Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Die Milchindustrie ist ein wichtiger Industriezweig weltweit, auch in Kanada, wo es mehr als 10.500 Milchviehbetriebe gibt, die jedes Jahr fast 90 Millionen hl Milch produzieren¹. Trotz der strengen Hygieneanforderungen in der Milchindustrie, auch in Verarbeitungsbetrieben, stellt Milch ein hervorragendes Nährmedium für Mikroorganismen dar, und daher enthalten Milchprodukte wahrscheinlich Mikroorganismen, einschließlich Verderb oder pathogener Mikroorganismen. Diese Krankheitserreger können verschiedene Krankheiten verursachen; Zum Beispiel können Salmonella sp. und Listeria monocytogenes Gastroenteritis bzw. Meningitis^{verursachen 2}. Verderbnisfördernde Mikroorganismen können die Qualität und die organoleptischen Eigenschaften von Milchprodukten beeinträchtigen, indem sie Gase, extrazelluläre Enzyme oder Säuren produzieren³. Auch das Aussehen und die Farbe der Milch können verändert sein, z.B. durch Pseudomonas ^spp.4.

Einige dieser Mikroorganismen können Biofilme auf verschiedenen Oberflächen, einschließlich Edelstahl, bilden. Solche Biofilme ermöglichen die Persistenz und Vermehrung von Mikroorganismen auf der Oberfläche der Geräte und damit die Kontamination der Milchprodukte⁵. Biofilme sind auch problematisch, da sie die Wärmeübertragung behindern und die Korrosion der Geräte beschleunigen können, was zu einem vorzeitigen Austausch der Geräte und damit zu wirtschaftlichen Verlusten führt⁶.

Clean-in-Place-Verfahren (CIP) ermöglichen es der Lebensmittelindustrie, das Wachstum von Mikroorganismen zu kontrollieren. Diese Verfahren beinhalten die sequentielle Verwendung von Natriumhydroxid, Salpetersäure und manchmal Desinfektionsmitteln, die hypochlorige Säure und Peressigsäure ^7,8 enthalten. Obwohl hypochlorige Säure hochwirksam gegen Mikroorganismen ist, reagiert sie auch mit natürlichen organischen Stoffen, was zur Bildung toxischer Nebenprodukte führt⁹. Peressigsäure erzeugt keine schädlichen Nebenprodukte¹⁰; Seine Wirksamkeit gegen Biofilme in der Lebensmittelindustrie ist jedoch sehr unterschiedlich^10,11. In jüngster Zeit wurden andere Peroxysäuren, einschließlich Perpropion- und Permilchsäuren, auf ihre antimikrobielle Aktivität untersucht, und sie scheinen eine gute Alternative für die Kontrolle des mikrobiellen Wachstums in Biofilmen zu sein^12,13.

Daher zielte diese Studie darauf ab, die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren (Peressigsäure, Perpropionsäure und Permilchsäure sowie ein Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis) zur Beseitigung von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes zu bewerten, der den MBEC-Assay (Minimum Biofilm eradication Concentration), eine statische Hochdurchsatz-Screening-Methode und den Biofilmreaktor des Center for Disease Control (CDC), eine dynamische Methode, die in situ nachahmt Bedingungen. Der MBEC-Assay wird im Folgenden im Protokoll als "Biofilm-Mikrotiterplatten" bezeichnet. Das hier vorgestellte Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse belegen die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren und ihre mögliche Anwendung zur Bekämpfung mikrobieller Biofilme in der Milchindustrie.

Die in diesem Artikel enthaltenen Arbeiten erfordern ein Labor der Biosicherheitsstufe 2 und wurden zuvor vom institutionellen Biosicherheitsausschuss der Université Laval genehmigt (Projektnummer 119689).

HINWEIS: Das Flussdiagramm in Abbildung 1 stellt eine Zusammenfassung der Methodik dar, die statische und dynamische Ansätze kombiniert, die zur Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen verwendet wurde.

