Methodenartikel

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

DOI:

10.3791/64679

⸱

30. November 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) sind durch eine sehr variable Reihe von strukturellen Defekten und kognitiven Beeinträchtigungen gekennzeichnet, die aufgrund einer pränatalen Ethanolexposition auftreten. Aufgrund der komplexen Pathologie von FASD haben sich Tiermodelle als entscheidend für unser aktuelles Verständnis von Ethanol-induzierten Entwicklungsdefekten erwiesen. Zebrafische haben sich aufgrund des hohen Erhaltungsgrades sowohl der Genetik als auch der Entwicklung zwischen Zebrafisch und Mensch als leistungsfähiges Modell zur Untersuchung ethanolinduzierter Entwicklungsdefekte erwiesen. Als Modellsystem besitzen Zebrafische viele Eigenschaften, die sie ideal für Entwicklungsstudien machen, darunter eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, die genetisch beherrschbar und durchscheinend sind. Dies ermöglicht es den Forschern, den Zeitpunkt und die Dosierung der Ethanolexposition in mehreren genetischen Kontexten genau zu steuern. Ein wichtiges genetisches Werkzeug, das im Zebrafisch zur Verfügung steht, ist die Transgenese. Die Generierung transgener Konstrukte und die Etablierung transgener Linien kann jedoch komplex und schwierig sein. Um dieses Problem zu lösen, haben Zebrafischforscher das Transposon-basierte Tol2-Transgenesesystem etabliert. Dieses modulare System verwendet einen Multisite-Gateway-Klonierungsansatz für den schnellen Zusammenbau kompletter Tol2-Transposon-basierter transgener Konstrukte. Hier beschreiben wir die flexible Tol2-System-Toolbox und ein Protokoll zur Generierung transgener Konstrukte, die für die Zebrafisch-Transgenese und deren Verwendung in Ethanolstudien bereit sind.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die pränatale Ethanolexposition führt zu einem Kontinuum struktureller Defizite und kognitiver Beeinträchtigungen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bezeichnet werden1,2,3,4. Die komplexen Beziehungen zwischen mehreren Faktoren machen es schwierig, die Ätiologie von FASD beim Menschen zu untersuchen und zu verstehen. Um diese Herausforderung zu lösen, wurde eine Vielzahl von Tiermodellen verwendet. Die biologischen und experimentellen Werkzeuge, die in diesen Modellen zur Verfügung stehen, haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlagen der Ethanol-Teratogenität erwiesen, und die Ergebnisse dieser Modellsysteme stimmen bemerkenswert mit dem überein, was in humanen Ethanolstudien gefunden wurde 5,6. Unter diesen haben sich Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung der Ethanol-Teratogeneseentwickelt 7,8, was zum Teil auf ihre externe Befruchtung, ihre hohe Fruchtbarkeit, ihre genetische Lenkbarkeit und ihre durchscheinenden Embryonen zurückzuführen ist. Diese Stärken zusammen machen Zebrafische ideal für Echtzeit-Live-Bildgebungsstudien von FASD mit transgenen Zebrafischlinien.

