Die Proteinhomöostase oder Proteostase ist von grundlegender Bedeutung für die Gesundheit von Zellen und Organismen 1,2. Konservierte zelluläre Prozesse arbeiten zusammen, um ein korrekt gefaltetes Proteom aufrechtzuerhalten, indem sie die Proteinsynthese, -faltung und -clearance beeinflussen 3,4. Störungen in der Proteostase wurden mit altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen und Krebserkrankungen in Verbindung gebracht 5,6. Aufgrund des hohen Erhaltungsniveaus haben Modellorganismen wie der Fadenwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans) maßgeblich zum Verständnis der Rolle der Proteostase für die menschliche Gesundheit und Krankheit beigetragen 7,8. C. elegans besitzt viele Eigenschaften, die es zu einem idealen Versuchsmodell machen, darunter seinen kurzen Lebenszyklus, die transparente Kutikula und die Leichtigkeit chemischer und genetischer Manipulationen9. Diese Methodensammlung bietet detaillierte Protokolle zur Überwachung von Proteostase-Ungleichgewichten auf molekularer, zellulärer und organismischer Ebene bei C. elegans.
Zellen reagieren auf Störungen in der Proteostase, indem sie eine Vielzahl von Stressreaktionen aktivieren, darunter die Hitzeschockreaktion (HSR), die entfaltete Proteinantwort (UPR) und die oxidative Stressantwort (OxSR), um das zelluläre Proteom neu einzustellen10. Um die Reproduzierbarkeit im Feld zu verbessern, werden von Golden und Kollegen standardisierte Praktiken für die robuste Induktion von HSR beschrieben11. Die RT-qPCR ist eine weit verbreitete, empfindliche Methode zur Analyse der Genexpression durch Quantifizierung von mRNA, und dieser Assay kann verwendet werden, um die zellulären mRNA-Spiegel verschiedener Hitzeschock-induzierbarer Gene zu messen11. Um diesen Ansatz auf großflächige Hochdurchsatzanalysen auszuweiten, beschreiben Chauve et al.12 eine neuartige Adaption für die cDNA-Präparation, gekoppelt an eine nanofluidische RT-qPCR-Plattform, die robust und hochempfindlich ist. Präzise Messungen der Genexpression können an einzelnen Würmern oder Massenproben durchgeführt werden12. Empfohlene Stressreaktions-Genziele sowie die Primerpaare zur Messung der transkriptionellen Hochregulation von Stressreaktionsgenen sind in den entsprechenden Protokollenaufgeführt 12,13.
Eine Einschränkung bei der Verwendung von RT-qPCR zur Beurteilung der Aktivierung von Stressreaktionen besteht darin, dass sie teuer und technisch schwierig sein kann und den Einsatz spezieller Geräte erfordert. Daher werden signalwegspezifische transkriptionelle Reporterstämme, die ein fluoreszierendes Protein unter einem stressinduzierbaren Promotor exprimieren (z. B. hsp-16.2p::gfp zur Überwachung der HSR), häufig zur Beurteilung zellulärer Stressantworten eingesetzt11. Unter Verwendung eines einfachen, auf den Fidschi-Inseln basierenden Open-Source-Workflows namens Worm-align in Verbindung mit der CellProfiler-Pipeline Worm_CP skizzieren Okkenhaug und Kollegen14 Schritte zur schnellen Quantifizierung der Fluoreszenz einzelner Würmer. Darüber hinaus beschreiben Bar-Ziv et al.13 eine Hochdurchsatzmethode mit einem Großpartikel-Durchflusszytometer, die die Erfassung von Fluoreszenzintensität, -größe und -verteilung (2D) für Tausende von Tieren ermöglicht. Informationen über transkriptionelle Reporter zur Bewertung der Aktivierung zellulärer Stressantworten sowie die empfohlenen Einstellungen für die Fluoreszenzmikroskopie und die Quantifizierung mit einem Wurm-Biosorter werden bereitgestellt13. Wichtig ist, dass diese Reporter mit spezifischen physiologischen Stress-Überlebensassays kombiniert werden können, die die Gesundheit eines Tieres nach einem spezifischen Stressregime überwachen11,13. Fluoreszierende Reporter haben zwar den Vorteil, gewebespezifische Unterschiede aufzudecken, aber sie können Induktion erst oberhalb einer bestimmten Schwelle nachweisen, und die Stabilität bestimmter Fluorophore, wie z. B. GFP, schließt den Nachweis dynamischer Variationen in der Genexpression aus. Darüber hinaus sind die meisten physiologischen Assays zeitaufwändig und daher nur begrenzt skalierbar. Trotz dieser Einschränkungen ermöglichen diese Methoden eine umfassende Charakterisierung der zellulären und physiologischen Effekte von internen und externen Stressoren.
