Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Summary

Dieses Protokoll stellt eine robuste, detaillierte Methode dar, um hochreine Synaptosomen, synaptische Vesikel und andere synaptische Fraktionen aus dem Mausgehirn zu erhalten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung synaptischer Prozesse, einschließlich der biochemischen Analyse der Proteinlokalisation und -funktion mit kompartimentärer Auflösung.

Abstract

Synaptische Terminals sind die primären Orte der neuronalen Kommunikation. Synaptische Dysfunktion ist ein Kennzeichen vieler neuropsychiatrischer und neurologischer Störungen. Die Charakterisierung synaptischer Unterkompartimente durch biochemische Isolierung ist daher eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Grundlagen synaptischer Prozesse sowohl in der Gesundheit als auch in der Krankheit aufzuklären. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von synaptischen Terminals und synaptischen Subkompartimenten aus Mäusegehirnen durch subzelluläre Fraktionierung. Zunächst werden versiegelte synaptische terminale Strukturen, sogenannte Synaptosomen, nach Homogenisierung des Hirngewebes isoliert. Synaptosomen sind neuronale prä- und postsynaptische Kompartimente mit abgeklemmten und versiegelten Membranen. Diese Strukturen behalten einen metabolisch aktiven Zustand und sind wertvoll für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Die Synaptosomen werden dann einer hypotonen Lyse und Ultrazentrifugation unterzogen, um synaptische Unterkompartimente zu erhalten, die für synaptische Vesikel, synaptisches Zytosol und synaptische Plasmamembran angereichert sind. Die Fraktionsreinheit wird durch Elektronenmikroskopie und biochemische Anreicherungsanalyse für Proteine bestätigt, die für subsynaptische Kompartimente spezifisch sind. Die vorgestellte Methode ist ein einfaches und wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Synapse und der molekularen Ätiologie verschiedener Hirnerkrankungen.

Introduction

Synapsen sind die grundlegenden Recheneinheiten des Gehirns, durch die Neuronen kommunizieren und verschiedene und exquisit komplexe Funktionen ausüben. Synapsen sind daher grundlegend für die Gesundheit des Gehirns¹; Synaptische Dysfunktion ist als Quelle oder Folge vieler Störungen beteiligt². Synapsen bestehen aus prä- und postsynaptischen Terminals, Erweiterungen zweier verschiedener Neuronen, die eng beieinander liegen und durch einen synaptischen Spalt getrennt sind, der von synaptischen Adhäsionsmolekülen durchzogen wird. Informationsflüsse aus dem prä- bis postsynaptischen Kompartiment in Form von chemischen Botenstoffen, sogenannten Neurotransmittern¹. Die molekularen Prozesse, die an der Neurotransmission beteiligt sind, sind aktive Forschungsgebiete ^3,4,5. Das Verständnis der pathogenen Prozesse innerhalb synaptischer Terminals und die Reaktion von Synapsen auf Pathologie in anderen neuronalen Unterkompartimenten sind entscheidende Schritte zur Behandlung von Erkrankungen des Gehirns ^1,2. Mehrere methodische Fortschritte, die hauptsächlich auf murine Modelle angewendet wurden, haben dieses Streben vorangetrieben⁶. Die Isolierung synaptischer Fraktionen durch differentielle Zentrifugation ist eine solche Paradigmenwechselmethode, die die detaillierte Bewertung synaptischer Prozesse in Gesundheit und Krankheit ermöglicht hat.

Das erwachsene menschliche Gehirn besteht aus 80-90 Milliarden Neuronen ^7,8. Unter den Mausarten enthält das Rattengehirn ungefähr ~ 200 Millionen Neuronen, während Mäuse ~ 70 Millionen ^9,10 haben. Jedes Neuron bildet Tausende von spezifischen synaptischen Verbindungen mit einem Netzwerk von hochpolarisierten Neuronen, die mit Gliazellen und dichtem Gefäßsystem vermischt sind. In solch komplexem und heterogenem Gewebe war es früher undenkbar, Synapsen als eigenständiges System zu isolieren und zu untersuchen. In den 1960er Jahren machten Victor Whittaker, Catherine Hebb und andere dies möglich, indem sie intakte synaptische Terminals durch subzelluläre Fraktionierung 11,12,13,14 isolierten. In einem Versuch, synaptische Vesikel (SVs) zu isolieren, homogenisierten sie Gehirne durch flüssige Scherkraft in iso-osmotischer (0,32 M) Saccharose, gefolgt von Ultrazentrifugation. Sie erhielten abgeklemmte, von der Plasmamembran umschlossene, intakte Nervenendigungen oder Krampfadern, die sie Nervenendpartikel (NEPs) nannten11,13. Da die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Synapse in diesen Strukturen erhalten blieben, wurden NEPs später wegen Kongruenz mit anderen subzellulären Organellen als "Synaptosomen" bezeichnet^13,15. Es ist erwähnenswert, dass sich die Arbeit von Eduardo de Robertis und Kollegen, die den Begriff "synaptisches Vesikel" prägten, mit der von Whittaker und Kollegen überschnitt und zur Validierung der "Synaptosomen"-Isolierung und -Charakterisierung 16,17,18 beitrug.

