Method Article

Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren in vivo durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer

DOI:

10.3791/64656

⸱

October 14th, 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Hier wird ein FRET-Protokoll vorgestellt, um die Assoziation von Histon-modifizierenden Enzymen mit Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die sie zu den Zielpromotoren für die epigenetische Regulation der Genexpression in Pflanzengeweben rekrutieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die epigenetische Regulation der Genexpression wird häufig durch histonmodifizierende Enzyme (HMEs) beeinflusst, die heterochromatische oder euchromatische Histonmarkierungen für die transkriptionelle Unterdrückung bzw. Aktivierung erzeugen. HMEs werden durch Transkriptionsfaktoren (TFs) zu ihrem Zielchromatin rekrutiert. Daher ist die Erkennung und Charakterisierung direkter Interaktionen zwischen HMEs und TFs entscheidend, um ihre Funktion und Spezifität besser zu verstehen. Diese Studien wären biologisch relevanter, wenn sie in vivo in lebendem Gewebe durchgeführt würden. Hier wird ein Protokoll zur Visualisierung von Wechselwirkungen in Pflanzenblättern zwischen einer pflanzlichen Histon-Deubiquitinase und einem Pflanzentranskriptionsfaktor mittels Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) beschrieben, das den Nachweis von Komplexen zwischen Proteinmolekülen ermöglicht, die innerhalb von <10 nm voneinander entfernt sind. Zwei Varianten der FRET-Technik werden vorgestellt: SE-FRET (sensibilisierte Emission) und AB-FRET (Akzeptorbleiche), bei der die Energie strahlenfrei vom Donor auf den Akzeptor übertragen oder vom Donor beim Photobleaching des Akzeptors strahlend emittiert wird. Sowohl SE-FRET- als auch AB-FRET-Ansätze können leicht angepasst werden, um andere Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen in planta zu entdecken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pflanzliche Histon-Deubiquitinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Genexpression durch posttranslationale Modifikation von Histonen, insbesondere durch Löschen ihrer Monoubiquitylierungsmarkierungen1. OTLD1 ist bisher eines der wenigen pflanzlichen Histon-Deubiquitinasen, die auf molekularer Ebene in Arabidopsis 2,3 charakterisiert wurden. OTLD1 entfernt Monoubiquitingruppen aus den H2B-Histonmolekülen und fördert dadurch die Entfernung oder Addition von euchromatischer Acetylierung und Methylierungsmodifikationen von H3-Histonen im ZielgenChromatin 4,5. Darüber hinaus interagiert OTLD1 mit einem anderen chromatinmodifizierenden Enzym, der Histon-Lysin-Demethylase KDM1C, um die transkriptionelle Unterdrückung der Zielgene 6,7 zu beeinflussen.

Die meisten Histon-modifizierenden Enzyme haben keine DNA-Bindungsfähigkeiten und können daher ihre Zielgene nicht direkt erkennen. Eine Möglichkeit ist, dass sie mit DNA-bindenden Transkriptionsfaktor-Proteinen zusammenarbeiten, die diese Enzyme binden und zu ihren Chromatinzielen leiten. Insbesondere in Pflanzen ist bekannt, dass mehrere wichtige Histon-modifizierende Enzyme (d. h. Histon-Methyltransferasen 8,9, Histonacetyltransferasen 10, Histon-Demethylasen 11 und Polycomb-Repressionskomplexe12,13,14) durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden. In Übereinstimmung mit dieser Idee wurde kürzlich ein möglicher Mechanismus für die OTLD1-Rekrutierung zu den Zielpromotoren vorgeschlagen, der auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen von OTLD1 mit einem Transkriptionsfaktor LSH1015 basiert.

LSH10 gehört zu einer Familie der pflanzlichen ALOG-Proteine (Arabidopsis LSH1 und Oryza G1), die als zentrale Entwicklungsregulatorenfungieren 16,17,18,19,20,21,22. Die Tatsache, dass die Mitglieder der ALOG-Proteinfamilie DNA-bindende Motive 23 enthalten und die Fähigkeiten zur Transkriptionsregulation22, Kernlokalisation19 und Homodimisierung24 aufweisen, unterstützt die Annahme, dass diese Proteine, einschließlich LSH10, während der epigenetischen Regulation der Transkription als spezifische Transkriptionsfaktoren wirken können. Eine der wichtigsten experimentellen Techniken zur Charakterisierung der LSH10-OTLD1-Wechselwirkung in vivo ist der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)15.

