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Methodenartikel

Intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Knochenmetastasierungs-Xenograft-Mausmodells

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DOI:

10.3791/64589

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4. November 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 3Institute of Chinese Traditional Surgery, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die intrakardiale Injektion von humanen Prostatakrebszellen vor, um ein Mausmodell mit Knochenmetastasenläsionen zu erzeugen.

Zusammenfassung

Als häufigste bösartige Erkrankung bei Männern steht Prostatakrebs (PC) an zweiter Stelle bei der Mortalität, was vor allem auf eine Knochenmetastasierungsrate von 65 % bis 75 % zurückzuführen ist. Daher ist es wichtig, den Prozess und die damit verbundenen Mechanismen der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs zu verstehen, um neue Therapeutika zu entwickeln. Hierfür ist ein Tiermodell der Knochenmetastasierung ein wesentliches Werkzeug. Hier berichten wir über detaillierte Verfahren zur Erzeugung eines Knochenmetastasen-Mausmodells durch intrakardiale Injektion von Prostatakrebszellen. Ein Biolumineszenz-Bildgebungssystem kann feststellen, ob Prostatakrebszellen genau in das Herz injiziert wurden, und die Metastasierung von Krebszellen überwachen, da es große Vorteile bei der Überwachung der Entwicklung metastasierender Läsionen hat. Dieses Modell bildet die natürliche Entwicklung von disseminierten Krebszellen zu Mikrometastasen im Knochen nach und imitiert den pathologischen Prozess der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs. Es bietet ein effektives Werkzeug für die weitere Erforschung der molekularen Mechanismen und der therapeutischen Wirkungen dieser Krankheit.

Einleitung

Prostatakrebs ist in 112 Ländern die häufigste Krebserkrankung bei Männern und steht in Ländern mit höherem Index der menschlichen Entwicklungan zweiter Stelle bei der Sterblichkeit 1,2. Die meisten Todesfälle bei Prostatakrebspatienten werden durch Metastasen verursacht, und etwa 65%-75% der Fälle entwickeln Knochenmetastasen 3,4. Daher sind Prävention und Behandlung von Knochenmetastasen bei Prostatakrebs dringend erforderlich, um das klinische Ergebnis von Prostatakrebspatienten zu verbessern. Das Tiermodell der Knochenmetastasierung ist ein unverzichtbares Werkzeug, um den mehrstufigen Prozess und die molekularen Mechanismen zu erforschen, die in jedem Stadium der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs beteiligt sind, um so therapeutische Ziele zu identifizieren und neue Therapeutika zu entwickeln5.

Zu den gebräuchlichsten Methoden zur Erzeugung von experimentellen Tiermodellen für Prostatakrebs-Knochenmetastasen gehören die orthotope, intradiaphysische (z. B. intratibiale) und intrakardiale Injektion von Prostatakrebszellen. Das Knochenmetastasenmodell mit orthotoper Injektion wird durch direkte Injektion von Prostatakrebszellen in die Prostata einer Maus erzeugt 6,7. Dieses experimentelle Tiermodell hat sehr ähnliche klinische Merkmale wie die Knochenmetastasierung von Prostatakrebs. Die Metastasierung findet jedoch hauptsächlich im axillären Lymphknoten und in der Lunge statt im Knochen statt 8,9. Das intratibiale Injektionsmodell für Prostatakrebs injiziert Prostatakrebszellen direkt in die Tibia mit einer hohen Tumorbildungsrate im Knochen (Tibia)10,11; Die Knochenrinde und die Knochenmarkhöhle können jedoch leicht beschädigt werden. Darüber hinaus kann die tibiale Injektionsmethode den pathologischen Prozess der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs, bei dem die Krebszellen den Knochen durch den Kreislauf besiedeln, nicht stimulieren. Um die Durchblutung, die vaskuläre Paravasation und die Fernmetastasierung bei einer höheren Knochenmetastasierungsrate von Krebszellen zu untersuchen, wurde eine intrakardiale Injektionstechnik entwickelt, bei der Prostatakrebszellen direkt in die linke Herzkammer der Maus injiziert werden 8,12,13. Das macht es zu einem wertvollen Tiermodell für die Knochenmetastasenforschung8. Die intrakardiale Injektionsmethode weist eine Knochenmetastasierungsrate von etwa 75 % auf9,14 auf, was viel höher ist als die orthotope Injektionsmethode. Daher ist die intrakardiale Injektion eine ideale Methode, um ein Tiermodell mit Prostatakrebs-Knochenmetastasen zu erzeugen.