1. Vorbereitung der Materialien

1. Mikrobielle Isolate
   1. Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) 15 Minuten vor Gebrauch ein und reinigen Sie sie mit einer 70%igen (v/v) Alkohollösung.
   2. Sobald der BSC steril ist, legen Sie eine Durchstechflasche mit dem zu testenden mikrobiellen Isolat (Pseudomonas azotoformans oder Brevundimonas vesicularis in dieser Studie), eine Impfschleife, ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml steriler tryptischer Sojabrühe (TSB) gefüllt ist, und einen Vortex-Mischer. Desinfizieren Sie vor dem Einlegen in die BSC alle Materialien mit Alkohol.
   3. Wirbeln Sie die Durchstechflasche mit mikrobiellem Isolat, um die Kultur zu homogenisieren.
   4. Aseptisch werden 20 μl des mikrobiellen Isolats in 10 ml steriles TSB in einem 15-ml-Röhrchen überführt und bei 30 °C für 16-24 h unter Rühren bei 160 U/min inkubiert.
      ACHTUNG: B. vesicularis muss in einem Labor der Sicherheitsstufe 2 gemäß den Richtlinien für den Umgang mit pathogenen Organismen verwendet werden. Der Hundeführer muss ordnungsgemäß geschult sein und eine Schutzbrille, Handschuhe und einen Mantel tragen.
2. Desinfektionsmittel
   1. Zur Herstellung der organischen Peroxysäurelösung (60 ml) werden 24 ml Wasserstoffperoxid und 36 ml Säure (Essig-, Propion- oder Milchsäure) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Fügen Sie dann ein vordefiniertes Volumen von 10 M Schwefelsäure hinzu (655 μl für Peressigsäure, 635 μl für Perpropionsäure oder 715 μl für Permilchsäure). Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um ihn zu mischen, und stellen Sie den Kolben in ein 30 °C warmes Wasserbad, das in der chemischen Haube aufgestellt ist. Inkubieren Sie den Kolben 2 Tage lang und mischen Sie ihn jeden Morgen sanft.
      HINWEIS: Das handelsübliche Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis (siehe Materialtabelle) wurde direkt vom Hersteller zur Verfügung gestellt.
      ACHTUNG: Die Desinfektionsmittel müssen unter einer chemischen Haube verwendet werden. Für die Dauer des Versuchs müssen Schutzbrillen und Handschuhe getragen werden. Weitere Informationen zu den Desinfektionsmitteln entnehmen Sie bitte dem jeweiligen Sicherheitsdatenblatt.
   2. Führen Sie die Titration von Wasserstoffperoxid wie unten beschrieben durch.
      1. Stellen Sie ein leeres 300-ml-Becherglas auf eine Analysenwaage (siehe Materialtabelle) und tarieren Sie die Waage. Wiegen Sie ca. 0,23 g Desinfektionsmittel in das Becherglas und notieren Sie sich das genaue Gewicht. 100 g kalte 1 N Schwefelsäurelösung in das Becherglas geben, einen magnetischen Rührstab in das Becherglas geben und auf eine Rührplatte legen.
      2. Lassen Sie die Lösung rühren, bis sie vollständig homogenisiert ist. Geben Sie dann drei Tropfen einer Ferroin-Indikatorlösung (0,1 Gew.-% in H₂O) in das Becherglas und titrieren Sie mit 0,1 N Cersulfatlösung, bis die Lösung von einer lachsrosa Farbe in eine hellblaue Farbe übergeht. Beachten Sie das Volumen der zugesetzten Cersulfatlösung.
      3. Berechnen Sie den Prozentsatz von Wasserstoffperoxid mit der folgenden Formel:
         Gl. (1)
         wobei S das Volumen der zugesetzten Cersulfatlösung ist, N die Normalität der Cersulfatlösung (0,1 N), W das Gewicht der Probe (~0,2300 g) und 0,017 = (1 mol H2O 2/2 mol Ce) × (34,0147 g H2O2 /1mol _H2O)₂ × (1 L/1.000 ml)
   3. Führen Sie die Titration der organischen Peroxysäuren wie unten beschrieben durch.
      1. 20 ml 7,5%ige (w/v) Kaliumiodidlösung in ein Becherglas geben. Langsam mit 0,1 N Natriumthiosulfatlösung titrieren, bis sich die blaue Farbe der Lösung hellbraun/orange färbt.
      2. 2 ml Stärkelösung (1 Gew.-% in H₂O) in das Becherglas geben und mit 0,1 N Natriumthiosulfatlösung titrieren, bis die Lösung von schwarz nach orange übergeht. Beachten Sie das Volumen der verwendeten Natriumthiosulfatlösung.
      3. Berechnen Sie den Prozentsatz der organischen Peroxysäure mit der folgenden Formel:
         Gl. (2)
         wobei T das Volumen der verwendeten Natriumthiosulfatlösung, N die Normalität der Natriumthiosulfatlösung (0,1 N), W das Gewicht der Probe (~0,2300 g) und 0,038 = (1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2) × (1 mol I 2/2 mol S₂ O 3) × (76,06 g/1 mol CH ₃COOOH) × (1 l/1.000 ml)
         HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 und Schritt 1.2.3 mit zwei weiteren Proben, um jeden Test in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.