Transgene Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um verschiedene Aspekte der Embryonalentwicklung zu untersuchen9. Die Herstellung transgener Konstrukte und nachfolgender transgener Linien kann jedoch äußerst schwierig sein. Ein Standard-Transgen benötigt ein aktives Promotorelement, um das Transgen anzutreiben, und ein Poly-A-Signal oder einen "Schwanz", alles in einem stabilen bakteriellen Vektor für die allgemeine Vektorerhaltung. Die traditionelle Erzeugung eines transgenen Mehrkomponentenkonstrukts erfordert mehrere zeitaufwändige Unterklonierungsschritte10. PCR-basierte Ansätze, wie z. B. die Gibson-Assemblierung, können einige der Probleme umgehen, die mit dem Subklonen verbunden sind. Für die Erzeugung jedes einzigartigen transgenen Konstrukts müssen jedoch einzigartige Primer entworfen und getestet werden10. Neben der Konstruktion von Transgenen waren auch die genomische Integration, die Übertragung der Keimbahn und das Screening auf eine ordnungsgemäße Transgenintegration schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Transposon-basierten Tol2-Transgenesesystems (Tol2Kit)10,11. Dieses modulare System nutzt das Klonen von Gateways an mehreren Standorten, um schnell mehrere transgene Konstrukte aus einer ständig wachsenden Bibliothek von "Eingangs"- und "Ziel"-Vektoren zu generieren. Integrierte Tol2-transponierbare Elemente erhöhen die Transgeneserate erheblich und ermöglichen die schnelle Konstruktion und genomische Integration mehrerer Transgene. Mit Hilfe dieses Systems zeigen wir, wie die Generierung einer endodermen transgenen Zebrafischlinie genutzt werden kann, um die gewebespezifischen strukturellen Defekte zu untersuchen, die FASD zugrunde liegen. Letztendlich zeigen wir in diesem Protokoll, dass der modulare Aufbau und die Konstruktion transgener Konstrukte die FASD-Forschung auf Zebrafischbasis sehr unterstützen werden.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Zebrafischembryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden gemäß den etablierten IACUC-Protokollen aufgezogen und gezüchtet12. Diese Protokolle wurden von der University of Louisville genehmigt.

HINWEIS: In dieser Studie wurden der Wildtyp-Zebrafischstamm AB und die Doppelmutantenlinie bmp4 st72;smad5b1100 verwendet. Das gesamte Wasser, das bei diesem Verfahren verwendet wurde, war steriles Umkehrosmosewasser. Konfokale Bilder wurden unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Die Endodermmessungen wurden mit dem Messwerkzeug in ImageJ durchgeführt. Alle statistischen Auswertungen wurden mit Hilfe einer Statistiksoftware durchgeführt.

1. Erstellen der Lösungen und Medien

  1. Bakterielle Medien: LB-Brühe oder Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers auflösen und autoklavieren. Bevor Sie das Medium in 100-mm-Petrischalen füllen, fügen Sie entweder Ampicillin (50 μg/ml), Kanamycin (50 μg/ml) oder eine Ampicillin/Chloramphenicol-Kombination (50 μg/ml bzw. 30 μg/ml) hinzu.
  2. Um 20x Embryonenmedium herzustellen, lösen Sie Folgendes in 1 l Wasser auf: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl 2, 0,41 g K 2 HPO 4, 0,142 g Na2 HPO 4 und 4,9 g MgSO4·7H2 O. Filter-sterilisieren Sie die Stammlösung mit einem 0,22-μm-Vakuumfiltrationssystem, und bei 4 °C lagern.
    Anmerkungen: Ignorieren Sie den weißen Niederschlag, der sich bildet; Dies hat keine Auswirkungen auf die Medien.
  3. In 19 l Wasser 1,2 g NaHCO3 auflösen und 1 l des 20-fachen Embryo-Media-Vorrats hinzufügen, um die funktionierende Embryo-Media-Lösung zu erzeugen, und diese Lösung bei 28 °C halten.
  4. Für eine 2%ige phenolrote Lösung werden 20 mg phenolrotes Natriumsalz in 1 ml RNase-freiem Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur gelagert.

2. Embryonen-Injektionsformen

  1. Um die Agarose-Injektionsplatte herzustellen, lösen Sie die Agarose in den Embryomedien bis zu einer Endkonzentration von 3 % auf, indem Sie sie zum Kochen bringen.
  2. Gießen Sie 50 ml Agarose in 100-mm-Petrischalen und setzen Sie, solange die Agarose noch flüssig ist, die Spritzgussform vorsichtig in die Agarose ein, um eine Blasenbildung unter der Form zu verhindern.
  3. Die Agaroseplatten abkühlen lassen. Sobald die Agarose fest ist, entfernen Sie die Spritzgussform und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.