Ziel dieser Arbeit ist es, den Prozess der Etablierung eines Mausmodells für Prostatakrebs-Knochenmetastasen zu beschreiben, das es den Lesern ermöglicht, die Modelletablierung zu visualisieren. Die vorliegende Arbeit liefert detaillierte Prozesse, Vorsichtsmaßnahmen und anschauliche Bilder zur Erzeugung eines Knochenmetastasen-Xenotransplantatmodells durch intrakardiale Injektion von humanen Prostatakrebszellen in athymischen Mäusen. Diese Methode bietet ein effektives Werkzeug, um die molekularen Mechanismen und die therapeutischen Effekte von Prostatakrebs-Knochenmetastasen in vivo weiter zu erforschen.

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Protokoll

Sechs bis acht Wochen alte männliche athymische BALB/c-Mäuse (n = 10) wurden in individuell belüfteten Mäusekäfigen (5 Mäuse/Käfig) in einem spezifisch-pathogenfreien (SPF) Tierraum unter den Bedingungen eines 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu SPF-Futter und sterilem Wasser untergebracht. Die Mäuse wurden vor den Experimenten eine Woche lang adaptiv gefüttert. Alle Tierversuche wurden vom Tierschutzausschuss der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigt.

1. Zellvorbereitung

  1. Waschen Sie am Tag der Injektion von Prostatakrebszellen 80%-90% konfluente mit Luciferase markierte PC-3-Zellen (PC-3-Luciferase), die in einer 10-cm-Zellkulturschale mit vorkaltem, sterilem PBS (pH 7,4) kultiviert wurden, zweimal. Trypsinisieren Sie 3 Minuten lang mit 1,5 ml 0,25%igem Trypsin und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen, nachdem Sie das Trypsin mit 6 ml F-12-Medium mit 10 % Serum abgeschreckt haben.
    HINWEIS: Die PC-3-Luciferase-Zelllinie wird von der PC-3-Zelllinie abgeleitet, nachdem sie mit dem pLV-Luciferase-Vektor15 transfiziert wurde.
  2. Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler und berechnen Sie die Zellkonzentration, indem Sie 20 μl der Zellsuspension auf die Zellzählplatte übertragen (siehe Materialtabelle).
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
  4. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in F-12-Medium (siehe Materialtabelle) auf eine endgültige Zelldichte von 1 x 107 Zellen/ml.
  5. Bewahren Sie die Zellen bis zur Injektion immer auf Eis auf.
  6. Bringen Sie die Zellen in den Operationssaal und beenden Sie die Zellinjektion innerhalb von 2 Stunden.
    HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche Zellsuspensionen vor (in der Regel das doppelte Volumen nach Bedarf), um eine genaue Injektionsdosis zu gewährleisten (z. B. um die Toträume in den Spritzen zu vermeiden).

2. Operation zur intrakardialen Injektion der menschlichen Prostatakrebszellen

HINWEIS: Das chirurgische Gerät, das für die intrakardiale Injektion verwendet wird, ist eine 1-ml-Spritze (Abbildung 1). Unterstützen Sie das Tier während des gesamten Eingriffs bis zur Genesung von der Narkose.