2. Bildung von einzelnen und gemischten Biofilmen

1. Biofilm-Mikrotiterplatten
   1. Wirbeln Sie das Röhrchen mit der Bakterienkultur (20 μl des Stammes + 10 ml TSB-Medium, hergestellt in Schritt 1.1.4). Führen Sie eine serielle Verdünnung und Beschichtung von tryptischem Sojaagar (TSA) durch, um die Bakterienzellzahl (KBE) der Nachtkultur zu bestimmen. Anschließend werden 100 μl der Kultur aseptisch in 10 ml steriles TSB-Medium überführt (für eine Endkonzentration von ca. 2 x 10,7 KBE/ml).
      HINWEIS: Für den Assay mit dem Bioreaktor wird ein Volumen von 100 μl des mikrobiellen Isolats in 100 ml steriles TSB überführt.
   2. Wirbeln Sie die Röhre. Für jedes Bakterium wird die verdünnte Bakterienkultur mit einer Mehrkanalpipette dreifach auf die Biofilm-Mikrotiterplatte (150 μl pro Well) übertragen. Laden Sie 150 μl TSB-Medium in drei neue Vertiefungen, die als Kontrollen dienen. Die Biofilm-Mikrotiterplatte (siehe Materialtabelle) wird bei 30 °C für 24 h ohne Rühren inkubiert.
      ANMERKUNG: Bei gemischten Biofilm-Assays werden 75 μl jeder Suspension für ein Gesamtvolumen von 150 μl hinzugefügt. Die Biofilm-Mikrotiterplatte enthält in ihren Deckeln Stifte, auf denen sich die Biofilme bilden.
2. Bioreaktor
   1. Reinigen und trocknen Sie die Teile des Bioreaktors (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers an der Luft und bereiten Sie den Reaktor wie unten beschrieben vor.
      1. Legen Sie zunächst die flache Klinge in den 1-Liter-Glasbecher (Bioreaktor), der mit einem Magnetstab an seiner Halterung befestigt ist, und halten Sie den Aufbau mit Hilfe der Kunststoffstange, die an der Innenseite des Bioreaktordeckels angebracht ist, in aufrechter Position.
      2. Legen Sie die Edelstahlcoupons oder Objektträger (siehe Materialtabelle) mit dem Schraubendreher auf ihre Polypropylenstäbe und führen Sie sie in die Löcher im Deckel ein, ohne die Ausrichtungsstifte in die Kerben zu stecken, damit der Dampf während der Sterilisation entweichen kann.
      3. Decken Sie alle Entlüftungsöffnungen des Bioreaktors mit Aluminiumfolie ab und wickeln Sie den Rest der Ausrüstung, nämlich die Schläuche L/S 18 (ID = 7,9 mm) und L/S 16 (ID = 3,1 mm), den Glasdurchflussbruch, die Behälterkappen, die Schraubendreher, die Pinzette und die 0,2-μm-Filter mit Aluminiumfolie ein.
         HINWEIS: Führen Sie den Silikonschlauch (siehe Materialtabelle) in den Widerhaken ein, der sich auf der Innenfläche des mittleren Behälterdeckels befindet.
      4. Autoklavieren Sie den Bioreaktor, der in einem Trockenzyklus bei 121 °C für 20 Minuten eingerichtet wurde.
   2. Führen Sie die Biofilmbildung im Bioreaktor im Batch-Modus durch (erster Schritt).
      1. Verbinden Sie in einem BSC ein Ende des Schlauchs L/S 18 mit dem Auslassauslauf des Bioreaktors und halten Sie das andere Ende in Aluminiumfolie eingewickelt, um die Sterilität zu erhalten.
      2. Nehmen Sie einen Gutschein- oder Objektträgerhalter vom Deckel des Bioreaktors und legen Sie ihn in ein steriles 50-ml-Röhrchen. Anschließend wird das Becherglas des Bioreaktors mit 340 ml 300 mg/l TSB-Medium durch das Loch, das vom Stab besetzt war, mit einer serologischen 50-ml-Pipette gefüllt.
      3. Beimpfen Sie das Nährmedium im Bioreaktor mit 1 ml der Bakterienlösung (~10⁸ KBE/ml P. azotoformans) mit einer 5-ml-Pipette durch dieselbe Öffnung, die zuvor verwendet wurde, und setzen Sie den Stab dann wieder in seine ursprüngliche Position ein. Positionieren Sie die Stangen, die bereits in den Deckellöchern platziert sind, so, dass die Stifte in ihre jeweiligen Kerben passen.
      4. Platzieren Sie einen 0,2 μm bakteriellen Luftspülfilter am Ende des Röhrchens mit dem kleinsten Durchmesser, das sich auf dem Deckel des Bioreaktors befindet. Der andere Schlauch mit gleichem Durchmesser bleibt mit einem Metall-Schraubverschluss oder einem fest schließenden Silikonstopfen dauerhaft verschlossen.
