGG-funktionelle Anreicherung innerhalb eines Wirts wurden untersucht. Obwohl es eine Vielzahl von circRNA-Tools gibt, die online verfügbar sind, ist jedes von ihnen ein eigenständiges Paket, das nicht miteinander interagiert. Hier stellen wir einige der Werkzeu.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Der Autor dankt Tan Ke En und Dr. Cameron Bracken für die kritische Durchsicht dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Fundamental Research Grant Scheme (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) und dem University of Malaya High Impact Research Grant (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/Bezieht sich auf Abschnitt 4.1.2. Benötigt für Circr.
BWABurrows-Wheeler Alignerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/Bezieht sich auf Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2. Erforderlich, um CIRIquant auszuführen und das Genom zu indizieren
Circr GitHubhttps://github.com/bicciatolab/CircrBezieht sich auf Abschnitt 4. Verwenden Sie zur Vorhersage der miRNA-Bindungsstellen
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantUnter Bezugnahme auf Abschnitt 2.1.3. Zur Vorhersage von circRNAs
Clusterprofiler GitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerUnter Bezugnahme auf Abschnitt 7. Für GO und KEGG Funktionsanreicherung
CPUIntel  Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz    Kerne: 6-Core CPU Arbeitsspeicher: 65 GB Grafikkarte: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)Spezifikationen, die zum Ausführen dieses gesamten Protokolls verwendet werden.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlUnter Bezugnahme auf Abschnitt 5.2. Erforderlich für die Darstellung des ceRNA-Netzwerks
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Bezieht sich auf Abschnitt 1.2.1. Qualitätsprüfung von Fastq-Dateien
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/Bezieht sich auf Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2. Erforderlich, um CIRIquant auszuführen und das Genom zu indizieren
LinuxUbuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)https://releases.ubuntu.com/focal/Erforderlich, um das gesamte Protokoll auszuführen. Andere Ubuntu-Versionen können weiterhin gültig sein, um das Protokoll auszuführen.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doUnter Bezugnahme auf Abschnitt 4.1.2. Benötigt für Circr
Pybedtoolspybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/Benötigt für die genomische Manipulation von BED-Dateien
PythonPython 2.7 und 3.6 oder darüberhttps://www.python.org/downloads/Zum Ausführen notwendiger Bibliotheksmodule
RThe Comprehensive R Archive Networkhttps://cran.r-project.org/Zur Manipulation von Datenrahmen
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridUnter Bezugnahme auf Abschnitt 4.1.2. Erforderlich für Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/Ein Arbeitsbereich zum Ausführen von R
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/Bezieht sich auf Abschnitt 2.1.2. Erforderlich zum Ausführen von CIRIquant
StringTieJohns Hopkins University: Center for Computational Biologyhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlBezugnahme auf Abschnitt 2.1.2. Erforderlich, um CIRIquant
TargetScanGitHubauszuführen https://github.com/nsoranzo/targetscanSiehe Abschnitt 4.1.2. Benötigt für Circr

Referenzen

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  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A.

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Schlagwörter

Zirkul re RNAsdifferenzielle ExpressionRNA Sequenzierungbioinformatische AnalyseCircRNA VorhersageCircRNA CharakterisierungGene Ontology AnalyseKEGG EnrichmentCircRNA miRNA Interaktion

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