  1. Bewahren Sie die Maus im Tierzimmer mit Lichtschutzfaktor auf. Führen Sie alle Verfahren mit sterilisierten Geräten in einem aseptischen Schrank durch.
  2. Anästhesieren Sie die Maus mit 2 % Isofluran mit 98 % Sauerstoff bei einer Sauerstoffflussrate von 2 l/min.
    Anmerkungen: Schmieren Sie eine kleine Menge Augensalbe auf die Augen der Maus, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. Führen Sie die gesamte Operation in einem gut belüfteten Bereich durch. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief betäubt ist, indem Sie die Zehen der Maus vor der Zellinjektion kneifen. Wenn die Reaktionen (z. B. ein Ruck oder ein Zucken) bestehen bleiben, warten Sie weitere Zeit, bis die Anästhesie wirkt.
  3. Bringen Sie die Maus in eine Supon-Position und immobilisieren Sie beide oberen Gliedmaßen, die senkrecht von der Mittellinie weggestreckt sind (Abbildung 2A).
  4. Immobilisieren Sie die Maus vom Bauch abwärts mit chirurgischem Klebeband. Vermeiden Sie es, stark zu drücken und die inneren Organe zu verschieben (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der topographischen Anatomie (d. h. die Befestigung mit Klebeband) ist unerlässlich, da die intrakardiale Injektion blind ist (d. h. die genaue Injektionsstelle am Herzen ist für das bloße Auge unsichtbar).
  5. Desinfizieren Sie die Haut des Brustkorbs mit einem Tupfer aus 70%igem Ethanol.
  6. Identifizieren Sie den Xipoidfortsatz der Maus in der Vertiefung am untersten Ende des mittleren Brustbeins, indem Sie die Mitte der vorderen Brustwand abtasten. Identifizieren Sie die Halskerbe der Maus in der zentralen Vertiefung am oberen Rand des Manubriums, indem Sie von der Mitte der vorderen Brustwand nach oben tasten.
  7. Beschriften Sie den untersten Punkt des Processus xiphoideus und die Kerbe jugularis mit einem Markierungsstift (Abbildung 2A). Machen Sie eine dritte Markierung in der Mitte dieser beiden Orientierungspunkte und leicht nach rechts (links vom Tier) direkt über dem Herzen im dritten Zwischenrippenraum.
    HINWEIS: Die Injektionsstelle befindet sich 1-2 mm links von der Mittellinie und der Injektionspunkt befindet sich zwischen der dritten und vierten Rippe der Maus (Abbildung 2A).
  8. Geben Sie 200 μl der Zellsuspension in eine 1-ml-Spritze.
    Anmerkungen: Halten Sie eine Luftblase in der Spritze, wie in Abbildung 2C gezeigt, um sicherzustellen, dass das Blut pulsiert. Die Zellsuspension muss vor dem Laden gründlich gemischt werden.
  9. Führen Sie eine 26-G-Nadel vertikal durch die Injektionsstelle ein (Abbildung 2D).
  10. Halten Sie die Hand, die die Spritze hält, stabil auf dem Tisch oder verwenden Sie die andere Hand, um sie stabil zu halten. Achten Sie darauf, dass die Längsachse der Spritze senkrecht zur Injektionsstelle steht, und führen Sie die Spritze etwa 2 mm subkutan ein.
  11. Ein hellrotes Blutpulsieren ist in der Nadelnabe und/oder Zellsuspension sichtbar, wenn die Nadelspitze korrekt in die linke Herzkammer eingeführt wird. Wenn die Blutpulsation unsichtbar ist, befindet sich die Nadelspitze nicht im Herzen. Ziehen Sie die Nadel zurück und setzen Sie sie wieder ein (falls die Blutgerinnung in der Nadel die Blutpulsation stoppt). Stechen Sie die Nadel erneut ein.
  12. Injizieren Sie die Zellen. Injizieren Sie die Zellsuspension (100 μl) sehr langsam über 40-60 s und halten Sie die Hand, die die Spritze hält, die ganze Zeit stabil.
    Anmerkungen: Behalten Sie die Zellsuspension in der Spritze genau im Auge und injizieren Sie die Luftblase in der Spritze nicht in das Herz.
  13. Üben Sie mit einem trockenen Wattestäbchen 15 Sekunden lang Druck auf die Injektionsstelle aus, um die Hämostase zu gewährleisten, wenn die Nadel zurückgezogen wird.
  14. Bringen Sie die Maus in den sauberen Käfig zurück und überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat.
  15. Stellen Sie sich die Maus innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion mit einem In-vivo-Biolumineszenzsystem vor, um sicherzustellen, dass die Krebszellen in den systemischen Kreislauf gelangt sind.
    HINWEIS: Korrekt injizierte Krebszellen gelangen über die linke Herzkammer in den arteriellen Kreislauf, was durch die im ganzen Körper sichtbare Biolumineszenz-Signalübertragung sichtbar ist (siehe Abbildung 3A).
  16. Führen Sie eine In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung durch.
    1. Schalten Sie das Gerät und den Computer ein. Öffnen Sie die Software, wenn die Betriebsanzeige am Gerät und am Computer heller wird, und öffnen Sie dann das Fenster Bildaufnahme .
    2. Identifizieren Sie das mit dem Computer verbundene In-vivo-Bildgebungssystem im Gerätebereich. Legen Sie die Maus, die abgebildet werden soll, in Rückenlage in die Bildkammer. Schließen Sie dann die Tür der Bildkammer.
    3. Legen Sie die Parameter im Bereich "Einstellung" im Fenster "Bildaufnahme" fest.
      1. Stellen Sie die Parameter mit Objektiv > Zoom > 1x, Objektiv > Fokus > 108 und Objektiv > Blende > F 2,8 ein, um die Bilder klar zu machen.
      2. Stellen Sie den Aufnahmekanal unter Filter&Licht ein: Filter&Light > Filter > Lumineszenz, Filter&Light > Light > OFF, und Filter&Light > Lichtintensität > Mitte.
      3. Stellen Sie die Art des aufzunehmenden Bildes ein: Belichtungs- > Typ > Einzelbild, Belichtungs- > Belichtungszeit > 500 ms, Belichtungs- > HDR-Modus > Low-Gain-Modus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um das Bild zu erfassen.
  17. Visualisieren Sie das metastasierende Krebswachstum mit In-vivo-Biolumineszenz .
    HINWEIS: Injizieren Sie zu jedem Zeitpunkt der Visualisierung intraperitoneal 200 μl des Luciferin-Substrats in eine 20 g schwere Maus (150 mg/kg) und warten Sie 15 Minuten vor der Anästhesie (2 % Isofluran gemischt mit 98 % Sauerstoff in einer Induktionskammer). Platzieren Sie die Maus auf der Plattform des Biolumineszenz-Bildgebungssystems. Halten Sie die Anästhesie durch eine Nasenmaske mit 2% Isofluran aufrecht.