      5. Stellen Sie den Bioreaktor für 24 h über die auf 30 °C eingestellte Heizplatte und rühren Sie bei 130 U/min.
         HINWEIS: Verwenden Sie für die Bildung von Biofilmen mit mehreren Spezies ein gleiches Volumen der verschiedenen Bakterienkulturen, um ein Gesamtvolumen von 1 ml für das Inokulum zu erhalten.
   3. Führen Sie die Biofilmbildung im Bioreaktor im kontinuierlichen Durchflussmodus durch (zweiter Schritt).
      1. Legen Sie einen Ballon mit 18 l sterilem destilliertem Wasser in die BSC und fügen Sie 2 l 1.000 mg/l TSB-Nährmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 100 mg/l zu erhalten.
      2. Decken Sie den Behälter mit seiner sterilen Kappe ab, an die zwei Röhrchen angeschlossen sind. Der erste ist ein Silikonschlauch, der an der Innenseite der Kappe befestigt ist und zum Pumpen des Mediums verwendet wird. Das zweite Rohr (L/S 16) ist mit dem externen Anschluss verbunden, damit die Flüssigkeit zum Bioreaktor fließen kann. Setzen Sie einen 0,2-μm-Filter in das zweite Röhrchen auf dem Deckel des Mediumbehälters ein.
      3. Verbinden Sie dieses zweite Rohr mit der Peristaltikpumpe und verbinden Sie das andere Ende mit dem Glasstrombruch, der dann in den größeren Schlauch auf dem Bioreaktordeckel eingeführt wird.
      4. Verwenden Sie einen weiteren 20-Liter-Ballon, um das Abwasser aus dem Bioreaktor aufzufangen. Befestigen Sie das Ende des Röhrchens, das mit dem Auslauf des Bioreaktors verbunden ist, an der Kappe des Abfallbehälters. Setzen Sie einen 0,2-μm-Filter in das Röhrchen ein, das sich auf dem Deckel dieses Behälters befindet.
      5. Starten Sie die Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 11,3 ml/min und lassen Sie das System 24 Stunden lang laufen.
         ANMERKUNG: Die Durchflussrate (11,3 ml/min) des Nährmediums oder der Milch, die während der Biofilmbildung im Bioreaktor verwendet wurde, wurde bestimmt, indem 340 ml (was dem Volumen der Flüssigkeit im Reaktor entspricht) durch die Verweilzeit von 30 min dividiert wurde.
   4. Stellen Sie den bakteriellen Biofilm wieder her.
      1. Schalten Sie die Peristaltikpumpe aus und hören Sie auf, den Bioreaktor zu rühren und zu erhitzen.
      2. Entfernen Sie vorsichtig jeden Stab aus dem Bioreaktor und spülen Sie die Coupons oder Objektträger 3x in 40 ml PBS aus, um planktonische Bakterien zu entfernen. Geben Sie anschließend die Coupons oder Objektträger mit einem geeigneten Schraubendreher in sterile konische 50-ml-Röhrchen mit 40 ml PBS frei. Wirbeln Sie die Röhren 30 s lang, übertragen Sie sie auf ein Gestell in einem Ultraschallbad und beschallen Sie die Röhren 30 s lang bei 40 kHz (was 110 W Leistung erfordert). Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x.
      3. Sammeln Sie die 40-ml-Biofilmsuspensionen in sterilen konischen 50-ml-Röhrchen und spülen Sie dann die Coupons oder Objektträger mit 2 ml steriler PBS-Lösung ab. Gewinnen Sie diese Spülflüssigkeit zurück und fügen Sie sie der bereits gesammelten Biofilmsuspension hinzu.
   5. Zählen Sie die lebensfähigen Bakterien im Biofilm auf: Führen Sie mit der erhaltenen Biofilmsuspension 10-fache serielle Verdünnungen durch und geben Sie dann 100 μl der ^10-5 - und ^{10-6-Verdünnungen} dreifach auf TSA. Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 24 h. Zählen Sie die Anzahl der auf den Agarplatten vorhandenen Kolonien und berechnen Sie die Bakteriendichte auf den Coupons und Objektträgern (lebensfähige sitzende Bakterien) gemäß ASTM E2562-17¹⁴ nach folgender Formel:
      Gl. (3)
      wobei X die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE), B das plattierte Volumen (0,1 ml), V das Volumen ist, in dem der Biofilm suspendiert ist (die Stammlösung), A die Oberfläche des vom Biofilm bedeckten Kupons oder Objektträgers ist und D der Verdünnungsfaktor ist.