FRET ist ein bildgebendes Verfahren zur direkten Detektion von Nahbereichswechselwirkungen zwischen Proteinen innerhalb von <10 nm voneinanderentfernt von 25 lebenden Zellen. Es gibt zwei Hauptvarianten des FRET-Ansatzes26: sensibilisierte Emission (SE-FRET) (Abbildung 1A) und Akzeptorbleiche (AB-FRET) (Abbildung 1B). In SE-FRET übertragen die interagierenden Proteine - von denen eines mit einem Donorfluorochrom (z. B. grün fluoreszierendes Protein, GFP) und das andere mit einem Akzeptor Fluorochrom (z. B. monomeres rot fluoreszierendes Protein, mRFP27,28) markiert ist - nicht-strahlend die Energie des angeregten Zustands vom Donor auf den Akzeptor. Da bei dieser Übertragung keine Photonen emittiert werden, entsteht ein fluoreszierendes Signal, das ein Strahlungsemissionsspektrum ähnlich dem des Akzeptors aufweist. In AB-FRET werden Proteininteraktionen basierend auf einer erhöhten Strahlungsemission des Donors detektiert und quantifiziert, wenn der Akzeptor durch Photobleaching dauerhaft inaktiviert wird und daher nicht in der Lage ist, die vom Donor übertragene nicht-strahlende Energie zu empfangen (Abbildung 1). Wichtig ist, dass die subzelluläre Lage der FRET-Fluoreszenz auf die Lokalisation der interagierenden Proteine in der Zelle hinweist.

Die Fähigkeit, FRET in lebenden Geweben einzusetzen und die subzelluläre Lokalisation der interagierenden Proteine gleichzeitig mit dem Nachweis dieser Interaktion an sich zu bestimmen, macht FRET zur Technik der Wahl für Studien und die erste Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen in vivo. Eine vergleichbare In-vivo-Fluoreszenzbildgebungsmethode, die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC)29,30,31,32, ist ein guter alternativer Ansatz, obwohl BiFC im Gegensatz zu FRET aufgrund der spontanen Assemblierung der autofluoreszierenden BiFC-Reporter 33 falsch positive Ergebnisse erzeugen kann und die Quantifizierung seiner Daten weniger präzise ist.

Dieser Artikel teilt die erfolgreichen Erfahrungen bei der Implementierung von SE-FRET- und AB-FRET-Techniken und stellt ein Protokoll für ihren Einsatz vor, um die Wechselwirkungen zwischen OTLD1 und LSH10 in Pflanzenzellen zu untersuchen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für die vorliegende Studie wurden Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 verwendet.