Synaptosomen sind physiologisch aktive Strukturen, die alle zellulären und molekularen Eigenschaften enthalten, die für die Speicherung, Freisetzung und Wiederaufnahme von Neurotransmittern erforderlich^{sind 13,18}. Die Erhaltung wichtiger synaptischer Eigenschaften in vitro und die Freiheit von nicht-synaptischen Komponenten tragen ebenfalls zum Nutzen dieser Isolierungsmethode bei. Synaptosomen haben immens zum Verständnis der chemischen und physiologischen Eigenschaften der Neurotransmission beigetragen und werden nun verwendet, um synaptische molekulare Prozesse und deren Veränderungen bei Krankheit 19,20,21,22,23 zu untersuchen. Synaptosomen sind auch das Ausgangsmaterial für die Isolierung synaptischer Komponenten wie SVs, Clathrin-beschichtete Vesikel (CCVs), synaptisches Zytosol, synaptische Plasmamembran, synaptische Mitochondrien, synaptische Adhäsionsmoleküle und andere Komponenten von Interesse, die das Verständnis der molekularen Mechanismen der synaptischen Funktion erleichtern können 18,19,20,24,25,26^{, 27,28}. Diese subsynaptischen Komponenten können durch osmotische Lyse von Synaptosomen und Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation^15,29 erhalten werden. Obwohl bekannt ist, dass die ursprüngliche subzelluläre Fraktionierungsmethode von Whittakers Forschungsgruppe bei der Isolierung von Qualitätssynaptosomen und SVs 13,30 effizient ist, verbessern jüngste Optimierungen die Reinheit der subzellulären Fraktionen 22,23,31,32. Dieser Artikel bietet eine sehr detaillierte und zugängliche Version eines klassischen Protokolls für die subzelluläre Fraktionierung von murinem Hirngewebe, um Synaptosomen, SVs und andere subsynaptische Komponenten zu isolieren.

Protocol

Alle Experimente mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Yale University genehmigt (Protokoll 2021-11117) und in einer von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditierten Einrichtung durchgeführt. Tierpflege und Unterbringung entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren³³ und wurden vom Yale Animal Resource Center (YARC) bereitgestellt. Die Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Ad-libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Fünf bis acht Mäuse oder zwei bis vier Ratten pro Genotyp oder Bedingung sind für das folgende Protokoll erforderlich. Aufgrund ihres größeren Hirnvolumens sind weniger Ratten notwendig. In ähnlicher Weise kann das Alter der Versuchstiere den Fraktionsertrag beeinflussen; Zusätzliche Mäuse können für ein Alter von weniger als 2 Monaten erforderlich sein. Ansonsten gelten die beschriebenen Verfahren sowohl für murine Arten als auch für gesunde erwachsene Tiere jeden Alters. Die repräsentativen Daten, die in dieser Studie vorgestellt wurden, verwendeten Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J) (Alter = 2 Monate; vier Männchen und vier Weibchen pro Replikat), die aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden (siehe Materialtabelle).

1. Versuchsvorbereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll benötigt ~ 11 h für einen einzelnen Forscher. Es wird dringend empfohlen, die Tischeinrichtung (Abbildung 1), die Puffervorbereitung (Tabelle 1), die Vorkühlung von Zentrifugen und Rotoren auf 4 °C und die Sammlung und Kennzeichnung der erforderlichen Materialien und Ausrüstungen (siehe Materialtabelle) am Tag vor der Protokollausführung abzuschließen.

