Methodenartikel

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

DOI:

10.3791/64644

⸱

12. Mai 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bestimmte Stimuli, wie z. B. Mikroorganismen, veranlassen Neutrophile, neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freizusetzen, bei denen es sich im Wesentlichen um netzartige Strukturen handelt, die aus DNA mit Körnerproteinen wie Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) sowie zytoplasmatischen und zytoskelettalen Proteinen bestehen. Obwohl das Interesse an NETs in letzter Zeit zugenommen hat, gibt es keine empfindliche, zuverlässige Testmethode für die Messung von NETs im klinischen Umfeld. Dieser Artikel beschreibt einen modifizierten Sandwich-Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Assay zur quantitativen Messung von zwei Komponenten zirkulierender NETs, MPO-DNA und NE-DNA-Komplexe, die spezifische Bestandteile von NETs sind und als Abbauprodukte von NETs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Der Assay verwendet spezifische monoklonale Antikörper gegen MPO oder NE als Fängerantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper. MPO oder NE bindet während der ersten Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers. Dieser Assay weist eine gute Linearität und eine hohe Präzision zwischen und innerhalb des Assays auf. Wir setzten es bei 16 Patienten mit COVID-19 und damit einhergehendem akutem Atemnotsyndrom ein und stellten fest, dass die Plasmakonzentrationen von MPO-DNA und NE-DNA signifikant höher waren als im Plasma gesunder Kontrollen. Dieser Detektionsassay ist eine zuverlässige, hochempfindliche und nützliche Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs in humanen Plasma- und Kulturüberständen.

Einleitung

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In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung der Bildung von extrazellulären Fallen (NET) in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, indem der Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet wird, um Komplexe von Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) mit DNA 1,2 nachzuweisen. NETs bestehen aus einem DNA-Rückgrat, das mit antimikrobiellen Proteasen aus neutrophilen Granula dekoriert ist 3,4. Sowohl MPO-DNA- als auch NE-DNA-Komplexe sind wichtige und spezifische Bestandteile von NETs und werden als Abbauprodukte von NETsin den extrazellulären Raum freigesetzt 3,4.

Neben ihrer wichtigen physiologischen Rolle bei der antimikrobiellen Abwehr3 haben NETs auch verschiedene pathologische Wirkungen4,5, einschließlich der Förderung der Thrombogenese6 und der Verschlechterung der Sepsis7. Dementsprechend haben NETs in letzter Zeit an Aufmerksamkeit gewonnen. Nichtsdestotrotz hat sich die In-vivo-Quantifizierung von NETs als schwierig erwiesen, da es keine empfindliche, zuverlässige quantitative Assay-Methode gibt.

Es stehen einige Methoden zur Verfügung, darunter die direkte Messung von NETs mittels Fluoreszenzmikroskopie8,9 und Durchflusszytometrie 10 sowie die indirekte Messung von zirkulierender zellfreier DNA, Nukleosomen und citrulliniertem Histon H3, aber jede Methode hat ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen11. Obwohl die immunfluoreszenzmikroskopische Methode spezifisch für NETs ist und die Lokalisation und den Grad der NET-Bildung deutlich zeigt, sind die Proben auf Biopsiegewebe und sezernierte Materialien beschränkt. Darüber hinaus muss diese Methode von erfahrenen Forschern durchgeführt werden und erfordert eine lange Zeit, bis Ergebnisse vorliegen. Die Messung der zirkulierenden Konzentrationen von NET-bezogenen Komponenten mittels Durchflusszytometrie ist einfach und liefert schnell Ergebnisse. Die Methode ist jedoch nicht spezifisch für NETs12.

Wir13 und andere 1,2 haben einen hochempfindlichen und zuverlässigen Assay entwickelt, um die zirkulierenden NET-Komponenten, MPO-konjugierte oder NE-konjugierte DNA, in menschlichem Plasma mit einer modifizierten ELISA-Technik zu messen, die spezifische Antikörper für MPO oder NE als Fangantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper verwendet. Dieser Assay kann auch ex vivo verwendet werden, um NET-Komponenten in Zellkulturüberständen zu identifizieren, die von aktivierten Neutrophilen als Reaktion auf die Stimulation von Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) freigesetzt werden.

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Protokoll

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Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von den institutionellen Prüfungsausschüssen der Medizinischen Universität Aichi genehmigt (2017-H341, 2019-H137). Von jedem Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: Für die Durchführung des Sandwich-ELISA-Assays werden die Reagenzien wie unten beschrieben vorbereitet.

