Method Article

Methoden und Protokolle für Live-Imaging in der Entwicklung

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

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DISKUTIERTE ARTIKEL:

Januschke, J., Loyer, N. Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibringerinnseln für die Live-Bildgebung. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Ein Explantatsystem für zeitraffergestützte Bildgebungsstudien der Assemblierung des olfaktorischen Schaltkreises in Drosophila. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo Bildgebung von voll aktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in Probenkammer-basierten Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Lebendzell-Bildgebung während der neuronalen Entwicklung. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mittels stimulierter Raman-Streumikroskopie. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Tiefe und räumlich kontrollierte Volumenablationen mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in der Zebrafisch-Gastrula. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

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Die Entwicklung ist gekennzeichnet durch die dynamische Veränderung von Strukturen auf der Ebene von Organellen, Zellen und Organen. Die Fähigkeit der Zeitraffer-Bildgebung, vierdimensionale Informationen von derselben Struktur in ihrem physiologischen Zustand zu sammeln, macht sie zu einer idealen Technik, um den dynamischen Entwicklungsprozess zu untersuchen 1,2,3,4,5,6. Die große Menge an Daten, die durch Live-Imaging gesammelt werden, ermöglicht auch die quantitative Analyse der Entwicklung. Obwohl die Zeitrafferbildgebung in größerem Umfang für einschichtige Zellkulturen verwendet wurde, ist die Bildgebung von dreidimensionalen lebenden Geweben oder Tieren aufgrund technischer Schwierigkeiten, wie z. B. der Lichtstreuung von lebendem Gewebe, der Entwicklung einer geeigneten Montagestrategie und Markierungsmethode, der Aufrechterhaltung eines normalen physiologischen Zustands während eines langen Bildgebungszeitraums, der Zugänglichkeit zu einem geeigneten Mikroskop, viel schwieriger. etc. Diese Herausforderungen schränken den Einsatz von Live-Bildgebung in vielen Laboren ein. In dieser Methodensammlung wurden in sieben Artikeln über neue Methoden der Lebendprobenvorbereitung, der Markierung und der laserbasierten Manipulation berichtet. Alle diese Methoden ermöglichen es, Entwicklungsprozesse aus verschiedenen Blickwinkeln live abzubilden.

Die direkte Bildgebung tiefer Regionen ist aufgrund der starken Streuung von lebendem Gewebe technisch anspruchsvoll. Diese Streuung kann durch die Freilegung innerer Organe durch Dissektion minimiert werden, wodurch die räumliche Auflösung der Bilder verbessert wird. In dieser Sammlung beschrieben Januschke und Loyer7 ein Protokoll zum Präparieren von Drosophila-Larvengehirnen und eine Montagemethode mit Fibrin-Gerinnseln. Diese Montagestrategie ermöglichte die Bildgebung im Zeitraffer mit inversen Mikroskopen von mehreren Proben auf derselben Schale, da nur Fibrinogen und Thrombin hinzugefügt werden mussten. Li und Luo8 präsentierten ein Protokoll für die Dissektion einer Antennen-Hirn-Explantation aus Fliegenpuppen und eine ex vivo Kulturbedingung, die die normale Entwicklung des olfaktorischen Schaltkreises für 24 Stunden aufrechterhielt. Ihr System ermöglichte die Visualisierung des axonalen und dendritischen Targetings bei der Assemblierung eines olfaktorischen Fliegenkreislaufs aus seinem physiologischen Zustand. Dieses Explantatsystem eignet sich für Zwei-Photonenmikroskope und Gitterlichtblattmikroskope mit adaptiver optikbasierter Bildgebung und ermöglicht sowohl eine kontinuierliche Langzeitbildgebung als auch eine schnelle Bildgebung mit hoher raumzeitlicher Auflösung in kurzer Zeit. Schramm et al.9 entwickelten ein minimal-invasives Operationsverfahren, um die Haut und den weichen Schädelknorpel von Zebrafischen durch Mikropeeling zu entfernen. Dies ermöglichte es ihnen, einige Schlüsselereignisse in späteren Entwicklungsstadien zu beobachten, darunter die neuronale Differenzierung, die Reifung, die Plastizität und die Transientität von Ca2+ bis zu 30 Tage nach der Befruchtung. Es ermöglichte ihnen auch, Live-Imaging nach der Pigmentierung der Haut der Zebrafischlarven durchzuführen. Neben dem Präparieren ist auch die geeignete Einbettung der Proben für die Live-Bildgebung entscheidend. Ratke et al.10 präsentierten einen experimentellen Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Fliegenembryonen mittels Lichtblattmikroskopie. Dieses Protokoll erhöhte den Gesamtdurchsatz und ist ideal für vergleichende Studien.

Neben der Probenvorbereitung ermöglichen neue Markierungsmethoden die Visualisierung spezifischer Strukturen in lebenden Geweben. Terzi et al.11 berichteten über einen genetisch kodierten H2O2-spezifischen Biosensor, roGFP2-Orp1, zur Abbildung intrazellulärer H2O2 -Spiegel von kultivierten Zebrafischneuronen und ganzen Larven während der Entwicklung. Ein wichtiger Vorteil dieses genetisch kodierten H2O2 -Biosensors war die Verbesserung der zeitlichen und räumlichen Auflösung der H2O2 -Detektion. Eine weitere Studie von Mutlu et al.12 beschrieb die stimulierte Raman-Streuung (SRS)-Mikroskopie, ein markierungsfreies chemisches Bildgebungsverfahren zum schnellen und quantitativen Nachweis von Lipiden in lebenden Zellen mit subzellulärer Auflösung. Sowohl H2O2 als auch Lipide gehen während der Probenfixierung leicht verloren. Die Entwicklung von Markierungs- oder Bildgebungsverfahren in lebendem Gewebe umging nicht nur diese Herausforderung, sondern bewahrte auch räumliche und zeitliche Informationen dieser Strukturen in biologischen Prozessen.

Schließlich kann Licht auch für die Zellablation verwendet werden. Boutillon et al.13 zeigten eine Methode, um tiefe und räumlich gut definierte Volumina im Zebrafisch mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop abzutragen. Im Vergleich zu ultravioletten Laser-basierten Zellablationen verbesserte der Zwei-Photonen-Laser die axiale Auflösung und die Gewebepenetration. Dieses Protokoll lieferte eine Störungsstrategie, um die Zell-Zell-Interaktion während der Entwicklung zu untersuchen.

Die Weiterentwicklung der mikroskopischen Technologien ermöglichte es uns, viele Entwicklungsprozesse in vier Dimensionen zu verstehen. Die Protokolle in dieser Sammlung werden mehr Wissenschaftlern helfen, die technische Barriere der Live-Bildgebung in verschiedenen biologischen Systemen zu überwinden. Wir gehen davon aus, dass in Zukunft weitere Methoden entwickelt werden, die die Live-Bildgebung ermöglichen.

Disclosures

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Der Autor hat nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Ausgabe der JoVE Method Collection wurde von NIH 1K99DC01883001 finanziert. Ich danke meinem Postdoc-Mentor Liqun Luo, meinen Mitarbeitern Eric Betzig und Tian-Ming Fu für die starke Unterstützung, um mein Interesse an der Zeitrafferbildgebung während meines Postdoc-Projekts zu entwickeln. Ich danke auch der School of Brain Science and Brain Medicine der Zhejiang University für die Rekrutierung und Unterstützung bei der Fortsetzung der Zeitraffer-Bildgebungsstudien in meinem eigenen Labor.

References

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  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
  3. Ezin, M., Fraser, S. Time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
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  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

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