Abbildung 1: Tischaufbau. Vor den Hirndissektionen wurden (A) Dounce-Glashomogenisatoren und (B) alle Puffer auf Eis gekühlt. (C) Proteaseinhibitor-Stammlösungen wurden auf Eis aufgetaut. Ein zweiter Behälter mit Nasseis für Zentrifugenröhrchen, ein Dewar flüssiger Stickstoff (nicht gezeigt) und (D) ein Behälter Trockeneis zur kurzfristigen Lagerung der in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Proben wurden erhalten. (E) Mikrozentrifugenröhrchen wurden für alle Proben vormarkiert, da während dieses Verfahrens vier Aliquots jeder subzellulären Fraktionsprobe pro Genotyp oder Zustand gesammelt wurden (zeitsparender Tipp: Markieren Sie alle Röhrchen am Tag vor der Durchführung des Experiments gründlich). (F) Ein geeigneter Abfallbehälter für biologische Gefährdung, (G) 70% Ethanol, (H) chirurgische Instrumente und (I) ein absorbierendes Oberflächenpolster. Die erforderlichen Zentrifugenröhrchen und Einwegartikel wurden für einen effizienten Zugriff während der Protokollimplementierung beiseite gelegt (nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Bereiten Sie die Tischplatte für die Operation vor und sammeln Sie die Schere und Pinzette, die für die Entfernung des Gehirns erforderlich sind (siehe Materialtabelle). Voretikettierung von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für Mausschwanzbiopsien und vier Röhrchen pro gesammelter Fraktion, wie in Abbildung 2 dargestellt.
2. Besorgen Sie sich zwei Behälter mit nassem Eis, einen Behälter mit Trockeneis und einen Dewar-Tischkolben mit flüssigem Stickstoff.
3. Auftauen von Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Pepstatin A, Aprotinin und Leupeptin-Stammlösungen auf Eis (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie die erforderlichen Puffer vor (Tabelle 1).
   HINWEIS: Saccharoselösungen können im Voraus zubereitet und bei 4 °C gelagert werden. Aufgrund der Instabilität dieser Reagenzien in wässrigen Lösungen müssen jedoch zu Beginn des Versuchs allen Puffern frisch Proteaseinhibitoren (aufgetaute Brühen und Tabletten) zugesetzt werden. Darüber hinaus müssen alle Puffer mit waschmittelfreien Glaswaren und waschmittelfreiem Wasser vorbereitet werden, um die Sammlung intakter Synaptosomen zu ermöglichen.
4. Kühlen Sie alle Puffer und Glas-Dounce-Homogenisatoren (siehe Materialtabelle) auf Eis. Stellen Sie die Zentrifugen auf 4 °C ein und kühlen Sie die Rotoren auf 4 °C.
5. 14 ml Puffer A (Tabelle 1) in einen Dounce-Homogenisator auf Eis geben.

Tabelle 1: Zusammensetzung der subzellulären Fraktionierungspuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 2: Überblick über das subzelluläre Fraktionierungsprotokoll. Zusammenfassendes Schema der subzellulären Fraktionierungsschritte und der gesammelten Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Exzision des Gehirns der Maus

Abbildung 3: Kraniofaziale Anatomie . (A) Dorsale Ansicht eines Mausschädels mit relevanten Schädelstrukturen. (B) Linke Seitenansicht eines Mausschädels und Gehirns mit relevanten Schädelstrukturen und anatomischen Richtungen. Die gestrichelten Linien stellen die Stellen dar, an denen Einschnitte gemacht werden sollten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Betäuben Sie jede Maus mit 100% Isofluoran in einer Anästhesiekammer, die sich in einem Abzug oder einer Biosicherheitswerkbank befindet, unter Verwendung einer offenen Tropfenmethode³⁴. Opfern Sie jede Maus durch Luxation der Halswirbelsäule, gefolgt von einer schnellen Enthauptung. Wechseln Sie zwischen Genotypen oder experimentellen Gruppen für jedes Opfer und Dissektion¹². Erhalten Sie Schwanzbiopsien nach Euthanasie, indem Sie 2 mm der distalen Schwanzspitze mit einer feinen Schere herausschneiden. Lagern Sie das Gewebe für die Genotypisierung.
2. Besprühen Sie den enthaupteten Kopf mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass das Haar während der Dissektion am Gewebe und an den chirurgischen Instrumenten haftet.
3. Führen Sie eine feine Schere unter die Haut am Enthauptungsschnitt bis in eine perikranielle Tiefe ein und machen Sie einen midsagittalen Schnitt bis zur Internasalnaht (Abbildung 3A), um die Kopfhaut vom Schädel zurückzuziehen.
4. Arbeiten Sie vom Hinterhauptsbereich zu jedem zeitlichen Aspekt und trimmen Sie die Faszie und den Muskel, um die äußere Oberfläche des Schädels hinter jedem äußeren akustischen Meatus freizulegen (Abbildung 3B).
5. Sichern Sie die Kopfhaut und den rostralen Aspekt des Schädels mit der nicht dominanten Hand. Mit der anderen führen Sie eine feine Schere 2 mm in die kaudale Seite des Foramen magnum ein, wo das Rückenmark sichtbar austritt. Machen Sie einen Mittellinienschnitt, bis die Schere die innere Oberfläche des intraparietalen Knochens erreicht (Abbildung 3; gestrichelte Linien).
   HINWEIS: Während des ersten Einschnitts muss die Schere parallel zum Rückenmark mit Druck auf die innere Oberfläche des Schädels ausgeübt werden, um eine Schädigung des Hirnstamms und des Kleinhirns zu vermeiden.
6. Ändern Sie den Winkel der Schere, so dass die Klingen parallel zur dorsalen Oberfläche des Schädels verlaufen. Fahren Sie den midsagittalen Schnitt rostral durch die parietalen und frontalen Knochen fort, wobei Sie die sagittalen und interfrontalen Nähte als Leitfaden verwenden. Verwenden Sie konstanten Druck nach oben, um Schäden am Kortex zu vermeiden. Beenden Sie den Schnitt direkt hinter der Internasalnaht (Abbildung 3A).
7. Machen Sie einen kleinen senkrechten Schnitt (~ 3 mm) zum Nasenbein, rostral zur Internasennaht, indem Sie die Schere senkrecht zum Schädel platzieren, wobei jede Klinge an einer Nasen-Prämaxillar-Naht positioniert ist und eine gleichmäßige Naht macht (Abbildung 3; gestrichelte Linien).
   HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert das Zurückziehen des Schädels und ist entscheidend für das Sammeln des Riechkolbens, wenn dieser Bereich von Interesse ist.
8. Während Sie den rostralen Aspekt sichern, verwenden Sie eine Seite einer texturierten Pinzette, um den Schädel sanft vom Gehirn nach oben zu heben, dann seitlich und ventral. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf entlang der Mittellinie, dann für die andere Hemisphäre, bis die gesamte Gehirnoberfläche freigelegt ist.
9. Heben Sie mit einer gebogenen Pinzette oder einem feinen Spatel die rostrale Seite des Gehirns sanft an. Schneiden Sie die Seh- und Hirnnerven ab, um die Entfernung aus dem Schädel abzuschließen.
10. Sammeln Sie für jede Bedingung fünf bis acht Mäusegehirne zusammen in den gekühlten Dounce-Homogenisator aus Glas, der 14 ml Puffer A enthält (Tabelle 1).