1. FRET-Vektorkonstruktion

  1. Wählen Sie fluoreszierende Tags für das FRET-Paar Donor/Akzeptor aus.
    1. Verwenden Sie EGFP aus pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (siehe Materialtabelle), um den Donorvektor zu erzeugen.
    2. Verwenden Sie mRFP aus pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (siehe Materialtabelle), um den Akzeptorvektor zu generieren.
  2. Generieren Sie die Spender/Akzeptor-FRET-Konstrukte unter Verwendung einer standortspezifischen Rekombinationsklonierungstechnik34, wie dem Gateway-Rekombinationsklonierungssystem35.
    1. Amplifizieren Sie die kodierenden Sequenzen der interessierenden Proteine36 (d.h. die Arabidopsis OTLD1 und LSH10)15.
      HINWEIS: Es ist auch eine gute Idee, eine negative Kontrolle zu verwenden, die ein Homolog eines der interagierenden Proteine darstellt, aber keine Wechselwirkung zeigt; Die OTLD1-LSH10-Interaktionsstudie verwendet ein Homolog von LSH10, LSH4, das OTLD1 nicht erkennt. OTLD1-, LSH10- und LSH4-cDNAs werden mittels PCR unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Primer amplifiziert.
    2. Klonen von OTLD1, LSH10 und LSH4 in den Eintrittsvektor pDONR207 durch die ortsspezifische Rekombinationsklonierungstechnik34.
    3. Verwenden Sie das Gateway LR Clonase II (siehe Materialtabelle), um LSH10 und LSH4 von pDONR207 in den binären Zielvektor pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 zu übertragen, um die binären Donorkonstrukte p35S::LSH10-GFP (getestetes Konstrukt) und p35S::LSH4-GFP (Negativkontrolle) zu erzeugen.
    4. Verwenden Sie dasselbe kommerziell erhältliche Enzym (Schritt 1.2.3), um OTLD1 von pDONR207 in den binären Zielvektor pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 zu übertragen, um das binäre Akzeptorkonstrukt p35S:: OTLD1-mRFP (getestetes Konstrukt) zu erzeugen.
    5. PCR-amplify36 mRFP aus pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Primer, klonen Sie es durch die Rekombinationsklonierungstechnik in pDONR207 und verwenden Sie dann LR Clonase II, um mRFP in pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 zu übertragen, um das binäre Fusionskonstrukt p35S::mRFP-GFP (Positivkontrolle) zu erzeugen.
  3. Führen Sie die Umwandlung der Spender- und Akzeptorkonstrukte in Agrobacterium durch.
    1. 1 μg jedes Plasmids aus den Schritten 1.2.3-1.2.5 bis 100 μL der Kultur kompetenter Zellen des Agrobacterium tumefaciens-Stammes EHA105 oder GV3101 zugeben, die unter Verwendung der Standardprotokolle 37 hergestellt oder kommerziell gewonnen wurden, und 5 min lang bei37 °C inkubieren.
    2. 1 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt und 1% NaCl; siehe Materialtabelle) in die zuständige Zellmischung geben und bei 200 U/min und 28°C für 1,5 h rühren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 3.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,1 ml LB-Medium durch Pipettieren und verteilen Sie sie auf LB-Agar, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika (z. B. 0,01% Spectinomycin und 0,005% Rifampicin; siehe Materialtabelle). 2 Tage bei 28 °C anbauen.
    4. Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen Sie jede von ihnen separat in 1 ml LB-Brühe, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika.
    5. Die Zellen werden 24 h lang bei 28 °C gezüchtet und 0,2 ml der Kultur in ein neues Röhrchen überführt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 10.000 × g für 30 s bei Raumtemperatur gesammelt.
    6. Extraktion von Plasmid-DNA nach einem Standardprotokoll zur Isolierung von Plasmiden aus Agrobacterium-Zellen 38 und Resuspendierung der extrahierten DNA in30 μL Wasser. Um die Kolonien zu identifizieren, die die gewünschten Plasmide beherbergen, verwenden Sie 2 μL des DNA-Präparats als Vorlage für die PCR mit genspezifischen Primern, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. 0,7 ml der identifizierten Kultur mit 0,3 ml Glycerin mischen und bei -80 °C lagern.

