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Chromatin ist eine dynamische, flüssige Struktur, die sowohl durch Protein-DNA als auch durch Protein-Protein-Wechselwirkungen aufrechterhalten wird. Sowohl Histon- als auch Nicht-Histonproteine sind an der Aufrechterhaltung der Chromatinstruktur beteiligt. Wie werden diese Wechselwirkungen vermittelt und wie verändert sich die Chromatinstruktur bei Prozessen, an denen DNA als Substrat beteiligt ist?
Viele Techniken wurden entwickelt, um die Dynamik von Protein-DNA sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen zu beleuchten. Dazu gehören sowohl biophysikalische Techniken wie die CD-Spektroskopie als auch biochemische Methoden wie die Gelfiltrationschromatographie. Diese Sammlung hebt einige dieser Techniken hervor, die zur Erforschung der Dynamik der Chromatinarchitektur verwendet werden können.
Die DNA-Integrität kann durch Durchflusszytometer (FACS) analysiert werden, und Ling et al.1 adaptieren diese Methode, um funktionelle Defekte menschlicher Spermien zu erkennen. Die Physiologie der Spermien kann anhand von Biomarkern wie DNA-Schäden, mitochondrialem Membranpotenzial und Spermienapoptose beurteilt werden. Ling et al. zeigen, dass FACS leicht angepasst werden kann, um jeden dieser Parameter zu überwachen, um die Physiologie der Spermien zu beurteilen, und zeigen damit, dass die Technik ein praktisches und zuverlässiges Instrumentarium für die Diagnose männlicher Unfruchtbarkeit ist.
Die CD-Spektroskopie ist möglicherweise eine der einfachsten Methoden, um die Konformation von Protein und DNA zu untersuchen. Jeder Konformer der DNA hat ein charakteristisches Bandenmuster. Die Änderung des Bandenmusters kann mit der Änderung der Konformation der DNA korreliert werden, und somit kann die Verschiebung in der DNA-Architektur in Gegenwart von interagierenden Proteinen mit Hilfe eines CD-Spektralphotometers überwacht werden. Arya et al.2 verwenden diese Technik, um Veränderungen in der DNA zu untersuchen, die durch Interaktion mit dem ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Protein SMARCAL1 in Abwesenheit und Anwesenheit von ATP induziert werden. Sie zeigen, dass die Veränderungen in der DNA-Struktur mit der transkriptionellen Aktivität des Proteins korreliert werden können.
Größenausschlusschromatographie und Pull-Down-Assays werden routinemäßig zur Überwachung von Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Die Assemblierung der Nukleosomen wird durch Histon-Chaperone erleichtert, die an Histone binden. Bobde et al.3 beschreiben Methoden und Assays, mit denen identifiziert werden kann, ob eine bestimmte Proteinfunktion ein Histon-Chaperon ist oder nicht.
Wie untersuchen wir die Mechanismen des Nukleosomenaufbaus in Echtzeit? Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren wie der DNA-Vorhang wurden entwickelt, um den Assemblierungsprozess in Echtzeit zu visualisieren. Der DNA-Vorhang ist eine Hybridtechnik, die Lipidfluidität, Mikrofluidik und Totalreflexionsmikroskopie kombiniert, um die Protein-DNA-Interaktion in Echtzeit abzubilden. Kang et al.4 beschreiben den DNA-Vorhang als eine Technik, um den Mechanismus zu untersuchen, der der Assemblierung des Histon-Chaperons Abo1 aus S. pombe zugrunde liegt. Die beschriebenen Techniken bieten eine Möglichkeit, die Chromatindynamik zu untersuchen, die sowohl für die genomische Stabilität als auch für die epigenetische Regulation von Prozessen mit dem genetischen Material eine wichtige Rolle spielt.
Die traditionelle Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) erfordert spezifische Antikörper gegen das gewünschte Protein. Oft sind die Antikörper nicht spezifisch genug, was zu falsch positiven Ergebnissen führt, insbesondere bei der Untersuchung der Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren. Auch sind Antikörper für Proteine nicht immer in allen Organismen verfügbar. Candida albicans ist einer dieser Organismen, für den keine Antikörper verfügbar sind. Die Cut and Run-Methode umgeht diese Einschränkungen, indem sie MNase mit dem interessierenden Transkriptionsfaktor fusioniert. Qasim et al.5 beschreiben die Verwendung dieser Methode zur Bestimmung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren in C. albicans.
Die in dieser Sammlung beschriebenen Methoden geben einen Einblick in die Techniken, die Forschern zur Verfügung stehen. Alle diese Methoden sind vielseitig und leicht anpassbar, um die Fragen zu beantworten, die Forscher stellen.