3. Synaptosomenpräparat

Hinweis: Die schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 4: Synaptosomenpräparat. Schematische Darstellung von Schritt 3, der Erzeugung von Synaptosomen (P2'). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem Glas-Dounce-Homogenisator in 12 Auf-Ab-Durchgängen bei 500 U/min (insgesamt). Bei jedem Abwärtsschlag kurz pausieren, um eine gründliche Homogenisierung des Gewebes zu gewährleisten. Vorzugsweise im Eisbad homogenisieren, um eine Erwärmung und Proteindenaturierung zu vermeiden. Nehmen Sie 5 μL Aliquots zur Bestimmung der Proteinkonzentration durch den Bicinchoninsäure-Assay (BCA, siehe Materialtabelle). Nehmen Sie 100 μL Ganzhirn-Lysat-Aliquots für Western Blot (WB). Für diese und alle nachfolgenden Proben (Abbildung 2) sind zwei Aliquots für BCA und zwei Aliquots für WB zu entnehmen. Alle gesammelten Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei −80 °C lagern.
2. Drehen Sie das gesamte Gehirnhomogenat in einem Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden (14 ml) (siehe Materialtabelle) bei 800 x g für 10 min bei 4 °C, um den Überstand (S1) zu erhalten. S1 wird in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und das Pellet (P1) zurückgelassen, das intakte Zellen und Kerne enthält. Vermeiden Sie es, das flauschige, weiße, lose, oberflächliche Pellet zu pipettieren. Nehmen Sie 2 x 5 μL S1 für BCA und 2 x 100 μL S1 für WB.
3. Spin S1 bei 9.000 x g für 15 min bei 4 °C, um den synaptosomalen Überstand (S2) und das rohe Synaptosomenpellet (P2) zu erhalten. Nehmen Sie 2 x 10 μL S2 für BCA und 2 x 500 μL S2 für WB. Entsorgen Sie den Überstand, nachdem Sie Aliquots erhalten haben, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt mit dem Pellet fort.
4. P2 in 3 ml eiskaltem Puffer A mit Proteaseinhibitoren resuspendieren und bei 9.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um den Überstand (S2') und die gewaschenen Synaptosomen (P2') zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie das Pellet.
5. Resuspendieren Sie P2' in 3 ml Puffer A. Vermeiden Sie es, den dunkelroten Teil am Boden des Pellets, der hauptsächlich Mitochondrien enthält, zu resuspendieren. Nehmen Sie 2 x 20 μL P2' für BCA und 2 x 100 μL P2' für WB.
   HINWEIS: Dies kann durch vorsichtiges Pipettenmischen der Kanten und der Oberfläche des Pellets erreicht werden, um die weiß getünchten Synaptosomen zu resuspendieren, während die Pipettenspitze von der roten Mitte des Pellets weggeleitet wird.

4. Hypotonische Lyse

HINWEIS: Die schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in Abbildung 5 dargestellt.