2. Agroinfiltration

  1. Züchten Sie Nicotiana benthamiana Pflanzen.
    HINWEIS: Während des gesamten Experiments müssen alle Pflanzen gesund sein.
    1. Säen und züchten Sie N. benthamiana Samen in einem Topf mit nasser Erde in hoher Dichte.
    2. Halten Sie die gepflanzten Samen in einer Wachstumskammer bei 23 °C mit 16 h Licht und 8 h Dunkelzyklus mit 150-170 μmol/m2s Lichtintensität, bis der Durchmesser des Euphylls 0,5 cm erreicht.
    3. Die Sämlinge in größere Töpfe geben und in derselben Kammer mit den gleichen Parametern wachsen lassen.
      HINWEIS: Pflanzen sind bereit für die Agroinfiltration, wenn ihre größten Blätter einen Durchmesser von 5-7 cm haben, normalerweise innerhalb von 4-5 Wochen. In kleineren Anlagen, die zu jung sind, sind die Auswirkungen der Agroinfiltration für die FRET-Analyse zu schwerwiegend.
  2. Bereiten Sie Bakterienzellen für die Agroinfiltration vor.
    1. Jede Agrobacterium-Kolonie, die die FRET-Konstrukte enthält, züchtet über Nacht in 5 ml LB-Medium, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika (Schritt 1.3.3) und 150 μM Acetosyringon bei 28 °C (siehe Materialtabelle).
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen im Agroinfiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM Acetosyringon) auf OD600 = 0,5.
    4. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen im Verhältnis 1:1 v/v zwischen den Zellen, die die entsprechenden Konstrukte beherbergen (Schritt 2.2.5).
    5. Für die Agroinfiltrationen mit doppeltem Konstrukt mischen Sie die Aliquots zweier Kulturen und bei Agroinfiltrationen mit einem Konstrukt die Aliquots derselben Kultur:
      1. Getestete Proteine: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (Bakterien, die die Konstrukte p35S::OTLD1-mRFP und p35S::LSH10-GFP beherbergen).
      2. Negativkontrolle: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (Bakterien, die die Konstrukte p35S::OTLD1-mRFP und p35S::LSH4-GFP beherbergen).
      3. Negativkontrolle: LSH10-GFP + freies mRFP (Bakterien, die die Konstrukte p35S::LSH10-GFP und pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 beherbergen).
      4. Positivkontrolle: mRFP-GFP (Bakterien, die das p35S::mRFP-GFP-Konstrukt beherbergen).
    6. Die Zellen bei 28 °C für 0,5-1 h inkubieren.
  3. Führen Sie Agroinfiltration durch.
    1. Laden Sie die Bakterienkultur in eine 1 ml nadellose Spritze.
    2. Drücken Sie die Düse der Spritze vorsichtig, aber fest gegen die abaxiale Seite der vollständig expandierten N. benthamiana-Blätter , während Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf der adaxialen Seite halten.
    3. Infiltrieren Sie bis zu vier Flecken auf einem Blatt, drei Blätter pro Pflanze, zwei oder drei Pflanzen für jede Bakterienkultur. Wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    4. Die agroinfiltrierten Pflanzen werden 24 h bis 36 h lang unter den gleichen Bedingungen, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben, in derselben Wachstumskammer gehalten. Bewahren Sie die agroinfiltrierten Pflanzen nicht länger als 36 h auf, da dies das Fluoreszenzsignal reduziert.

