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Knochen ist ein dynamisches Gewebe, das einem kontinuierlichen Umbau unterzogen wird, an dem knochenresorbierende Osteoklasten und knochenbildende Osteoblasten beteiligt sind. Wichtig ist, dass diese Prozesse mit anderen Zellen gekoppelt sind, die sich im Knochenmarkraum befinden, wie z. B. hämatopoetische Zellen und Knochenmark-Adipozyten. Eine Unterbrechung des Knochenumsatzes führt zu einer Fragilität des Skeletts und einer anschließenden Zunahme von Frakturen1. Neuere Studien haben gezeigt, wie wichtig metabolische Substrate und der Energiestoffwechsel für die Regulierung der Knochenbildung und des Knochenabbaus sind 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. Die Ausrichtung auf Stoffwechselwege wird zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt und könnte ein provokatives Instrument sein, das zur Bekämpfung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden könnte, die zu einer erhöhten Frakturinzidenz führen18. Aus diesem Grund ist es wichtig, ein vollständiges Verständnis des Zellstoffwechsels in allen Knochenzellen zu haben. Leider ist die Untersuchung von Knochenzellen in ihrer natürlichen Umgebung aufgrund ihrer Lokalisation innerhalb des mineralisierten Gewebes eine Herausforderung. Im Vergleich zu nicht mineralisierten Geweben erschweren die erforderlichen Schritte zur Verarbeitung von Knochen molekulare und mechanistische Untersuchungen ihres metabolischen Status. Daher zielt diese Sammlung darauf ab, etablierte Techniken zur Überwachung von Stoffwechselwegen in Zellen hervorzuheben, die aus ihrer Skelettnische isoliert wurden.
"Osteoenergetik" beschreibt die Stoffwechselprozesse und das bioenergetische Potenzial von Osteoblasten und ist nach wie vor ein aktives Gebiet wissenschaftlichen Interesses und Forschungsinteresses. Bevor die Zellen jedoch in der Lage sind, ATP herzustellen und zu verwerten, müssen zunächst energetische Substrate erworben werden. Drei Artikel in dieser Sammlung beleuchten Methoden, die zur Überwachung spezifischer Substratschicksale in Knochenzellen verwendet werden. Zunächst beschreiben Shen und Karner19 Techniken zur Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Zellen in vitro oder isolierten Knochen ex vivo. Im In-vitro-System werden kultivierte ST2-Zellen für eine vorgegebene Zeit mit L-[3,4-3 H]-Glutamin inkubiert, und die Glutaminaufnahme wird mit einem Szintillationszähler quantifiziert. In ähnlicher Weise werden im Ex-vivo-System Knochen von neugeborenen Mäusen mit radioaktiv markierten Aminosäuren inkubiert, und die Aminosäureaufnahme wird mit einem Szintillationszähler geschätzt. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle und empfindliche Bewertung der Aminosäureaufnahme in Knochenzellen oder in isolierten Knochen. Wichtig ist, dass diese Methoden leicht modifizierbar sind, um verschiedene Aminosäuren oder andere energetische Substrate zu bewerten und verschiedene wissenschaftliche Fragestellungen zu testen.
Neben Aminosäuren stellen Glukose und langkettige Fettsäuren (LCFA) eine dichte Versorgung mit zellulärer Energie oder ATP dar. In dieser Eigenschaft gelangen LCFA über die Carnitin-Palmitoyltransferase (CPTI/II) in die Mitochondrien, wo sie leicht über β-Oxidation oxidiert werden und anschließend in den Tricarbonsäure (TCA) oder den oxidativen Phosphorylierungszyklus gelangen können, um ATP zu erhalten. Diese Abfolge chemischer Reaktionen führt schließlich dazu, dass Kohlenstoff als gasförmiges Kohlendioxid (CO2) freigesetzt wird, was schwer zu quantifizieren ist. Song et al. und Kim et al. beschreiben fachkundig zwei verwandte Methoden zur Messung der im Oxidationsprozess erzeugten Metaboliten 20,21. Bei beiden Techniken wird ein 14C-markiertes Kohlenstoffsubstrat und Filterpapier als "Fang"-Werkzeug verwendet, um das freigesetzte 14CO2 zu quantifizieren. Jede Methode ist jedoch gleich wichtig, da sie einzigartige Kulturgefäße und Datennormalisierungstechniken beschreibt. Darüber hinaus beschreiben Song et al.20, wie die Substratoxidation berechnet werden kann, während Kim et al.21 eine zusätzliche Methode zur Messung säurelöslicher Metaboliten einbeziehen.