Abbildung 5: Hypotonische Lyse. Schematische Darstellung von Schritt 4, der hypotonen Lyse von Synaptosomen zur Erzeugung des Lyseüberstands (LS1) und der synaptosomalen Membranfraktionen (LP1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Für die hypotonische Lyse von gewaschenen Synaptosomen fügen Sie 9 Volumen gekühlten Puffer B (Tabelle 1) zu resuspendiertem P2' (~ 27 ml) hinzu. Homogenisieren Sie die Synaptosomen in einem Glas-Dounce-Homogenisator (drei Auf-Ab-Durchgänge bei 500 U/min).
2. Die Proben werden in 50 ml verschlossene konische Zentrifugenröhrchen überführt. Drehen Sie sie auf einem Rohrrevolver in einem 4 °C kalten Raum für 15 min.
3. Die Zentrifuge lysierte P2' bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C, um den Lyseüberstand (LS1) und das Lysepellet mit synaptosomalen Membranen (LP1) zu erhalten. Nehmen Sie 2 x 50 μL LS1 für BCA und 2 x 400 μL LS1 für WB. LS1 wird zur Ultrazentrifugation in ein verschlossenes Zentrifugenröhrchen überführt (siehe Materialtabelle).

5. Synaptische Vesikelisolierung

HINWEIS: Die schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 6: Synaptische Vesikelisolierung und synaptische Plasmamembranisolierung. (A) Schematische Darstellung von Schritt 5, der Isolierung von synaptischen Zytosol- (LS2) und synaptischen Vesikelfraktionen (LP2) und (B) Schritt 6, der Erzeugung von Myelin (MF), synaptischer Plasmamembran (SPM) und mitochondrialer (Mito.) Fraktionen nach der Ultrazentrifugation von Saccharosegradienten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Zentrifuge LS1 in einem Festwinkel-Ultrazentrifugenrotor (siehe Materialtabelle) bei 100.000 x g für 60 min bei 4 °C, um synaptischen Zytosolüberstand (LS2) und synaptisches Vesikelpellet (LP2) zu erhalten. LP2 ist klein, durchscheinend und haftet stark an der Seite des Zentrifugenröhrchens.
2. Resuspendieren Sie LP2 in 500 μL Puffer A. Scheren Sie LP2 mit einer 23-G-Nadel und einer 1-ml-Spritze mit sanftem Reiben. Nehmen Sie 2 x 10 μL LP2 für BCA und 2 x 250 μL LP2 für WB.
3. Transfer von LS2 (~30 ml) zu Zentrifugalfiltereinheiten mit einem Cutoff von 10 kDa (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Wenn Proteine kleiner als 10 kDa von Interesse sind, stehen 4 kDa Cutoff-Zentrifugalfiltereinheiten zur Verfügung, die jedoch zu längeren Schleuderzeiten führen.
4. LS2 auf ca. 0,5 ml durch Schleudern bei 5000 x g für bis zu 1 h bei 4 °C konzentrieren. Nehmen Sie 2 x 10 μL konzentriertes LS2 für BCA und 2 x 250 μL konzentriertes LS2 für WB. Nachdem Sie den Spin gestartet haben, fahren Sie direkt mit Schritt 6.1 fort.