Chronische proteotoxische Störungen sind mit dem Kollaps des Proteostase-Netzwerks (PN) verbunden, der Qualitätskontrollmaschinerie, die für die Aufrechterhaltung eines funktionellen Proteoms verantwortlich ist 5,6. Ein fortschreitender Rückgang der Proteostase wurde mit vielen altersbedingten Krankheiten in Verbindung gebracht. C. elegans ist ein großartiges Modellsystem, um die Anfälligkeit bestimmter Gewebe für Proteostase-Versagen zu untersuchen. Lazaro-Pena et al.15 beschreiben einen Ansatz zur Überwachung der Körperwandmuskulatur oder der neuronalen Funktionalität während des Alterns des Wurms. Dieser Ansatz kann für genetische Analysen mit höherem Durchsatz oder Wirkstoffscreenings angepasst werden15. Die größte Herausforderung besteht darin, zu verstehen, wie die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten des PN in vivo funktionieren. Um dieses Manko zu beheben, haben Dror und Kollegen16 ein System entwickelt, um spezifische Informationen über die Wechselwirkungen von molekularen Chaperonen, Schlüsselkomponenten des PN, in bestimmten Geweben im Laufe der Entwicklung und des Alterns zu sammeln. Durch die Kopplung gewebespezifischer Störungen des Faltungsgleichgewichts mit verfügbaren Mutanten oder transgenen Stämmen, die ein gewebespezifisches Silencing von Zielgenen durch RNAi ermöglichen, kann das Chaperonnetzwerk in einem gegebenen Gewebe untersucht werden. Die Ergänzung dieser Strategie durch einfache Verhaltensassays, die die Funktionalität bestimmter Gewebe oder Zelltypen bewerten, kann biologisch relevante Wechselwirkungen der PN in vivo aufdecken 15,16. Es ist wichtig zu erkennen, dass Proteostase-Ungleichgewichte in einem Gewebe oder Zelltyp das Qualitätskontrollsystem weiterer Gewebe auf zellunabhängige Weise beeinflussen können. Miles und van-Oosten-Hawle17 beschreiben einen Ansatz zur Identifizierung von Mechanismen und Komponenten des zellnicht-autonomen PN unter Verwendung gewebespezifischer RNAi-Ansätze, gekoppelt mit einer Reihe von Stressreportern und Proteostasesensoren17. Diese Strategie ermöglicht es, die PN-Kapazität in verschiedenen Geweben als Ergebnis zellnicht-autonom aktivierter Stressreaktionsmechanismen zu untersuchen.
C. elegans wird häufig verwendet, um altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, die durch Polyglutamin-Repeat-Expansionsmutationen verursacht werden, wie z. B. die Huntington-Krankheit18. Ein Proteostase-Sensor, der stark genutzt wird, ist ein Polyglutamin (polyQ)-Fragment, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist, das in vivo in Abhängigkeit von der PolyQ-Länge und dem Altervon 19 Jahren Herde bildet. Um die Reproduzierbarkeit in biologischen Studien, zwischen Einzelpersonen und zwischen Laboratorien zu verbessern, muss definiert werden, was als Schwerpunkte bewertet wird. Lazaro-Pena et al.15 beschreiben eine Strategie zur genauen Messung der Bildung von polyQ::YFP-Herden entweder in Neuronen oder in der Körperwandmuskulatur während des Alterns. Um die Umsatzraten des aggregationsanfälligen mutierten Huntingtin-Proteins mit einer Polyglutaminexpansion zu überwachen, beschreiben Pigazzini und Kirstein20 eine nicht-invasive Technik, die die Verwendung des photokonvertierbaren Fluorophors Dendra2 erfordert. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und eines C. elegans-Stammes, der mutiertes Huntingtin exprimiert, das mit Dendra2 fusioniert, ist es möglich, den Abbau dieses aggregationsanfälligen Proteins in einem alternden Organismus zu überwachen und zuquantifizieren 20. Zur Quantifizierung der Amyloidfibrillisierung von aggregationsanfälligen Proteinen wie mutiertem Huntingtin kann die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) eingesetzt werden21. FLIM ermöglicht die nicht-invasive Analyse des Aggregationsprozesses, indem es das Quenching von Fluorophoren in unmittelbarer Nähe von Amyloidstrukturen überwacht und dadurch die Fluoreszenzlebensdauer verkürzt21. Die Fluoreszenzlebensdauer korreliert negativ mit der Aggregation des fusionierten Amyloidproteins und ist unabhängig von der Fluorophor-Expression. Diese Technik ermöglicht es einem Forscher, die Auswirkungen des Alterns und der PN-Beeinträchtigung auf die Aggregationsneigung eines Proteins zu verfolgen. Ist die Intensität des Fluorophors jedoch gering, kann dies problematisch werden, da FLIM die Erfassung einer relativ großen Anzahl von Photonen erfordert. Daher wird eine höhere Anregungslaserleistung benötigt, was zu einem schnelleren Photobleaching und einer unzuverlässigen Zerfallskurve führt. Darüber hinaus erfordert die Technik eine ausgeklügelte und kostspielige Ausrüstung als Ergänzung zu bereits bestehenden Mikroskopiesystemen. Ein wichtiger standardisierter Ansatz ist für ein anderes Protokoll enthalten, das die repeat-assoziierte nicht-AUG-abhängige (RAN) Translation untersucht, die mit RNA assoziiert ist, die Repeat-Expansionen enthält. Da bei der RAN-Translation kein Startcodon zur Bestimmung des Leserahmens erforderlich ist, steigt die Anzahl möglicher krankheitsassoziierter toxischer Peptide. Rudich und Kollegen22 liefern Details darüber, wie die Toxizität von RAN-Peptiden anhand der Bewegung und Reproduktion von C. elegans quantifiziert werden kann.
Ungleichgewichte in der Proteostase führen zu einer Fehlfaltung von Proteinen und der Akkumulation von Proteinaggregaten, die mit mehreren altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden 5,6. C. elegans-Stämme, die verschiedene aggregationsanfällige Proteine exprimieren, die mit fluoreszierenden Reportern fusioniert sind, wurden verwendet, um Proteostase-Ungleichgewichte in verschiedenen Zell- und Gewebetypen zu überwachen. Die Analyse dieser Modelle hat zu einer Reihe neuer Beobachtungen geführt; Monica Driscoll und Kollegen stellten fest, dass Neuronen PolyQ-Aggregate und andere zelluläre Trümmer, wie z. B. beschädigte Organellen, in "Exophern" freisetzen, und entdeckten damit einen bisher unerkannten Zweig der neuronalen Proteostase23. Da es sich um ein neues Phänomen handelt, ist es von entscheidender Bedeutung, klare Anweisungen für die Überwachung der Exopherproduktion zu geben, um die Reproduzierbarkeit im Feld zu gewährleisten. Arnold et al.24 skizzieren die physikalischen Merkmale von C. elegans-Exophern, Strategien zu ihrer Erkennung, Identifizierungskriterien und den optimalen Zeitpunkt für die Quantifizierung. Darüber hinaus unterstreicht dieses Protokoll die kritische Aufmerksamkeit, die erforderlich ist, um die Wachstumsbedingungen streng zu kontrollieren, um unbeabsichtigte Belastungen zu eliminieren, die die Exopherspiegel modulieren können, um eine reproduzierbare Bewertung der Exopherproduktion zu erreichen.
Diese Sammlung bietet mehrere methodische Strategien zur Überwachung von Proteostasis-Ungleichgewichten auf molekularer, zellulärer und organismischer Ebene bei C. elegans. Stressoren, wie z. B. fehlgefaltete Krankheitsproteine, können experimentell in bestimmte Gewebetypen eingeführt werden, während die zelluläre und organismische Reaktion auf Proteotoxizität im Laufe der Zeit überwacht wird. Diese Sammlung bietet ein Toolkit für die Sondierung und Überwachung der Proteostase, die Bewertung von Qualitätskontrollsystemen, die ein gefaltetes Proteom aufrechterhalten, und die Untersuchung der Dysregulation dieser Systeme, die zu Krankheiten führt.