  1. Puffer der Beschichtung:
    1. Zur Herstellung eines 0,1 mol/l Carbonat-Bicarbonat-Puffers werden 10,6 g wasserfreies Natriumcarbonat (Molekulargewicht, 106 g/mol) und 8,4 g Natriumbicarbonat (Molekulargewicht, 84 g/mol) abgewogen.
    2. Geben Sie es zu ca. 900 ml destilliertem Wasser in einem Becherglas.
    3. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers auf 9,6 ein, indem Sie die erforderliche Menge verdünnter Salzsäure oder Natriumhydroxid hinzufügen.
    4. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät.
    5. Fügen Sie dann das erforderliche Volumen destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu erreichen.
    6. Lagern Sie diesen 0,1 mol/L Karbonat-Bikarbonat-Puffer im Kühlschrank bei 4 °C.
  2. Blockierender Puffer:
    1. Etwa 250 μl 20%iges Natriumazid und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) werden zu 70 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gegeben, die aus 137 mmol/l NaCl, 8,1 mmol/lNa2HPO 4, 2,68 mmol/l KCl und 1,47 mol/l KH2PO 4 (pH7,4) besteht, und vorsichtig mischen.
    2. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erreichen. Die Endkonzentrationen von Rinderserumalbumin und Natriumazid betragen 1 % bzw. 0,05 %. Warten Sie 10 Minuten, dann ist die Lösung gebrauchsfertig.
  3. Waschlösung: 0,5 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol-tert-Octylphenylether (Triton X-100) in destilliertem Wasser herstellen.
    1. Verdünnen Sie 100% Triton X-100 auf 10% mit destilliertem Wasser und lassen Sie die 10%ige Lösung vor Gebrauch 1 Tag stehen.
    2. Anschließend wird die 10%ige Triton X-100-Lösung 20-fach mit destilliertem Wasser erneut verdünnt, um eine Konzentration von 0,5 % zu erreichen.
  4. Verdünnung der Antikörper:
    1. Verdünnen Sie den Fängerantikörper (Anti-MPO-Antikörper [1 mg/ml] oder Anti-NE-Antikörper [1 mg/ml]) vor der Verwendung an Tag 1 des Assays (siehe unten) im Beschichtungspuffer (pH 9,6) auf 1:2.000 und den Nachweisantikörper (Peroxidase-konjugierter Anti-DNA-Antikörper) auf 1:40 mit PBS, bevor Sie ihn an Tag 3 des Assays verwenden (siehe unten).
      HINWEIS: Für das Vorexperiment werden die Isotyp-Antikörper (IgG-Kaninchen [5 mg/ml] und IgG1-Mausklon Ci4 [0,5 mg/ml]) im Beschichtungspuffer (pH 9,6) auf 1:10.000 und 1:1.000 verdünnt.
  5. ABTS-Substratlösung: Je nach Anzahl der Proben eine, zwei oder drei 2,2'-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Tabletten in 5 ml, 10 ml oder 15 ml ABTS-Puffer (mit Natriumperborat, Zitronensäure und Dinatriumhydrogenphosphat) auflösen; pro Probe werden 100 μl benötigt. Lagern Sie die zubereitete Lösung bei 2-8 °C lichtgeschützt. Die Lösung ist bis zu 3 Monate haltbar.