6. Synaptische Plasmamembranisolierung

1. Resuspendieren Sie LP1 (Schritt 4.3) in 1 ml Puffer B (Tabelle 1). Nehmen Sie 2 x 10 μL LP1 für BCA und 2 x 50 μL LP1 für WB. Das verbleibende LP1 wird auf ein Endvolumen von 7,5 ml und eine endgültige Saccharosekonzentration von 1,1 M mit Puffer B und Puffer C eingestellt (Tabelle 1).
2. 7,5 ml resuspendiertes LP1 in ein 14-ml-Ultrazentrifugenröhrchen überführen (siehe Materialtabelle). Überlagern Sie LP1 vorsichtig mit 3,75 ml Puffer D (Tabelle 1) und dann mit 1,25 ml Puffer A (oder einem größeren Volumen direkt unter der Oberseite des Zentrifugenröhrchens). Vermeiden Sie das Pipettieren an der Seite des Röhrchens, da dies die Schnittstellen des Saccharosegradienten stört. Nachdem Sie jede Saccharosefraktion überlagert haben, markieren Sie die Oberseite der Lösung mit einem Stift. Balancieren Sie die Röhrchen für die Ultrazentrifugation nach Gewicht, nicht nach Volumen, mit der tropfenweisen Zugabe von Puffer A auf 10 mg. Zentrifuge bei 48.000 x g für 2,5 h bei 4 °C in einem schwingenden Schaufel-Ultrazentrifugenrotor (siehe Materialtabelle).
3. Nehmen Sie Bilder der intakten Gradienten nach der Ultrazentrifugation auf, um die Unterscheidbarkeit jeder Saccharose-Grenzfläche und den Erfolg der Fraktionierung zu dokumentieren.
4. Entfernen Sie vorsichtig die oberflächliche Schicht von 320 mM Saccharose (Puffer A). Rückgewinnung der Myelinfraktion (MF) an der 320 mM/855 mM Saccharose-Grenzfläche in einem Volumen von 800 μL. Rückgewinnung der synaptischen Plasmamembranfraktion (SPM) an der 855 mM/1,1 M Saccharose-Grenzfläche in einem Volumen von 1.000 μL. Pipettieren Sie jede Fraktion kreisförmig von der Rohrwand, um sicherzustellen, dass die gesamte Fraktion gesammelt wird. Die restliche Saccharose vorsichtig absaugen und das mitochondriale Pellet (Mito.) durch Resuspendieren von 200 μL Puffer B zurückgewinnen. Nehmen Sie 2 x 100 μL MF für BCA und 2 x 10 μL Mito. für BCA; Teilen Sie den Rest von MF und Mito. Proben in der Hälfte für WB.
5. Verdünnen Sie die SPM-Fraktion mit 2 Volumen Puffer B (~ 2 ml) und zentrifugieren Sie dann in einem Rotor mit festem Winkel in einem 3,5-ml-Zentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) bei 25.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Der Überstand wird verworfen und das SPM-Pellet in Puffer A für ein Endvolumen von 250 μL resuspendiert. Nehmen Sie 2 x 5 μL SPM für BCA und teilen Sie den restlichen SPM in zwei Hälften für WB.
6. Führen Sie einen BCA durch, um die Proteinkonzentration jeder Probe unter Berücksichtigung des variablen aliquoten Volumens zu bestimmen.
   HINWEIS: Für die WB-Analyse beträgt die empfohlene Arbeitsproteinkonzentration für alle subzellulären Fraktionen 2 μg/μL (oder so hoch wie für LS1 und MF erreichbar).

Results

Die vorgestellte Methode führt zu 11 subzellulären Hirnfraktionen, die einer weiteren Reinigung und verschiedenen Formen der nachgeschalteten Analyse unterzogen werden können^35,36. Die Goldstandardmethode zur Beurteilung der Qualität von Synaptosomen, SVs²³ und anderen Komponenten ist die Elektronenmikroskopie (EM) (Abbildung 7). Quantitatives Immunoblotting für Proteine, die in bestimmten subzellulären Fraktionen vorhanden sind, kann auch durchgeführt werden, um Marker der Fraktionsreinheit zu bewerten (Abbildung 8). Zum Beispiel zeigt die Immunoblot-Analyse von Fraktionen die Anreicherung von N-Cadherin (CDH2, UniProt-Name) in der synaptischen Plasmamembranfraktion (SPM), α-Synuclein (SYUA) im synaptischen Zytosol (LS2), Synaptophysin (SYPH) in der synaptischen Vesikelfraktion (LP2) und Myelin-Basisprotein (MBP) in der Myelinfraktion (MF) im Vergleich zu Proteinspiegeln im anfänglichen Ganzhirnhomogenat (Gesamt) (Abbildung 8 ). Sobald die Fraktionsreinheit festgestellt wurde (z. B. das Fehlen von CDH2 in der LS2-Fraktion oder der vielfache Anstieg von SYPH in der LP2-Fraktion), kann die quantitative Immunoblottierung verwendet werden, um die Lokalisierung von Proteinen von Interesse zu bestimmen oder Unterschiede in der Proteinverteilung zwischen Genotypen oder Behandlungen abzufragen. Das Verständnis der subzellulären Lokalisation synaptischer Proteine kann die Dissektion bisher unbeschriebener Proteinfunktionen ermöglichen. Darüber hinaus kann diese Methode Transportdefekte oder synaptische Dysfunktion in Krankheitszuständen aufklären, insbesondere in Kombination mit funktionellen Assays. Zum Beispiel hat unser Team mit dieser Methode einen Pool enzymatisch aktiver Palmitoylprotein-Thioesterase 1 identifiziert, der im synaptischen Zytosol¹⁹ angereichert ist.

