Einer der Haupttreiber von Zellphänotypen in Eukaryoten ist die Genexpression. Die Kontrolle der Genexpression ist essentiell und beruht auf mehreren Proteinen und RNAs, von der Transkription bis zu den Translationsprozessen1. Veränderungen entlang dieser Schritte können verschiedene Krankheiten auslösen. RNA-Prozessierung und -Spleißen stellen eine wichtige Gruppe von Reaktionen dar, die für die Erzeugung reifer RNA-Moleküle verantwortlich sind 2,3,4,5. Durch das Spleißen werden Introns entfernt und Exons verbunden, um ein reifes RNA-Molekül zu erzeugen, das in der Lage ist, funktionelle und strukturelle Aktivitäten auszuführen. Die Effizienz und die Spleißraten wirken sich stark auf die Phänotypen aus, die unter verschiedenen Bedingungen beobachtet wurden6.
Das Spleißen wird von einer komplexen makromolekularen Maschinerie namens Spleißosom durchgeführt, die aus fünf snRNAs und mehr als 100 Proteinen besteht 5,7. Zusätzlich zu den Kernproteinkomponenten weisen Spleißosomen trans-wirkende Proteine auf, die die Regulation dieses Prozesses direkt beeinflussen könnten 8,9. Die Bedeutung des Spleißens spiegelt sich in einem breiten Spektrum von Krankheiten wider, die durch Veränderungen in diesem Prozess verursacht werden, darunter neurodegenerative Erkrankungen, neuromuskuläre Erkrankungen und verschiedene Krebsarten 3,10,11. Die Untersuchung der Spleißdynamik und der Spleißosomenassemblierung kann das Verständnis der Biologie dieser Erkrankungen stark beeinflussen.
Die Assemblierung der Spleißosomen beginnt mit der Assoziation von U1 snRNP mit einer spezifischen Region der kürzlich transkribierten prä-mRNA, der 5'-Spleißstelle 5,8. Die effiziente Paarung und Erkennung von 5'-Spleißstellen durch U1-snRNA definiert nicht nur die Spleißstellen, die verwendet werden sollten, sondern steuert auch, welche Prä-RNAs zuerst oder effizienter gespleißt werden 6,12,13. Durch die Verwendung verschiedener Spleißstellen können mehrere alternative Isoformen reifer RNAs aus demselben Gen erzeugt werden. Alternatives Spleißen ist eine wichtige Quelle für proteomische Diversität und ermöglicht die Erzeugung von RNAs und Proteinen, die während der Entwicklung oder in verschiedenen Zellen und Geweben benötigt werden14,15. Alternative RNA-Transkripte können verkürzte oder nicht-funktionelle Proteinisoformen erzeugen, die Krankheiten verursachen können10,16. Daher spielen die Proteinkomponenten des U1 snRNP-Komplexes eine wichtige regulatorische Rolle beim Spleißenvon 1. Galectin-1 und Galectin-3 (Gal1 und Gal3) sind Bestandteile von U1 snRNP17,18. Voss et al.19 schlagen eine Methode zur Fraktionierung von Kernextrakten vor, um Gal3-U1 snRNP-angereicherte Komplexe zu erhalten, die in der Lage sind, die Spleißaktivität in Zellen zu retten, die von U1 abgereichert wurden. Diese Analyse trägt zum Verständnis des Mechanismus der Gal3-Assoziation mit den Spleißosomen bei, und ähnliche Ansätze können verwendet werden, um andere potenzielle regulatorische Spleißproteine zu erforschen.
Die Bindung von U1 snRNP an 5'-Spleißstellen ist ein wichtiger Vermittler der Spleißtreue20. Mutationen an den 5'-Spleißstellen sind kritisch und führen zum Verlust der U1 snRNP-Paarung, was zu Spleißdefektenführt 2. Mukoviszidose zum Beispiel wird durch eine mutierte 5'-Spleißstelle im CFTR-Gen21 verursacht. Wong et al.22 beschreiben eine Methode zur Kompensation von 5'-Mutationen an der Spleißstelle mit komplementären Mutationen in U1 snRNAs. Der Ansatz fördert erfolgreich den Exon-Einschluss, erzeugt reife RNAs und führt zu einer Rettung vor Spleißdefekten. Neben einer möglichen RNA-basierten Therapie für diese Erkrankungen kann dieser Ansatz auch für die Analyse einzelner regulatorischer Sequenzen in prä-mRNAs nützlich sein23.