2. Probenentnahme und -lagerung

  1. Plasma-Isolierung:
    1. 4 ml periphere Blutproben werden durch Venenpunktion mit einer 22-g-Spritze in ein Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen entnommen und bei 1.600 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
    2. Den Überstand in ein 2-ml-Probenröhrchen mit sicherem Verschluss überführen.
    3. Der Überstand wird bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C erneut zentrifugiert, um alle Restzellen zu entfernen.
    4. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen Probenröhrchen mit sicherer Verriegelung, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören.
    5. Lagern Sie das erhaltene Plasma bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C.
      HINWEIS: Um mit diesem Assay Ergebnisse mit hohem Durchsatz zu erzielen, sind Proben von guter Qualität erforderlich. Wenn Plasmaproben verwendet werden, führen Sie eine zweite Zentrifugation durch, um alle Restzellen zu entfernen. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen der Proben. Verwenden Sie Heparin als Antikoagulans, da EDTA die DNase-Aktivität beeinflusst.
  2. Isolierung polymorphkerniger Neutrophiler
    1. Die peripheren Blutproben werden durch Venenpunktion mit einer 22-G-Spritze in ein Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen gesammelt.
    2. 6 ml Blut werden auf 6 ml einstufige Polymorphe aufgetragen und die Röhrchen bei 1.000 x g für 45 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
    3. Entnehmen Sie die dritte Buffy-Coat-Schicht, die Neutrophile enthält, und waschen Sie sie dreimal in phenolrotfreiem RPMI-1640 bei 400 x g für 10 Minuten bei RT.
    4. Resuspendieren Sie die neutrophilen Granulozyten in phenolrotfreiem RPMI-1640, das 2 mM L-Glutamin enthält, ergänzt mit 6% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, und zählen Sie die Zellen im Mikroskopfeld mit einem Hämozytometer.
      HINWEIS: Diese Methode ergibt eine Reinheit von 96 % bis 98 % bei einer Lebensfähigkeit von mehr als 95 %, wie durch den Ausschluss des Farbstoffs Trypanblau bewertet.
  3. Aktivierung von polymorphkernigen Neutrophilen und NETose in vitro
    1. Frisch isolierte polymorphkernige Neutrophile werden auf 1 × 105 Zellen/ml in phenolrotfreiem RPMI-1640 verdünnt, das 2 mM L-Glutamin enthält, ergänzt mit 6 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, und in 35-mm-Kulturschalen ausgesät.
    2. Um NETs zu induzieren, werden polymorphkernige Neutrophile mit 25 nM PMA für 4 h bei 37 °C in 5 % CO2/95 % Luft stimuliert.
    3. Nach 4 h Inkubation werden die NETs teilweise verdaut, indem 0,6 μg/ml DNase I 15 min lang bei RT direkt in die Kulturschalen gegeben werden, und die DNase I-Aktivität durch Zugabe von 5 mM EDTA gestoppt.
    4. Das Medium, das die synthetisierten NETs enthält, wird aufgefangen und bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen.
    5. Die Überstände aus vier gesunden Kontrollen gewinnen, mischen und bis zur Verwendung bei −80 °C lagern.
      HINWEIS: DNase-verdaute PMA-stimulierte Neutrophile, die von vier gesunden Kontrollen gewonnen wurden, werden als NET-Standard 1,14,15 verwendet. Generieren Sie eine Kalibrierkurve aus einem seriell verdünnten NET-Standard mit PBS und weisen Sie die aus einem unverdünnten NET-Standard erhaltenen optischen Dichtewerte (OD) als 100% NET zu.

3. Analysemethode

HINWEIS: Die Schritte zur Durchführung des Assays werden im Folgenden ausführlich beschrieben.