3. Konfokale Mikroskopie

  1. Bereiten Sie Objektträger für die Fluoreszenzvisualisierung vor.
    1. Nach 24-36 h der Infiltration schneiden Sie jedes agroinfiltrierte Blatt mit einer Rasierklinge in kleine Stücke (2 mm x 4 mm) zwischen den Adern.
    2. Legen Sie die Blattstücke auf einen Glasobjektträger, wobei die abaxiale Blattoberfläche nach oben zeigt. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf die Blattstücke und bedecken Sie sie mit dem Deckglas. Klopfen Sie leicht auf das Deckglas, um Luftblasen zu entfernen.
    3. Schalten Sie das Mikroskop und den Laser ein (siehe Materialtabelle). Legen Sie den Objektträger in den Plattenhalter des Mikroskops, um ihn unter den spezifischen FRET-Parametern abzubilden (Schritte 3.2 und 3.3).
    4. Beginnen Sie die Beobachtungen mit einem 10-fachen Objektiv, um Zellen zu identifizieren, die sowohl das GFP- als auch das mRFP-Signal aufweisen, und verwenden Sie dann ein 40-faches Objektiv für nachfolgende detaillierte Beobachtungen.
      HINWEIS: Wichtig ist, dass SE-FRET und AB-FRET normalerweise an derselben Gewebeprobe durchgeführt werden, so dass die gleichen Kanaleinstellungen (Schritt 3.2) verwendet werden können, mit Ausnahme des FRET-Kanals, der für die SE-FRET- bzw. AB-FRET-Beobachtungen ein- bzw. ausgeschaltet wird (Schritte 3.2.2.3 und 3.3.1).
  2. Richten Sie die Parameter für SE-FRET ein (Abbildung 1A).
    1. Öffnen Sie das MDE-Tool (Multi-Dimensional Acquisition).
    2. Richten Sie einen Satz von drei konfokalen Kanälen im selben Sichtfeld ein (ergänzende Abbildung 1).
      1. Stellen Sie den Donorkanal (den GFP-Kanal) für die Anregung und Emission des Donorfluorochroms mit dem 405 nm Anregungslaser und dem 400-597 nm Emissionsfilter ein.
      2. Stellen Sie den Akzeptorkanal (den mRFP-Kanal) für die Anregung und Emission des Akzeptors Fluorochrom mit dem 561 nm Anregungslaser und dem 400-597 nm Emissionsfilter ein.
        HINWEIS: Der Emissionsfilter für mRFP wurde auf 400-597 nm eingestellt, um das mRFP-Signal vom FRET-Signal bei 597-617 nm zu trennen (Schritt 3.2.2.3) und somit die FRET-unabhängige mRFP-Emission zu reduzieren.
      3. Stellen Sie den FRET-Kanal für die Anregung des Donators und die Emission der Akzeptorfluorochrome mit dem 405 nm Anregungslaser und dem 597-617 nm Emissionsfilter ein.
    3. Stellen Sie die Anregungsintensität des Spenders auf ein Mindestniveau ein, um FRET zu beobachten und gleichzeitig Photobleaching zu vermeiden, wodurch die SE-FRET-Effizienz verringert wird.
      HINWEIS: Diese Anregungsintensität wird experimentell ausgewählt, bevor das FRET-Verfahren durchgeführt wird, um Photobleaching zu vermeiden. Es variiert je nach Blattdicke, Alter und Zeit nach Überexpression.
    4. Stimulieren Sie den Spender und suchen Sie nach Zellen, die das erwartete Fluoreszenzsignal des Akzeptors enthalten.
    5. Wählen Sie den Bereich aus, der das interessierende Fluoreszenzsignal enthält.
    6. Erfassen Sie eine SE-FRET-Bildsequenz, indem Sie die Taste "Einrasten" drücken.
      1. Bild 10-15 Zellen, die zuerst das mRFP-GFP-Konstrukt (Positivkontrolle) exprimieren; Passen Sie die Parameter für Fokus, Zoom und intelligente Verstärkung an, um sich auf den zu erfassenden Bereich zu konzentrieren (ergänzende Abbildung 2).
      2. Mit den gleichen Einstellungen stellen Sie 10-15 Zellen vor, die jeweils OTLD1-mRFP, freie mRFP, LSH10-GFP oder LSH4-GFP separat ausdrücken.
        HINWEIS: Diese Bilder werden vom Plug-in "PixFRET" von ImageJ (siehe Materialtabelle) erfasst, das für die FRET-Datenanalysen (Schritt 3.4.1) verwendet wurde, um die spektralen Durchblutungswerte (SBT) für die Akzeptoren und die Donatoren zu bestimmen. Diese Bilder werden von der Software verwendet, um die SE-FRET-Images für die OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP und LSH10-GFP + freie mRFP-Proteinpaare zu generieren (Schritt 3.2.6.3).
      3. Mit den gleichen Einstellungen stellen Sie auch 10-15 Zellen vor, die OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP und LSH10-GFP + freie mRFP-Proteinpaare koexprimieren.
  3. Richten Sie Parameter für AB-FRET ein (Abbildung 1B).
    1. Verwenden Sie die für SE-FRET eingestellten Parameter für den Donor- und Akzeptorkanal (Schritt 3.2.2), deaktivieren Sie jedoch den FRET-Kanal.
    2. Stellen Sie die Parameter für das Photobleaching des Akzeptors (mRFP) ein (ergänzende Abbildung 3).
      1. Stellen Sie sicher, dass das Bleichen nach fünf Bildern beginnt. Lassen Sie 200 Iterationen für jedes Flächenbleichmittel zu. Halten Sie 100% Laserintensität bei 561 nm.
      2. Halten Sie eine Bleichdauer von 45 s ein. Stellen Sie eine Scangeschwindigkeit von 512 x 512 Pixel bei 400 Hz sicher.
    3. Zeichne den Bereich der zu bleichenden Zelle; Zum Beispiel werden für Kernwechselwirkungen Regionen von Interesse um die gesamte Fläche des Zellkerns39 gezeichnet.
    4. Aktivieren Sie das Bleichen, indem Sie die Schaltfläche Experiment starten drücken. Wenn Sie diese Funktion aktivieren, wird das Photobleaching durchgeführt und die AB-FRET-Bildsequenz erfasst.
  4. Analysieren Sie die FRET-Daten.
    1. Verwenden Sie für die Analyse von SE-FRET-Daten das Plug-in "PixFRET" für die ImageJ-Software, um korrigierte Bilder der SE-FRET-Effizienz nach Subtraktion von SBT40 zu erzeugen (Schritt 3.2.6.2).
    2. Für die Analyse der AB-FRET-Daten berechnen Sie %AB-FRET als prozentualen Anstieg der GFP-Emission nach mRFP-Photobleiche mit der folgenden Formel41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, wobei GFPpost die GFP-Emission nach mRFP-Photobleiche und GFPpre die GFP-Emission vor der mRFP-Photobleiche ist.
    3. Achten Sie bei der Überprüfung der FRET-Bilder auf die subzelluläre Lokalisierung des FRET-Signals.
      HINWEIS: In vielen Fällen können diese zellulären Kompartimente (z. B. Zellkern, Chloroplasten, ER usw.) leicht identifiziert werden und liefern als zusätzlicher Vorteil der FRET-Technik wichtige Hinweise auf die biologische Funktion der interagierenden Proteine.