3. Pathologische Untersuchung

  1. Vier Wochen nach der Zellinjektion wird die Maus durch CO2 - Inhalation und anschließende Zervixluxation geopfert.
  2. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen vertikalen Schnitt (ca. 6 cm) vom Bauch bis zum Brustkorb, um alle Organe im Bauch und Thorax freizulegen und grob auf krebsartige Läsionen und/oder pathologische Veränderungen zu untersuchen.
    HINWEIS: Bei einer Studie zur intrakardialen Injektion von Krebszellen deuten Krebsläsionen im Mediastinum neben dem Herzen auf falsch injizierte Krebszellen hin (Zellen, die nicht in die linke Herzkammer injiziert werden). Daher werden diese Mäuse nicht in die endgültige Datenerhebung einbezogen.
  3. Entfernen Sie die metastasierenden Tumore mit einer Schere. Messen Sie die langen Durchmesser (a) und kurzen Durchmesser (b) des Tumors mit Messschiebern, um das Tumorvolumen (V) nach der Formel V = 1/2 × a × b2 zu berechnen, und wiegen Sie den Tumor mit einer elektronischen Waage.
  4. Fixieren Sie das Tumorgewebe in 10%iger Formalinlösung und betten Sie es anschließend in Paraffin ein. Alternativ können die Tumore auch in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.
  5. Schneiden Sie die Knochen (Hintergliedmaßen, Wirbel und/oder Rippen) mit metastasierten Läsionen heraus. Fixieren Sie die Probe jeder Maus in einem 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 10%iger Formalinlösung für 24 Stunden nach Entfernung der Haut und der Muskeln, gefolgt von einer 14-tägigen Entkalkung in 10%iger EDTA-Lösung mit häufigem Pufferwechsel (alle 3 Tage).
  6. Die Probe wird in Paraffin eingebettet und die Proben für die histologische Routineuntersuchunggeschnitten 16.