3. Quantitative Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Eraminierung von Biofilmen

1. Biofilm-Mikrotiterplatten
   1. Geben Sie 200 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) in drei Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte.
   2. Übertragen Sie den Deckel der Biofilm-Mikroplatte mit Biofilmen, die sich auf den Stiften gebildet haben, für 10 s auf die 96-Well-Mikroplatte, die das PBS enthält, um die Biofilme zu waschen und planktonische Bakterien zu eliminieren.
   3. Bereiten Sie die Desinfektionsmittel in den erforderlichen Konzentrationen vor (z. B. 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 5.000 ppm, 10.000 ppm und 25.000 ppm Wirkstoff).
      HINWEIS: Alle Verdünnungen werden aseptisch mit sterilem destilliertem Wasser hergestellt.
   4. Geben Sie 200 μl jeder Desinfektionsmittelkonzentration in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungen einer neuen 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie den Deckel der Biofilm-Mikrotiterplatte auf diese 96-Well-Mikrotiterplatte, die die Desinfektionsmittel enthält, und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für die gewünschte Einwirkzeit.
   5. Geben Sie 200 μl Dey-Engley-Neutralisierungsbrühe in die Vertiefungen einer neuen 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie den Deckel der Biofilm-Mikrotiterplatte auf die 96-Well-Mikrotiterplatte, die die neutralisierende Brühe enthält. Versiegeln Sie die Mikrotiterplatte mit Parafilm und legen Sie sie für 30 Minuten bei 40 kHz in das Bad-Ultraschallgerät.
   6. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Mikrotiterplatte aus dem Ultraschallgerät und entfernen Sie den Parafilm. Übertragen Sie 100 μl von der ersten Säule der 96-Well-Platte, die die nach der Beschallung abgelösten Biofilme enthält, in die erste Reihe einer neuen 96-Well-Mikrotiterplatte.
   7. 180 μl steriles 1x PBS werden in die Vertiefungen der neuen 96-Well-Mikrotiterplatte (hergestellt in Schritt 3.1.6) mit Ausnahme der ersten Reihe gegeben. 20 μl der Biofilmlösung werden aus der ersten Reihe in die Vertiefungen in der zweiten Reihe überführt, die 180 μl 1x PBS enthalten (Reihe 2, Verdünnung: 10⁻¹). Anschließend werden 20 μl der in der zweiten Reihe enthaltenen Flüssigkeit in die Vertiefungen in der nächsten Reihe überführt, die 180 μl 1x PBS enthalten (Reihe 3, Verdünnung: 10⁻²). Wiederholen Sie den gleichen Vorgang, um Verdünnungen zwischen 10−⁵ und 10⁻⁷ zu erhalten.
   8. Inokulieren Sie 100 μl der Verdünnungen mit TSA und inkubieren Sie die Platten gemäß den Parametern, die für das Wachstum jedes Bakteriums erforderlich sind.
   9. Zählen Sie nach der Inkubation die KCUs und berechnen Sie die logarithmische 10-Dichte für jeden Peg und die logarithmische_10-Reduktion bei jeder Desinfektionsmittelkonzentration mit den folgenden Gleichungen:
      Gl. (4)
      wobei X die koloniebildenden Einheiten ist, die im Spot gezählt werden, B das überzogene Volumen (0,01 ml), V das Wellvolumen (0,20 ml), A die Stiftoberfläche (46,63 mm²) und D die Verdünnung ist.
      Gl. (5)
   10. Wiederholen Sie jedes Experiment 3x an unabhängigen Tagen.
       HINWEIS: Die "Mindestkonzentration an Desinfektionsmittel, die den Biofilm beseitigt" oder MBEC, entspricht der niedrigsten Desinfektionsmittelkonzentration, die kein Bakterienwachstum zeigt.
2. Bioreaktor
   HINWEIS: Das Verfahren der ASTM-Norm E2871-19¹⁵ wird befolgt, um diesen Test mit P. azotoformans PFlA1 durchzuführen.
   1. Beginnen Sie mit der Bildung der Biofilme auf den Coupons im Bioreaktor, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Entfernen Sie dann den Stab, der die Coupons hält, und spülen Sie ihn in einem konischen Röhrchen mit 30 ml PBS aus.
   2. Lassen Sie jeden Coupon mit einem Schraubendreher in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen fallen und fügen Sie dann 4 ml der entsprechenden organischen Peroxysäurelösung oder PBS für die Kontrolle hinzu. 5 Minuten inkubieren und dann 36 ml Dey-Engley-Neutralisierungsbrühe hinzufügen. 30 s lang vorwirbeln und dann 30 s lang mit einem Ultraschallbad bei 40 kHz beschallen. Wiederholen Sie den Vorgang 3x, um die Biofilmsuspension zu erhalten.
   3. Spülen Sie in ähnlicher Weise alle anderen Stäbchen aus und holen Sie die Biofilme aus den Coupons zurück. Führen Sie serielle Verdünnungen der Biofilmsuspension und der Platte 0,1 ml auf TSA-Medium durch. Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 24 h.
   4. Zählen Sie nach der Inkubation die KFUs und berechnen Sie dann die Biofilmdichte für jeden Coupon (Gl. 6), die mittlere Log-Dichte (LD) für jeden Satz von drei Coupons aus demselben Stab, einschließlich behandelt und kontrolliert (Gl. 7), und die Log-Reduktion für das Desinfektionsmittel (Gl. 8) unter Verwendung der folgenden Gleichungen:
      Gl. (6)
      wobei X der Mittelwert der gezählten koloniebildenden Einheiten/Kupon, B das plattierte Volumen (0,1 ml), V das Volumen des Desinfektionsmittels oder PBS plus Neutralisator (40 ml) und D die Verdünnung ist.
      Gl. (7)
      Gl. (8)