Abbildung 7: Elektronenmikroskopie (EM) von Synaptosomen. (A) Repräsentatives EM-Bild eines Synaptosoms, das synaptische Vesikel enthält (Pfeil). (B) Repräsentatives EM-Bild eines Synaptosoms mit prä- (Pfeil) und postsynaptischen Komponenten (Doppelpfeil). (C) Repräsentative EM-Aufnahme eines Synaptosoms mit synaptischen Vesikeln und einem Mitochondrium (Pfeil) (Maßstabsbalken = 100 nm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Immunoblot-Analyse subzellulärer Fraktionen. (A) Marker der subzellulären Fraktionsreinheit (angegeben mit UniProt-Nomenklatur) sind im Vergleich zum gesamten Hirnhomogenat (insgesamt) angemessen lokalisiert: N-Cadherin (CDH2) in der synaptischen Plasmamembranfraktion (SPM), Synaptophysin 1 (SYPH) und Synaptojanin 1 (SYNJ1) in der synaptischen vesikelangereicherten Fraktion (LP2), α-Synuclein (SYUA) im synaptischen Zytosol (LS2), und Myelin-Basisprotein (MBP) in der Myelinfraktion (MF). (B) Die Immunoblot-Quantifizierungsanalyse zeigt die Anreicherung (Faltenänderung von der Gesamtmenge) von Fraktionsreinheitsmarkern. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung auf einer log10-Skala dargestellt. Die gestrichelte Linie zeigt eine 1,5-fache Veränderung (y = 0,176) (n = 3 Wiederholungsexperimente mit 8 Wildtyp-Mäusen; Alter = 2 Monate; n = 4-5 Blots für SYPH, SYUA, MBP, mit n = 3 zuvor von Gorenberg et ^al.19 veröffentlichten geplotteten Werten; n = 5 für SYNJ1; n = 1 für CDH2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

In ihren wegweisenden Studien verwendeten Whittaker und Kollegen vier morphologische Kriterien, um Synaptosomen zu identifizieren: (1) die Strukturen haben eine versiegelte Plasmamembran; (2) die Strukturen enthalten SVs, die denen in Nervenendigungen und Krampfadern in situ in Größe und Anzahl ähneln; (3) die Strukturen besitzen eine oder mehrere kleine Mitochondrien; und (4) die präsynaptische Membran wird häufig an eine postsynaptische Komponente^11,12,13 geklebt. Obwohl die ersten beiden Kriterien im Allgemeinen für jede Isolationsmethode gelten, haben in den neuesten in diesem Artikel beschriebenen Protokollen nicht alle resultierenden Synaptosomen Mitochondrien und angehängte postsynaptische Terminals. Ungefähr 60% der Synaptosomen werden Mitochondrien haben, und nur bis zu 15% haben schätzungsweise postsynaptische Terminals³⁷. Wenn postsynaptische Komponenten von besonderem Interesse sind, ist bekannt, dass die Verwendung eines isotonischen Krebs-ähnlichen Homogenisierungspuffers und eine Druckfiltration zur Anreicherung hohe Konzentrationen von Synaptosomen mit postsynaptischen Terminals (auch Synaptoneurosomen genannt) ^ergeben22,38.

Die Methode, das Tier zu opfern, kann die Qualität von Synaptosomen und synaptischen Unterfraktionen beeinflussen. Erwachsene Tiere, die mit einer Euthanasiemethode geopfert werden, die keine Anästhesie erfordert, führen zu der besten Fraktionsqualität. Ferner sollten die Gehirne frisch seziert, nicht eingefroren und unter Verwendung eines Homogenisierungspuffers (Gewicht/Volumen) im Verhältnis 1:10 für die lebensfähigsten synaptischen Fraktionen^{homogenisiert werden 22}. Das Gehirn hat eine heterogene Population von Synapsen, die durch die Art der Neurotransmitter, die sie tragen, unterschieden werden können. Die Synaptosomenbildung wird im Allgemeinen nicht durch den Synapsentyp oder den Neurotransmittergehalt beeinflusst¹³. Eine Ausnahme bilden moosige Fasern im Kleinhirn, von denen bekannt ist, dass sie unter optimalen Bedingungen zur Gewinnung von Synaptosomen aus dem Rest des Gehirns gestört sind^39,40. Daher wird die Entfernung des Kleinhirns vor der Homogenisierung des Gehirns empfohlen, wenn der Ausschluss dieser Region das experimentelle Ziel nicht beeinträchtigt. Wenn man daran interessiert ist, Synaptosomen eines bestimmten Neurotransmittercharakters zu isolieren, können zunächst Bereiche des Gehirns isoliert werden, die für Neuronen angereichert sind, die den interessierenden Neurotransmitter enthalten. Dieser Ansatz wird jedoch den endgültigen Bruchertrag in Abhängigkeit von der Größe der interessierenden Region begrenzen (das Alter der Tiere ist daher ebenfalls eine Überlegung). Es gibt immunchemische Methoden zur Isolierung von Neurotransmitter-spezifischen Synaptosomen, aber die Lebensfähigkeit und Ausbeute wird erheblich beeinträchtigt²². Wenn die Beurteilung der metabolischen Lebensfähigkeit von Synaptosomen wichtig ist, kann die Messung der Neurotransmitterfreisetzung ^41,42 oder bestimmte enzymatische Assays⁴³ verwendet werden.