Die Treue der Assoziation von U1-snRNA an Spleißstellen wird auch im Hefemodellsystem von van der Feltz24 untersucht. Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde häufig zur Erforschung der Spleißkinetik und des Spleißosomenassemblierens verwendet25. Die Spleißkinetik und die Spleißosomenzusammensetzung sind in Eukaryoten gut konserviert, und Hefe wurde ausgiebig verwendet, um die Bildung von Zwischenkomplexen während der Assemblierungzu überwachen 26. Der ACT1-CUP1-Reporter-Assay basiert auf der Expression eines Genpaares: ACT1, das ein Intron mit optimalen Spleißstellensequenzen enthält, und CUP1, das einen Kupferchelator exprimiert, der die Zelle vor den durch dieses Metallion verursachten Schäden schützt. CUP1 wird nur exprimiert, wenn ACT1 korrekt gespleißt wird, wodurch das Reportersystem27 erzeugt wird. Das Zellwachstum unter Bedingungen mit unterschiedlichen Kupferkonzentrationen kann überwacht werden, um die Spleißeffizienz verschiedener Intronsequenzen oder unter Verwendung verschiedener regulatorischer Proteine zu verbessern. van der Feltz24 stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen eines spleißenden regulatorischen Proteins unter Verwendung dieses Reportersystems und Kupfer-Viabilitätsassays zu analysieren. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um Variationen in Intron-Sequenzen in Kombination mit verschiedenen Proteinen zu entwerfen, um den Spleißerfolg in Hefen zu verbessern.
Neben der snRNP-Assoziation ist die Bindung von Proteinen während der Spleißosomenassemblierung essentiell1. Die Kontrolle der Spleißosomenaktivität hängt direkt von seiner Proteinzusammensetzung und den Wechselwirkungen ab, die während seiner Bildung auftreten. Die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Proteinkomponenten sind wichtig, um den Komplexzu aktivieren 5,7. Carvalho et al.28 verwenden einen Ansatz, der auf der Grafix-Methode basiert, die auf nicht-reversibler Proteinvernetzung in der Glyceringradientenanalyse beruht. Diese Analyse befasst sich mit der Zusammensetzung von Proteinen und den transienten Wechselwirkungen während der Assemblierung, die für den Assemblierung des aktiven Komplexes und den Erfolg des Spleißens entscheidend sein können. Die Analyse anderer dynamischer makromolekularer Komplexe mit diesem Ansatz kann sehr nützlich sein und Einblicke in die Organisation und Wechselwirkungen von Proteinen geben.
Die Chemie und Geschwindigkeit des Spleißens wird auch durch die dynamische Assoziation der verschiedenen Spleißosomenkomponenten beeinflusst8. In jüngster Zeit hat die Verwendung von niedermolekularen Spleißinhibitoren gezeigt, dass bestimmte Schritte in vitro aufgrund der verringerten Geschwindigkeit der Spleißreaktionen verzögert werden können29,30. Basei et al.31 stellen eine Methode vor, um alternatives Spleißen auf den Einfluss des Spleiß-Regulationsfaktors Nek4 zu analysieren. Die Prävalenz von Transkript-Isoformen, die zu pro- oder antitumoralen Phänotypen in HEK293-Zellen führen, die ein Minigen verwenden, wird untersucht. Die Fehlregulation des Spleißens oder die unterschiedliche Verwendung von Spleißstellen kann zu einer alternativen Transkriptbildung führen, die verschiedene Krebsarten verursacht16. Die Verwendung von Spleißmodulatoren oder -inhibitoren während der Therapie kann die Wahl der Spleißstelle bestimmen und somit die erzeugten alternativen Isoformen definieren, unabhängig davon, ob sie pro- oder antitumoral sind. Paclitaxel und Cisplatin werden derzeit als Chemotherapeutika eingesetzt. Mit der Verwendung des E1A-Minigens werden die Auswirkungen dieser Medikamente beim alternativen Spleißen adressiert. Die alternative Spleißanalyse mit Minigenen ist eine wichtige Strategie, um die Auswirkungen von trans-wirkenden Proteinen und Spleißveränderungen auf die Therapie und den Einsatz spezifischer Medikamente zu überwachen.
In dieser Linie wurde berichtet, dass viele intronische microRNAs (miRNAs) mit tumoralen Phänotypen assoziiert sind32,33. Die Kontrolle und Regulation der intronischen miRNA-Synthese und -Biogenese kann mit der Kontrolle von Spleißreaktionen in Verbindung gebracht werden. miRNAs können die Stabilität und Prävalenz von mRNAs in Zellen modulieren, was sich auf die RNA-Stabilität und die Translationsrate auswirkt34 . Gatti da Silva und Coltri35 beschreiben ein Reportersystem zur Bewertung der intronischen miRNA-Biogenese und -Reifung, das direkt mit Veränderungen in den zellulären Phänotypen und der Bestimmung von pro- oder antitumoralen Eigenschaften in Verbindung gebracht werden kann. Mit der Modulation des spleißregulatorischen Proteins HuR ermöglicht das System die Analyse der Biogenese und funktionellen Aktivität einer intronischen onkogenen miRNA.
Die Analyse des Prä-RNA-Spleißens und die Reifung verschiedener RNAs in spezifischen Zellen wird für das Verständnis und die Interpretation genomischer Informationen unerlässlich sein. Hefe- und Säugetier-Spleißosomen bleiben konserviert, und die Grundlagenforschung kann den Einsatz der verschiedenen Methoden in der Therapeutik und Biomedizin verbessern. Trotz der großen Menge an genomischen Daten, die derzeit verfügbar sind, könnte die Expression dieser Information in den Phänotypen zellspezifisch sein und von der RNA-Prozessierung und dem Spleißen abhängen. Das Verständnis der komplexen Regulation dieses Prozesses wird für die zukünftige Forschung von entscheidender Bedeutung sein.