4. Qualitative Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Eraminierung von Biofilmen

ANMERKUNG: Nach der Behandlung mit den Desinfektionsmitteln (Schritt 3.1.1 bis Schritt 3.1.5) wurden die P. azotoformans-Biofilme , die sich bei der statischen Methode auf den Stiften der Biofilm-Mikrotiterplatte bildeten, präpariert und durch Beobachtung an Rasterelektronen- und konfokalen Mikroskopen analysiert.

1. Rasterelektronenmikroskopie (REM)
   1. Geben Sie 200 μl 1x PBS in drei Vertiefungen einer 96-Well-Mikroplatte. Übertragen Sie den Deckel von der Biofilm-Mikrotiterplatte (Schritt 3.1.5) auf die 96-Well-Mikrotiterplatte, die PBS enthält, und lassen Sie ihn 10 s lang bei Raumtemperatur, um die Dey-Engley-Neutralisationsbrühe zu entfernen.
   2. Entfernen Sie die Stifte mit einer sterilisierten Nadelzange von der Biofilm-Mikrotiterplatte. Legen Sie jeden Stift in eine leere Durchstechflasche unter einer Haube und geben Sie primäres Fixiermittel (5% Glutaraldehyd in 0,1 M Na Cacodylatpuffer pH 7,5) in jede Durchstechflasche. Verschließen Sie jede Durchstechflasche und inkubieren Sie sie 24 h lang bei 4 °C.
   3. Dekantieren Sie das Fixiermittel nach der Inkubation mit einer Pipette und entsorgen Sie alle flüssigen Abfälle in einem geeigneten Behälter. Entfernen Sie die Kappen jeder Durchstechflasche und legen Sie sie in eine Haube, um sie 72 Stunden lang an der Luft zu trocknen.
   4. Montieren Sie die Proben auf Aluminiumstummeln (siehe Materialtabelle), indem Sie Epoxidharz (siehe Materialtabelle) auf die flache Oberseite jedes Stummels auftragen. Befestigen Sie dann die Stifte vorsichtig mit einer Pinzette an den Stummeln.
   5. Metallisieren Sie die Proben mit einem EMS950x + 350s Gold-Sputter (siehe Materialtabelle) für 4 min bei 2 x 10⁻¹ bar Argondruck und 20 mA Strom. Führen Sie eine entsprechende Erdung durch, indem Sie die Seite des Stifts, die dem Gold nicht ausgesetzt ist, mit Silberfarbe bemalen (siehe Materialtabelle).
   6. Erfassen Sie Bilder mit einem Rasterelektronenmikroskop mit der REM-Steuerungsbenutzeroberfläche Version 6.28 (siehe Materialtabelle). Die in dieser Studie verwendete Beschleunigungsspannung betrug 15 kV und die Vergrößerungen betrugen 300x und 2.000x.
2. Konfokale Mikroskopie
   1. Geben Sie 200 μl 1x PBS in drei Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie den Deckel von der Biofilm-Mikroplatte auf die 96-Well-Platte, die das PBS enthält, und lassen Sie ihn 10 s lang stehen, um die Dey-Engley-Neutralisationsbrühe zu entfernen.
   2. Bereiten Sie Lösungen von fluoreszierenden Farbstoffen vor, indem Sie 3 μl grün fluoreszierende Färbung und 3 μl rot fluoreszierende Färbung (siehe Materialtabelle) zu 1 ml sterilem Wasser geben.
   3. Geben Sie 200 μl Färbelösung in eine Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie den Deckel von der Biofilm-Mikrotiterplatte auf die 96-Well-Platte, die die Färbelösung enthält. Decken Sie die Biofilm-Mikrotiterplatte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie die Probe 20-30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   4. Geben Sie 200 μl sterilisiertes Wasser in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie dann den Deckel von der Biofilm-Mikroplatte auf die 96-Well-Mikroplatte, die das Wasser enthält, und lassen Sie ihn bis zur Beobachtung stehen.
   5. Visualisieren Sie die auf den Stiften gebildeten Biofilme mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit einem 63x/1,40 Öl-DIC-Objektiv. Erfassen Sie die Bilder mit der zugehörigen Software (siehe Materialtabelle). Die Fluoreszenzanregungswellenlängen, die für die grünen und roten Fluoreszenzfärbungen verwendet wurden, betrugen 482 nm bzw. 490 nm.
      HINWEIS: Um die besten Ergebnisse zu erzielen, schneiden Sie den Stift ab, legen Sie ihn in eine 60-mm-Petrischale und füllen Sie die Schale mit sterilem Wasser.