Häufige Verunreinigungen in Synaptosomenpräparaten sind Mikrosomen, freie Mitochondrien, SVs sowie neuronale und Gliamembranen. Die Kontamination kann reduziert werden, indem die Anzahl der Waschgänge bei den Fraktionen P1 und P2²² erhöht und eine Resuspension des roten mitochondrialen Pellets in nachfolgenden Schritten vermieden wird. In Experimenten, bei denen metabolische Lebensfähigkeit und Zeit entscheidend sind, ist es hilfreich, die Anzahl der Wäschen zu reduzieren und Ficoll- oder Percoll-Gradienten über Saccharosegradienten zu verwenden^44,45,46. Diese Methoden reduzieren auch die Kontamination erheblich. Whittakers ursprüngliches Protokoll ergab qualitativ hochwertige SVs. Eine weitere Optimierung durch Nagy et ^al.23, die in dieser Methode enthalten ist, erzeugt SVs mit bemerkenswerter Homogenität und Reinheit, ohne signifikante Kompromisse bei der Ausbeute³⁶ einzugehen. Wenn spezifische SV-Subtypen von Interesse sind, wie glutamaterge (VGLUT-1-enthaltende) oder GABAerge (VGAT-1-enthaltende) SVs, kann eine Immunisolierung mit spezifischen Antikörpern durchgeführt werden^47,48. Es stehen auch alternative Methoden zur Isolierung von CCVs aus Synaptosomen zur Verfügung, die aufgrund der differentiellen Dichte möglicherweise nicht an derselben Grenzfläche vorhanden sind wie SVs, die mit dieser Methode^20,49,50 erhalten werden.

Insgesamt kann das vorliegende Protokoll zur Isolierung synaptischer Komponenten weiter optimiert werden, um Fraktionen mit verbesserter Homogenität und Lebensfähigkeit basierend auf der Qualität und Quantität des Quellhirngewebes und den experimentellen Zielen zu erhalten. Für weitere Details zur Fehlerbehebung sollte man sich auf die Buchkapitel von Dunkley und Robinson²² und Ganzella et ^al.36 beziehen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL TB Spritze	BD	309649
1,5 mL Eppendorf Tubes	USA Scientific	1415-2500
14 mL, Open-Top Thinwall, Ultra-Clear Tube	Beckman Coulter	344060	Kompatibel mit SW 40 Ti
23 Gauge Precision Glide Injektionsnadel	BD	305145
26,3 mL, Polycarbonatflasche mit Verschlussbaugruppe	Beckman Coulter	355618	Kompatibel mit Ti70
3,5 ml, Dickwandiges Polypropylen-Rohr	Beckman Coulter	349623	Kompatibel mit TLA-100.3
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit	Millipore Sigma	UFC901024
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	1 mg/ml in diH2O
Avanti J-26 XP Zentrifuge	Beckman Schar	B22984	< 26.000 U/min
Tischgerät HDPE Dewargefäß	Thermo Scientific	5028U19
C57BL/6J Mäuse	The Jackson Labs	000664
Zentrifuge 5810R	Eppendorf	EP022628168	< 14.000 U/min
kompletter, EDTA-freier Mini-Proteasehemmer Cocktail-Tabletten	Roche	11873580001	1 Tablette pro 50 ml Lösung hinzufügen
Gebogene Pinzette	Fine Science Tools	11273-20
Feine chirurgische Schere	Fine Science Tools	8r
Glas-Col Gewebe-Homogenisierungssystem	Cole-Parmer	UX-04369-15
Graefe Pinzette	Fine Science Tools	11650-10
Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit rundem Boden	ThermoFisher	3117-0500	Kompatibel mit JA20
Isofluoran	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
JA-20 Rotor	Beckman Coulter	334831
Leupeptin	American Bio	AB01108	1 mg/mL in diH2
O N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES)	American Bio	AB00892
Optima L-80 XP Ultrazentrifuge	Beckman Coulter		< 100.000 U/min
Optima TLX Ultrazentrifuge	Beckman Schar		< 120.000 U/min
Pepstatin A	Thermo Scientific	78436	1 mg/ml in DMSO
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	American Bio	AB01620
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23335	Zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Pipettenspitzen
Serologische Pipetten
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Chirurgische Schere	Fine Science Tools	14002-12
SW 40 Ti Schwingschaufelrotor	Beckman Schar	331301
teflonbeschichteter Stößel und Mörser Gewebeschleifer	Thomas Scientific	3431D94
Ti70 Rotor	Beckman Schar	337922
TLA-100.3 Rotor	Beckman Schar	349490
Rohrrevolver	Dot Scientific	DTR-02VS