  1. Tag 1
    1. Tragen Sie insgesamt 100 μl verdünnten Anti-MPO- oder Anti-NE-Antikörper mit 0,05 μg Antikörper auf jede Vertiefung der Platte, einschließlich der Blindvertiefung, auf.
      HINWEIS: Der Beschichtungspuffer darf kein Detergens enthalten, da sich die Antikörper sonst nicht gleichmäßig und gleichmäßig an die Wände der einzelnen Vertiefungen binden können. Um den Hakeneffekt zu verhindern, darf die Konzentration des Beschichtungsproteins nicht mehr als 20 μg/ml betragen, da Konzentrationen über diesem Wert die meisten verfügbaren Stellen auf der Mikrotiterplatte sättigen. Der typische Konzentrationsbereich von Proteinbeschichtungslösungen liegt bei 2-10 μg/ml. Für das vorläufige Experiment wird verdünnter Isotyp-Kontrollantikörper IgG-Kaninchen anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen MPO verwendet. Verwenden Sie verdünnte Isotyp-Kontrollantikörper IgG1-Maus für die Beschichtung anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen NE.
    2. Decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab, um die Verdunstung der Probe zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C, um die Bindung der Fängerantikörper zu ermöglichen.
  2. Tag 2
    1. Verwerfen Sie die verdünnte Antikörperlösung aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    2. Entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken klopfen.
    3. Blockieren Sie jede Vertiefung der ELISA-Platte mit 200 μl des Blockierungspuffers.
    4. Decken Sie die Platte eng mit einer selbstklebenden Plastikabdeckung ab und inkubieren Sie sie 1,5-2 Stunden lang bei RT, um die Vertiefungen zu verstopfen.
    5. Entsorgen Sie die Blockierungslösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    6. Entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken klopfen.
    7. Tragen Sie insgesamt 25 μl Plasma oder Medium auf jede Vertiefung mit Ausnahme der Leervertiefung auf und fügen Sie 75 μl PBS als Verdünnungsmittel hinzu, um das endgültige Volumen auf 100 μl zu erhöhen. 100 μl PBS in die Leervertiefung geben.
    8. Mischen Sie dann die Proben 10 s lang bei RT, indem Sie die Platte mit 250 U/min auf einen Shaker stellen.
    9. Tragen Sie 2 μl 100-fach verdünnte DNase I (0,03 mg/ml) auf jede Vertiefung auf, einschließlich der Leervertiefung (Endkonzentration von DNase I in der Reaktionsmischung: 0,6 μg/ml).
    10. Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und mischen Sie die Proben 10 s lang gründlich bei RT, indem Sie die Platte mit 250 U/min auf einen Schüttler legen.
      HINWEIS: Um die optimalen Bedingungen für die DNA-Verdauung zu bewerten, haben wir bei der Entwicklung des Assays Proben, die MPO-assoziierte DNA von Patienten mit COVID-19 enthalten, 15 Minuten lang bei RT mit 0-0,9 μg/ml DNase I inkubiert und Platten verwendet, die mit einem spezifischen Fängerantikörper für MPO oder einem speziesangepassten Isotyp-Kontrollantikörper beschichtet waren.
    11. Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten bei RT.
    12. Entfernen Sie die selbstklebende Kunststoffabdeckung und tragen Sie 1 μl 0,5 M EDTA auf jede Vertiefung auf, um die DNase-Reaktion zu stoppen.
    13. Verschließen Sie die Platte wieder mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und schütteln Sie sie 15 s lang bei RT, indem Sie sie mit 250 U/min auf einen Shaker legen.
    14. Anschließend wird die Platte über Nacht bei 4 °C inkubiert, damit sich die Proteinkomponenten der NETs an die Fängerantikörper anlagern können.
  3. Tag 3
    1. Entferne die selbstklebende Plastikabdeckung und entsorge die Lösung aus den Vertiefungen.
    2. Verwerfen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl der Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    3. Tragen Sie insgesamt 100 μl des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-DNA-Nachweisantikörpers auf jede Vertiefung auf.
    4. Verschließen Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang bei RT.
    5. Verwerfen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    6. Entfernen Sie vorsichtig die Restlösung.
    7. Tragen Sie insgesamt 100 μl ABTS-Substratlösung auf jede Vertiefung auf und decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab.
    8. Die Platte im Dunkeln bei RT 20-30 min auf einem Shaker bei 250 U/min inkubieren.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Platte in 5-Minuten-Intervallen, bis die gewünschten OD-Messwerte erreicht sind.
    9. Fügen Sie insgesamt 50 μl 2 M Schwefelsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
    10. Mischen Sie den flüssigen Inhalt der Vertiefungen, indem Sie vorsichtig auf die Seite der Platte klopfen.
    11. Schalten Sie das Mikroplatten-Lesegerät ein und schließen Sie es an den Computer an.
    12. Öffnen Sie die Softwareanwendung auf dem Computer.
    13. Erstellen Sie in der Statusleiste ein neues Experiment, und geben Sie ihm einen Namen.
    14. Stellen Sie alle folgenden Parameter für das Lesen der Platte ein: Lesetyp, Absorption; Lesemodus, Endpunkt; Wellenlängen, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisches Mischen und Ausblenden vor, Aus; Vorgelesene Platte, Aus; Automatische Kalibrierung, Ein; Streifen, ganze Platte lesen; Wellenlängenpriorität der Spalte, Priorität der Spalte; Wagengeschwindigkeit, Normal; und Automatisches Lesen, Aus.
    15. Legen Sie dann die 96-Well-Platte mit den Proben in die Schublade und schließen Sie sie.
    16. Wählen Sie abschließend die Schaltfläche Lesen , damit die Platte sofort gelesen wird.
    17. Lesen Sie die Absorption jedes Wells bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einem Mikroplatten-Reader ab (verwenden Sie in diesem Stadium eine Wellenlänge von 490 nm als Referenz).
    18. Führen Sie eine automatische Subtraktion des Absorptionswerts des Assay-Mediums allein von allen unbekannten Proben durch und speichern Sie die Daten.
      ANMERKUNG: Zur Berechnung der relativen Nettokonzentration in der Probe 1,14,15 ist eine Standardkurve zu verwenden, die aus dem seriell verdünnten NET-Standard gewonnen wurde. Hier werden die Endergebnisse als "MPO- oder NE-DNA-Komplexe (% des NET-Standards)" dargestellt. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde aus der Standardabweichung (SD) und der Steigung der Kalibrierkurve (S) wie folgt berechnet: LOD = 3,3(SD/S).