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Results

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Abbildung 2 zeigt die typischen Ergebnisse eines SE-FRET-Experiments, bei dem die Zellkerne gleichzeitig in drei Kanälen (d.h. Donor GFP, Akzeptor mRFP und SE-FRET) aufgezeichnet wurden. Diese Daten wurden verwendet, um Bilder der SE-FRET-Effizienz zu erzeugen, die in einer Pseudo-Farbskala codiert sind. Auf dieser Skala entspricht der Übergang von Blau zu Rot einer Steigerung der FRET-Effizienz, einem Maß für die Protein-Protein-Nähe von 0% bis 100%. In diesem repräsentativen Experiment wur...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses FRET-Protokoll ist einfach und leicht zu reproduzieren; Es erfordert auch minimale Versorgungsinvestitionen und verwendet Standardausrüstung für viele moderne Labore. Konkret zeichnen fünf technische Hauptmerkmale die Vielseitigkeit dieses Verfahrens aus. Erstens werden die FRET-Konstrukte mithilfe der ortsspezifischen Rekombination generiert, einem Klonierungsansatz, der einfach zu bedienen ist, genaue Ergebnisse liefert und im Vergleich zum herkömmlichen restriktionsenzymbasierten Klonen Zeit spart. Zweitens sin...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Arbeit im Labor von V.C. wird durch Zuschüsse von NIH (R35GM144059 und R01GM50224), NSF (MCB1913165 und IOS1758046) und BARD (IS-5276-20) an V.C.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetosyringon (3′,5′-Dimethoxy-4&prim;-hydroxyacetophenon)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Bacto HefeextraktBD Biosciences#212750 
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)ZeissLSM900Jedes CLSM mit ähnlichen Fähigkeiten ist geeignet
EHA105VWR104013-310Wir verwenden den Bestand in der Citovsky Bakterienlabor-Lagerbestandssammlung
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296Wir verwenden den Bestand in der Citovsky Bakterienlabor-Lagersammlung
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seedsHerbalistics PtyRA4 oder LABWir verwenden den Bestand in der Citovsky Seed Lab Lagersammlung
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/ARefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AGeneriert basierend auf dem Konstrukt pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (siehe Refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/AGeneriert auf Basis des pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 Konstrukts
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
Spritzen ohne NadelnBD309659
Zen Software für CLSM ImagingZeissZEN 3.0 VersionDie Software sollte mit dem verwendeten CLSM kompatibel sein

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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