Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Hier wird ein FRET-Protokoll vorgestellt, um die Assoziation von Histon-modifizierenden Enzymen mit Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die sie zu den Zielpromotoren für die epigenetische Regulation der Genexpression in Pflanzengeweben rekrutieren.
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Methodenartikel
Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren in vivo durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die epigenetische Regulation der Genexpression wird häufig durch histonmodifizierende Enzyme (HMEs) beeinflusst, die heterochromatische oder euchromatische Histonmarkierungen für die transkriptionelle Unterdrückung bzw. Aktivierung erzeugen. HMEs werden durch Transkriptionsfaktoren (TFs) zu ihrem Zielchromatin rekrutiert. Daher ist die Erkennung und Charakterisierung direkter Interaktionen zwischen HMEs und TFs entscheidend, um ihre Funktion und Spezifität besser zu verstehen. Diese Studien wären biologisch relevanter, wenn sie in vivo in lebendem Gewebe durchgeführt würden. Hier wird ein Protokoll zur Visualisierung von Wechselwirkungen in Pflanzenblättern zwischen einer pflanzlichen Histon-Deubiquitinase und einem Pflanzentranskriptionsfaktor mittels Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) beschrieben, das den Nachweis von Komplexen zwischen Proteinmolekülen ermöglicht, die innerhalb von <10 nm voneinander entfernt sind. Zwei Varianten der FRET-Technik werden vorgestellt: SE-FRET (sensibilisierte Emission) und AB-FRET (Akzeptorbleiche), bei der die Energie strahlenfrei vom Donor auf den Akzeptor übertragen oder vom Donor beim Photobleaching des Akzeptors strahlend emittiert wird. Sowohl SE-FRET- als auch AB-FRET-Ansätze können leicht angepasst werden, um andere Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen in planta zu entdecken.
Einleitung
Pflanzliche Histon-Deubiquitinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Genexpression durch posttranslationale Modifikation von Histonen, insbesondere durch Löschen ihrer Monoubiquitylierungsmarkierungen1. OTLD1 ist bisher eines der wenigen pflanzlichen Histon-Deubiquitinasen, die auf molekularer Ebene in Arabidopsis 2,3 charakterisiert wurden. OTLD1 entfernt Monoubiquitingruppen aus den H2B-Histonmolekülen und fördert dadurch die Entfernung oder Addition von euchromatischer Acetylierung und Methylierungsmodifikationen von H3-Histonen im ZielgenChromatin
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Protokoll
Für die vorliegende Studie wurden Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 verwendet.
1. FRET-Vektorkonstruktion
- Wählen Sie fluoreszierende Tags für das FRET-Paar Donor/Akzeptor aus.
- Verwenden Sie EGFP aus pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (siehe Materialtabelle), um den Donorvektor zu erzeugen.
- Verwenden Sie mRFP aus pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (siehe Materialtabelle), um den Akzeptorvektor zu generieren.
- Generieren Sie die Spender/Akzeptor-....
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Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt die typischen Ergebnisse eines SE-FRET-Experiments, bei dem die Zellkerne gleichzeitig in drei Kanälen (d.h. Donor GFP, Akzeptor mRFP und SE-FRET) aufgezeichnet wurden. Diese Daten wurden verwendet, um Bilder der SE-FRET-Effizienz zu erzeugen, die in einer Pseudo-Farbskala codiert sind. Auf dieser Skala entspricht der Übergang von Blau zu Rot einer Steigerung der FRET-Effizienz, einem Maß für die Protein-Protein-Nähe von 0% bis 100%. In diesem repräsentativen Experiment wur.......
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Diskussion
Dieses FRET-Protokoll ist einfach und leicht zu reproduzieren; Es erfordert auch minimale Versorgungsinvestitionen und verwendet Standardausrüstung für viele moderne Labore. Konkret zeichnen fünf technische Hauptmerkmale die Vielseitigkeit dieses Verfahrens aus. Erstens werden die FRET-Konstrukte mithilfe der ortsspezifischen Rekombination generiert, einem Klonierungsansatz, der einfach zu bedienen ist, genaue Ergebnisse liefert und im Vergleich zum herkömmlichen restriktionsenzymbasierten Klonen Zeit spart. Zweitens sin.......
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Offenlegungen
Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.
Danksagungen
Die Arbeit im Labor von V.C. wird durch Zuschüsse von NIH (R35GM144059 und R01GM50224), NSF (MCB1913165 und IOS1758046) und BARD (IS-5276-20) an V.C.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Acetosyringon (3′,5′-Dimethoxy-4&prim;-hydroxyacetophenon) | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | #214010 | |
| Bacto trypton | BD Biosciences | #211705 | |
| Bacto Hefeextrakt | BD Biosciences | #212750 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) | Zeiss | LSM900 | Jedes CLSM mit ähnlichen Fähigkeiten ist geeignet |
| EHA105 | VWR | 104013-310 | Wir verwenden den Bestand in der Citovsky Bakterienlabor-Lagerbestandssammlung |
| Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
| Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
| GV3101 | VWR | 104013-296 | Wir verwenden den Bestand in der Citovsky Bakterienlabor-Lagersammlung |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | Herbalistics Pty | RA4 oder LAB | Wir verwenden den Bestand in der Citovsky Seed Lab Lagersammlung |
| pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
| pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | Refs. 15, 28 | |
| pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | Generiert basierend auf dem Konstrukt pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (siehe Refs. 15, 28) | |
| pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | Generiert auf Basis des pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 Konstrukts | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
| Spritzen ohne Nadeln | BD | 309659 | |
| Zen Software für CLSM Imaging | Zeiss | ZEN 3.0 Version | Die Software sollte mit dem verwendeten CLSM kompatibel sein |
Referenzen
- March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
- Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes a....
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Nachdrucke und Genehmigungen