4. Statistik

  1. Führen Sie alle statistischen Analysen mit einer geeigneten statistischen Analysesoftware durch. Hier kam SigmaPlot v14.5 zum Einsatz. Prozentsätze und kontinuierliche Variablen werden aufgrund der verzerrten Verteilung der meisten Parameter als Median mit dem Interquartilsabstand angezeigt.
  2. Vergleichen Sie die MPO-DNA- und NE-DNA-Plasmaspiegel zwischen COVID-19-Patienten und gesunden Kontrollpersonen mit dem Wilcoxon-Rangsummentest. Verwenden Sie die Korrelationsanalyse, um die Beziehung zwischen der optischen Dichte und dem Prozentsatz des NET-Standards zu untersuchen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei dieser Methode wurde ein Sandwich-ELISA mit monoklonalen Anti-MPO-, Anti-NE- und Anti-DNA-Antikörpern verwendet, um MPO-assoziierte und NE-assoziierte DNA zu messen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einem MPO- oder NE-spezifischen monoklonalen Antikörper beschichtet, um DNA-assoziiertes MPO und DNA-assoziiertes NE sowie nicht-DNA-assoziiertes MPO und NE einzufangen. Zur Berechnung des Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten (CV) wurden fü...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben eine Sandwich-ELISA-Methode beschrieben, bei der MPO oder NE während der anfänglichen Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers bindet. Nach dem Waschen wird das "Sandwich" vervollständigt, indem die Proben mit einem Peroxidase-assoziierten monoklonalen Anti-DNA-Antikörper inkubiert werden. Nach der Entfernung des ungebundenen Sekundärantikörpers wird das gebundene Peroxidase-Konjugat durch Zugabe eines chromogenen ABTS-Peroxidase-Substrats detektie...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Daten, die während dieser Studie generiert und/oder analysiert wurden, sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Dr. Huq Muhammad Aminul für die Unterstützung bei der Begutachtung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Step PolymorphsAccurate Chemical and Scientific CorporationAN221725Isolierung von PMNs aus menschlichem Blut.
96-Well-MikrotiterplatteThermo Fisher Scientific467466 ABTS-Pufferlösungflachem Boden
Sigma-Aldrich Merck11 204 530 001Enthält Natriumperborat, Zitronensäure und Dinatriumhydrogenphosphat.
ABTS TablettenSigma-Aldrich Merck11 204 521 001 Jede Tablette enthält 5 mg ABTS-Substrat und 60 mg Vehikelsubstanzen.
Selbstklebende Kunststoffabdeckung, AxygenThermo Fisher Scientific14222348
Anti-MPO-AntikörperSigma-Aldrich Merck  07-496-IBei 2-8 °C lagern, 1 Jahr haltbar. Die Wirtsart ist das Kaninchen.
Anti-NE-Antikörper, Klon AHN-10Sigma-Aldrich MerckMABS4612-8 μC lagern, 1 Jahr stabil. Die Wirtsart ist die Maus.
RinderserumalbuminBiomedical ScienceBR-220700081Albumin aus Rinderfraktion V. Bei 2– lagern; 8 &°C. 2 Jahre haltbar.
DNase INew England BioLabsM0303MLagern bei -20 & Grad; C
IgG, Kaninchen, Isotyp-KontrolleGENETEX, Inc.GTX35035Als konzentrierte Lösung bei 2– lagern; 8 &°C.
IgG1, Maus-Isotyp-Steuerung, Klon Ci4Merck MABC002Als konzentrierte Lösung bei 2– lagern; 8 &°C.
Lithium-Heparin-BlutentnahmeröhrchenBecton Dickinson and Company
MikroplattenmischerAls ein UnternehmenNS-P
Microplate ReaderMolecular DevicesSpectraMax 190 Jedes Mikroplatten-Reader, das Wellenlängen von 405– 490 nm verwendet werden können.
Anwendung für Mikroplatten-ReaderMolecular DevicesSoftMax pro
Peroxidase-konjugierter Anti-DNA-Antikörper, Zelltoderkennung ELISARoche Diagnostics1154467500  Flasche 2. Lagern bei 2– 8 &°C. 1 Jahr haltbar.
Phorbol 12-Myristat-13-acetatSigma-Aldrich MerckP8139Aktivierung von PMN's aus menschlichem Blut.
Phosphatgepufferte LösungTakara BioT9181Bei Raumtemperatur lagern. Stabil für 6 Monate.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
NatriumazidFujifilm Wako Chemicals190-14901Bei Raumtemperatur lagern.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol tert-octylphenyletherFujifilm Wako Chemicals9002-93-1Bei Raumtemperatur lagern.
mit Bei

Referenzen

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