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Ergebnisse

Die Biolumineszenz-Bildgebung bietet enorme Vorteile bei der Überwachung der Entwicklung metastasierender Läsionen für ein intrakardiales Injektionsmodell. Kurz nach der Injektion der Krebszellen (innerhalb von 24 h) wurde die Biolumineszenz-Bildgebung verwendet, um den Eintritt der Krebszellen in den allgemeinen Blutkreislauf sichtbar zu machen (Abbildung 3A). Offensichtliche Biolumineszenz-Signale im ganzen Körper sind zu sehen, wenn die Krebszellen richtig in den arteriellen Kreislauf inj...

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Diskussion

Die intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung von Knochenmetastasen ist ein ideales Mausmodell, um die Funktionen und Mechanismen der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs zu erforschen und die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Studien haben gezeigt, dass Knochenschäden am wahrscheinlichsten in der proximalen Tibia und dem distalen Femurauftreten 17, was auf ihre hohe Vaskularisierung und Stoffwechselaktivität zurückzuführen sein kann.

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Offenlegungen

Alle Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 und 2020YFE0201600), der National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408), der Forschungsprojekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047) und des Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Spritzen und NadelnShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd20200411Die Zellen wurden in die Ventrikel von Mäusen injiziert
AnästhesiemaschineShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR500IPAusrüstung zur Anästhesie von Mäusen
Automatischer ZellzählerShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000  Zum Zählen von Zellen
BALB/c athyme MäuseShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.Männliche6-8 Wochen alte, männliche Mäuse
Biolumineszenz-BildgebungssystemShanghai Baitai Technology Co., LtdVieworksZur Verfolgung des Tumorwachstums und der Lungenmetastasen, wenn die injizierten Zellen mit Luziferase markiert werden
Zentrifugenröhrchen (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning EDTA-Lösung
Wuhan Xavier Biotechnology Co., LtdG1105  Zur Entkalkung von Knochen tissure
F-12 MediumShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd21700075, GIBCOZellkulturmedium
Formalin LösungShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdBL539AZur Fixierung der Probe jeder Maus
IsofluranShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYFür die Anästhesie 
Lipofectamine 2000Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd11668027, Thermo FisherPlasmid-Transfektionsreagenz
PC-3-Zelllinie Zellbankder Chinesischen Akademie der WissenschaftenTCHu 158Prostatakrebs-Zelllinie
Phosphatgepufferte KochsalzlösungBeyotime BiotechnologyST447Waschen Sie die menschlichen Osteosarkomzellen
Trypsin (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co. , Ltd25200056, GibcoZur Ablösung der Zellen
Vektor (pLV-Luciferase)Shanghai YueNian Biotechnology Co., LtdVL3613Plasmid für die Transfektion
RöntgenbildgebungssystemBrook (Beijing) Technology Co., LtdFX PROZur Gewinnung von Röntgenbildern zur Erkennung von Tumorwachstum
μ CT80Shenzhen Fraun Technology Service Co., LtdScanco Medical AG, SchweizZum Nachweis von Knochenzerstörung. Das Mikro-CT ist ausgestattet mit 3DCalc, Konusrekonstruktion,  und μ CT Ray V3.4A Software zur Visualisierung von Modellen.

Referenzen

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