Die REM-Analyse zeigt das Vorhandensein von Biofilmen, die von P. azotoformans PFl1A produziert werden, auf den Biofilm-Mikroplattenstiften (Abbildung 2A). Es kann eine dreidimensionale Biofilmstruktur beobachtet werden. Der P. azotoformans PFl1A wurde zuvor unter Verwendung von 96-Well-Mikrotiterplatten12 als starker Biofilmproduzent (A570 > 1,5) identifiziert.

Darüber hinaus schien der PFl1A-Biofilm von P. azotoformans , der sich auf einem Edelstahlobjektträger unter Verwendung des Bioreaktors bildete, sehr dicht zu sein und die morphologischen Merkmale eines reifen Biofilms mit einer dreidimensionalen Struktur aufzuweisen (Abbildung 2B). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Keimzahlen der Biofilme, die von diesem Isolat im dynamischen System entwickelt wurden, signifikante Zelldichten, die 8,74 log KBE/cm2 bzw. 7,86 log KBE/cm2 in TSB-Kulturmedium bzw. steriler Magermilch entsprechen (Abbildung 2C).

Darüber hinaus zeigten die in Abbildung 3 gezeigten Ergebnisse, die mit dem B. vesicularis-Isolat erzielt wurden, dass bestimmte Faktoren einen wichtigen Einfluss auf die Biofilmbildung im Bioreaktor haben können. Durch Variation einiger Parameter, wie z. B. der Rührgeschwindigkeit innerhalb des Bioreaktors, der Mediumsflussrate, der mittleren Nährstoffkonzentration und der Dauer des kontinuierlichen Modusschritts, kann die Zellanhaftung verbessert und dichtere Biofilme beobachtet werden. Beispielsweise führte die Erhöhung der Nährstoffkonzentration von 100 mg/L auf 900 mg/L (Zustand A im Vergleich zu Zustand F) zu einem Anstieg der Keimzahl der Biofilme von 6,11 log KBE/cm 2 auf 8,71 log KBE/cm2. Darüber hinaus wurde ein signifikantes Wachstum von Biofilmen beobachtet, wenn die Flussrate auf 6,0 ml/min (im Zustand C) reduziert wurde, was zu einer längeren Verweilzeit führte, die mit der Wachstumsrate dieses Isolats übereinstimmte.

Die mikroskopischen Beobachtungen der Biofilme, die sich auf den Biofilm-Mikrotiterplatten bildeten, oder die Vor- und Nachdesinfektionsbehandlung des Bioreaktors waren komplementär zu den lebensfähigen Zellzahlen. Abbildung 4 zeigt, dass keiner der Biofilme nachweisbare lebensfähige Zellen zum Zeitpunkt der Kontaktzeit (5 min) und Konzentrationen (500 ppm mit organischen Peroxysäuren und 100.000 ppm mit Wasserstoffperoxid) von Desinfektionsmitteln enthielt, die üblicherweise in Molkereien angewendet werden. Diese Ergebnisse wurden durch Mikroskopie bestätigt (Abbildung 5). Abbildung 5A zeigt die dreidimensionale Struktur eines unbehandelten MBEC-Biofilms (Kontrolle), während behandelte MBEC-Biofilme (mit Wasserstoffperoxid, Peressigsäure, Permilchsäure, Perpropionsäure und einem handelsüblichen Desinfektionsmittelpräparat) ihre dreidimensionale Konformation verlieren, wie durch REM bestimmt. Obwohl die Biofilme mit Desinfektionsmittel behandelt wurden, blieb eine scheinbare Biofilmstruktur erhalten, insbesondere mit Wasserstoffperoxid. Nichtsdestotrotz bestätigte die Verwendung einer Lebend-Tot-Technik, in diesem Fall der konfokalen Mikroskopie (CM) mit Fluoreszenz-Viabilitätsfärbung, dass die verbleibende Biofilmstruktur nach einer Desinfektionsbehandlung weitgehend leblos war (Abbildung 5B).

