Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.

Abstract

Die Zusammensetzung des Darmmikrobioms kann während der gesamten Entwicklung und des Lebens des Tieres einen dramatischen Einfluss auf die Physiologie des Wirts haben. Die Messung von Veränderungen der Zusammensetzung des Mikrobioms ist entscheidend, um die funktionellen Beziehungen zwischen diesen physiologischen Veränderungen zu identifizieren. Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiges Wirtssystem erwiesen, um die molekularen Treiber von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen zu untersuchen. Mit seinem transparenten Körperplan und den fluoreszenzmarkierten natürlichen Mikroben können die relativen Konzentrationen von Mikroben im Darmmikrobiom eines einzelnen C. elegans-Tieres mit einem großen Partikelsortierer leicht quantifiziert werden . Hier beschreiben wir die Vorgehensweisen für den experimentellen Aufbau eines Mikrobioms, die Sammlung und Analyse von C. elegans-Populationen im gewünschten Lebensstadium, den Betrieb und die Wartung des Sortierers sowie statistische Analysen der resultierenden Datensätze . Wir diskutieren auch Überlegungen zur Optimierung der Sortierereinstellungen auf der Grundlage der interessierenden Mikroben, die Entwicklung effektiver Anschnittstrategien für die Lebensstadien von C. elegans und wie die Fähigkeiten von Sortierern genutzt werden können, um Tierpopulationen auf der Grundlage der Zusammensetzung des Darmmikrobioms anzureichern. Im Rahmen des Protokolls werden Beispiele für potenzielle Anwendungen vorgestellt, einschließlich des Potenzials für die Skalierbarkeit auf Anwendungen mit hohem Durchsatz.

Introduction

Die Evolution von Tieren steht unter ständigem mikrobiellen Einfluss¹. Aus verschiedenen Mikroben in der Umwelt erwerben tierische Wirte spezifische Partner² , die die Fähigkeiten des Wirts erweitern und seine Physiologie und Anfälligkeit für Krankheiten³ vorantreiben. Metagenomische Analysen des Darmmikrobioms deckten beispielsweise angereicherte Stoffwechselklassen mikrobieller Gene auf, die bei adipösen Mäusen zu einer größeren Energiegewinnung und -speicherung führen können⁴, von denen viele auch im menschlichen Darmmikrobiom zu finden sind

Protocol

1. Vorbereitung der Mikrobiommischung

1. Stempeln oder streifen Sie Bakterien aus einem Glycerin-Gefrierschrank auf eine Lysogenese-Bouillon (LB)-Platte oder ein geeignetes Wachstumsmedium und lassen Sie sie über Nacht bei einer optimalen Temperatur wachsen, die auf den interessierenden Bakterienstämmen basiert (typischerweise 25 °C für natürliche Mikroben von C. elegans ).
2. Verwenden Sie von der LB-Platte eine einzelne Kolonie aus jedem Bakterienisolat (z. B. 12 Bakterien der CeMbio-Sammlung), um 800 μl LB-Medium in separaten Vertiefungen einer 1-ml-Deep-Well-Platte zu inokulieren. Über Nacht bei optimaler Temperatur unter Sc....

Results

Definition von adulten und larvenartigen Populationstore
Hier wurden synchronisierte C. elegans L1s auf einer NGM-Platte gezüchtet, die mit E. coli OP50 (Eco), einer Standard-Labordiät, ausgesät war. C. elegans-Populationen wurden für die LPS-Analyse nach 96 h oder 120 h Wachstum bei 20 °C gesammelt (Abbildung 2A). Ein Punktdiagramm der Extinktion (EXT, ein Proxy für die Körperdichte) im Vergleich zur Flugzeit (TOF, ein Proxy für die Körperlänge.......

Discussion

Die Fließvermimetrie wurde in mehreren Studien verwendet, um die Gene und Signalwege von C. elegans gegen die Kolonisierung und Toxizität von Krankheitserregern zu charakterisieren^21,22. Hier wird ein Hochdurchsatz-Ansatz vorgestellt, der C. elegans verwendet, um zu untersuchen, wie Darmmikrobiome ihre Wirtsphysiologie modulieren. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die koloniebildende Einheiten (KBE) oder 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden	VWR	10026-076
96 Deep-Well-Platten (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 Deep-Well-Platten (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-Well-Costar-Platte	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard Bakteriologie-Agar ist ebenfalls ausreichend.
Ansaugkrümmer	V& P wissenschaftliche	VP1171A
Bleiche	Clorox
Bleichlösung			Mischen Sie Bleiche mit 5M Natriumhypochlorit 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bakterielle OD-Messung
Zentrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	Für 96-Well-Platten und konische Röhren
Fluoreszenzmikroskop	Nikon	TiE
ggplot: Verschiedene R-Programmierwerkzeuge zum Plotten von Daten.	R-Paket	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisol	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB Hausgemachte Rezepte mit Bacto-Trypton, Hefeextrakt und NaCl sind ebenfalls ausreichend.
M9-Lösung			22 mM KH2PO4 monobasisch, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematoden-Wachstumsmedium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 nach dem Autoklavieren.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Natriumhypochlorit	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereomikroskop	Nikon	SMZ745
Sterile Petrischalen mit 10 cm Durchmesser	Corning	351029
Sterile 12-Well-Platten	VWR	10062-894
Sterile 24-Well-Platten	VWR	10062-896
Sterile Petrischalen mit 6 cm Durchmesser	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787