Diese Rückverfolgungsstudien ermöglichen es dem Untersucher, das metabolische Schicksal verschiedener Substrate zu bestimmen. Als Ergänzung verwenden Jayapalan et al.22 Stoffwechselflussanalysen, um Stoffwechselprozesse zu überwachen, einschließlich Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung über die mitochondriale Atmung. Dieses Gerät misst grundsätzlich Sauerstoff und pH-Wert in lebenden Zellkulturen in Echtzeit. Daher kann durch die Kultivierung primärer Knochenmarkstromazellen (BMSCs) durch Osteoblastendifferenzierung eine Vielzahl von Experimenten durchgeführt werden, während die Stoffwechselwege überwachtwerden 23. Diese Technik kann mit vier verschiedenen Injektionen durchgeführt werden, was es den Forschern ermöglicht, die Experimente an spezifische wissenschaftliche Fragestellungen anzupassen und gleichzeitig standardisierte Protokolle zu befolgen, einschließlich ATP-Rate, Brennstoff-/Substratnutzung, mitochondriale Atmung und glykolytische Rate-Assays. Da viele dieser Experimente mechanistischer Natur sind, ist es unerlässlich, eine homogene Zellpopulation ohne Kontamination durch andere Zelltypen zu erhalten. Die In-vitro-Zellkultursysteme , die zur Überwachung der Stoffwechselprozesse von Knochenzellen verwendet werden, haben viele inhärente Einschränkungen. Guo und Wu24 bieten einen hervorragenden Überblick über die Einschränkungen, die bei Standard-BMSC-Kulturen auftreten, und tragen zu einer detaillierten Methode zur Anreicherung von Stromazellpopulationen und zur Minimierung der hämatopoetischen Kontamination durch Hypoxie bei.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Sammlung Techniken zur Überwachung der Substratausnutzung und der bioenergetischen Kapazität in einer Vielzahl von Skelettmodellen sowohl in vitro als auch ex vivo demonstriert. Die meisten dieser Methoden werden mit Zellkultursystemen durchgeführt und sind daher aufgrund der künstlichen Umgebung mit Einschränkungen verbunden. Es stimmt zwar, dass Primärzellen ein physiologischeres System ermöglichen, aber diese Zellen werden oft in sauerstoffreichen Medien kultiviert, die übermäßige Konzentrationen an Stoffwechselsubstraten enthalten, und manchmal sogar mit kontaminierenden Zellpopulationen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass diese mechanistischen Experimente mit zusätzlichen in vivo-Daten unterstützt werden. Nichtsdestotrotz hat sich dieses spannende Forschungsgebiet bereits als nutzbringend erwiesen. In dieser Hinsicht ist die weitere Charakterisierung von "normalen" versus pathologischen Stoffwechselprozessen eine vielversprechende wissenschaftliche Nische. Darüber hinaus eröffnet die Untersuchung der Osteoenergetik und des Stoffwechsels, um zu verstehen, wie, warum und wann Knochenzellen verschiedene Substrate verwenden und welche Auswirkungen diese auf die allgemeine Knochengesundheit haben, ein weites Feld für therapeutische Ziele. Zu diesem Zweck wurde festgestellt, dass antiresorptive Bisphosphonate der ersten Generation (d. h. Etidronat und Clodronat), die zur Behandlung von Osteoporose eingesetzt werden, die Osteoklastenen-Energetik beeinflussen. Diese häufig verschriebenen Medikamente sind ein perfektes Beispiel dafür, wie Stoffwechselwege genutzt werden können, um die allgemeine Knochengesundheit zu beeinflussen und die Lebensqualität eines Patienten zu verbessern. Zusätzlich zu den antiresorptiven Behandlungen gibt es zwei von der FDA zugelassene anabole Therapien, Teriparatid und Romosozumab, die den PTH- bzw. WNT-Signalweg aktivieren. Sowohl PTH als auch WNT stimulieren die Glutaminaufnahme und den Metabolismus in Osteoblasten 6,11,25,26. Die Hemmung der Aktivität des Glutaminstoffwechsels entweder pharmakologisch oder genetisch reduziert die Knochenbildung als Reaktion auf WNT- oder anabole PTH-Behandlungen 6,11. Daher ist eine kontinuierliche Untersuchung gerechtfertigt, um den Stoffwechsel und die Bioenergetik in Knochenzellen zu untersuchen. Die in dieser Sammlung beschriebenen Techniken bieten eine Grundlage, um verschiedene wissenschaftliche Fragestellungen im Zusammenhang mit der Osteoenergetik und dem Stoffwechsel in Knochenzellen zu beantworten.