Abbildung 1: Flussdiagramm, das einen kombinierten statischen und dynamischen Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Analyse der Biofilmbildung durch Pseudomonas azotoformans PFl1A. (A) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (300x und 2.000x) des PFl1A-Biofilms von P. azotoformans , der an den Stiften der Biofilm-Mikrotiterplatte gebildet wurde. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Goetz et al.12 modifiziert (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alle Rechte vorbehalten.). Maßstabsbalken = 50 μm (300x), 100 μm (2.000x). (B) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (2.000x) von (1) einem Edelstahlobjektträger, der einen im Bioreaktor gezüchteten PFl1A-Biofilm von P. azotoformans enthält, und (2) einem biofilmfreien Objektträger (Negativkontrolle). Maßstabsleiste = 10 μm. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Niboucha et al.16 geändert. (C) Bakteriendichte von P. azotoformans PFl1A-Biofilmen, die im Bioreaktor in TSB-Kulturmedium und steriler Magermilch gebildet und nach ihrer Entfernung durch Ultraschall von den Edelstahlobjektträgern bestimmt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Der signifikante Unterschied (p < 0,05) basiert auf dem t-Test des Schülers. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Niboucha et al.16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Bakteriendichte von Brevundimonas vesicularis-Biofilmen , die unter Verwendung des Bioreaktors unter unterschiedlichen Bedingungen des Rührens, der Flussraten, der Zeit im kontinuierlichen Modus und der Nährmedien (TSB) entwickelt wurden. Zustand A: 130 U/min Rührgeschwindigkeit, 11,8 ml/min Durchflussrate, 24 h kontinuierlicher Modus in 100 mg/L TSB-Medium (gemäß dem internationalen ASTM-Protokoll E2562-1714 für die Bildung von Biofilmen durch Pseudomonas aeruginosa); Zustand B: 60 U/min Rührgeschwindigkeit, 11,8 ml/min Durchflussrate, 24 h kontinuierlicher Modus in 100 mg/L TSB-Medium; Zustand C: 60 U/min Rührgeschwindigkeit, 6,0 ml/min Durchflussrate, 24 h kontinuierlicher Modus in 100 mg/L TSB-Medium; Zustand D: 60 U/min Rührgeschwindigkeit, 6,0 ml/min Durchflussrate, 48 h kontinuierlicher Modus in 100 mg/L TSB-Medium; Zustand E: 60 U/min Rührgeschwindigkeit, 6,0 ml/min Durchflussrate, 48 h kontinuierlicher Modus in 300 mg/L TSB-Medium; Zustand F: 60 U/min Rührgeschwindigkeit, 6,0 ml/min Durchflussrate, 48 h kontinuierlicher Modus in 900 mg/L TSB-Medium; Zustand G: 60 U/min Rührgeschwindigkeit, 6,0 ml/min Durchflussrate, 24 h Batch-Modus in 2,7 g/L TSB und 48 h kontinuierlicher Modus in 900 mg/L TSB-Medium. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Signifikante Unterschiede (unterschiedliche Buchstaben, p < 0,05) basieren auf der Einweg-ANOVA und dem Tukey-Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Anzahl lebensfähiger Zellen in PFl1A-Biofilmen von Pseudomonas azotoformans vor und nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid, Permilchsäure, Perpropionsäure, Peressigsäure oder handelsüblichem Desinfektionsmittel. Jeder Punkt stellt den Mittelwert der dreifachen Zählungen dar, die an drei unabhängigen Tagen für jedes Isolat erhalten wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Goetz et al.12 modifiziert (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alle Rechte vorbehalten.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Mikroskopische Beobachtung der Biofilmstruktur und -lebensfähigkeit. (A) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (300x und 2.000x) eines PFl1A-Biofilms von Pseudomonas azotoformans , der vor (Kontrolle) und nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid, Peressigsäure, Permilchsäure, Perpropionsäure und handelsüblichem Desinfektionsmittel auf den Stiften der Biofilm-Mikrotiterplatte vor (Kontrolle) und nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid, Peressigsäure, Permilchsäure, Perpropionsäure und handelsüblichem Desinfektionsmittel bei ihren minimalen Biofilm-Eradikationskonzentrationen (MBEC) gebildet wurde. Maßstabsleiste = 10 μm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Goetz et al.12 modifiziert (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alle Rechte vorbehalten.). (B) Lebensfähigkeit eines Biofilms, der von P. azotoformans PFl1A unter Verwendung einer Fluoreszenzzellviabilitätsfärbung auf dem Biofilm-Mikroplattenstift vor (links) und nach (rechts) Behandlung mit Peressigsäure (500 ppm) gebildet wird, sichtbar durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (63x/1,40 Öl-Differential-Interferenz-Kontrastobjektiv). Die lebensfähigen Zellen sind grün gefärbt und die toten Zellen sind rot gefärbt. Maßstabsbalken = 20 μm. Diese Zahl wurde von Goetz et al.12 mit Genehmigung geändert (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alle Rechte vorbehalten.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.