3. Injektionspipetten

  1. Ziehen Sie 1,0 mm (OD) Kapillaren, die ein Filament enthalten, mit einem vertikalen Pipettenzieher in Nadeln, wobei der Magnet auf 2,5 und das Heizelement auf 14,6 eingestellt ist.
    Anmerkungen: Jeder beheizte Abzieher funktioniert, wenn er die Kapillaren sauber und gleichmäßig in zwei Nadeln zieht, aber die Injektionsnadeln müssen innerhalb von 1 Woche nach der Injektion der Zebrafischembryonen gezogen werden, um konsistente Injektionsergebnisse zu erzielen.
    1. Setzen Sie die Kapillare in den Abzieher ein, ziehen Sie die Klemme an jedem Ende fest und aktivieren Sie dann das Heizelement.
    2. Ziehen Sie an den Kapillaren, um zwei Injektionsnadeln zu erzeugen.
    3. Entfernen Sie die Kapillaren aus dem Abzieher und bewahren Sie sie in einer leeren Petrischale mit einem Streifen Modelliermasse auf, der als Nadelhalter dient.

4. Herstellung der Transposase-mRNA

  1. Die Tol2Kit-Plasmid-haltige Transposase wird mit einer NotI-Restriktionsendonuklease linearisiert, indem Folgendes in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert wird: 10 μl Transposase-Plasmid (150 ng/μl), 1,5 μl Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer, 0,3 μl NotI-Endonuklease.
  2. Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 μl mit RNase-freiem Wasser, mischen Sie sie und verdauen Sie sie dann über Nacht bei 37 °C.
  3. Stoppen Sie den Transposase-Aufschluss, indem Sie der Aufschlussreaktion 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μl 5 MNH4OAc und 80 μl 100 % EtOH hinzufügen und dann mischen und über Nacht bei −20 °C kühlen.
  4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000x g für 20 min bei 4 °C, saugen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie das DNA-Pellet in RNase-freiem Wasser.
  5. Bestimmen Sie die lineare Plasmidkonzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer, indem Sie zuerst 2 μl eines RNase-freien Wasserblindlings und dann 2 μl des linearisierten Plasmids laufen lassen.
    HINWEIS: Die Plasmidkonzentrationen liegen typischerweise zwischen 100-200 ng/μl
  6. Richten Sie die SP6-mRNA-Produktion ein, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen der Reihe nach kombinieren: 10 μl 2x NTP/CAP, 2 μl 10x Reaktionspuffer, 0,1-1 μg lineare DNA-Vorlage und 2 μl SP6-Enzymmischung.
  7. Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 μl mit RNase-freiem Wasser, mischen Sie sie und inkubieren Sie sie 2 h lang bei 37 °C.
  8. Nach 2 h Inkubation 1 μl DNase zugeben, gut mischen und weitere 15 min bei 37 °C inkubieren.
  9. Um die SP6-Reaktion zu stoppen, geben Sie 30 μl LiCl-Fällungslösung in das Reaktionsrohr und mischen Sie es dann und kühlen Sie es über Nacht bei −20 °C.
  10. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie dann den Überstand an und waschen Sie das mRNA-Pellet mit 1 ml 80%igem EtOH (verdünnt mit RNase-freiem Wasser).
  11. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie dann den Überstand an. Lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen.
  12. Das mRNA-Pellet wird in 20 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert, die mRNA-Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer wie in Schritt 4.5 beschrieben bestimmt (sollte mindestens 100 ng/μl betragen), 100 ng mRNA pro Röhrchen für den einmaligen Gebrauch aliquotieren und bei −80 °C lagern.
    HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die mRNA nicht abgebaut wird, können 2 μl mRNA schnell auf ein DNA-Elektrophorese-Gel aufgetragen werden, um eine einzelne Bande mit 1.950 bps zu bestätigen.

5. Multisite-Gateway-Klonierung zur Erstellung von Eingangsvektoren für die Transgenese

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Kwan et al.10 modifiziert, wobei die LR-Reaktion als Halb-LR-Reaktion und mit einem Gesamtvolumen von 5 μL geschrieben wurde. Um neue Eintrittselemente zu generieren, müssen BP-Reaktionen mit 5'-, Mittel- und 3'-Donorvektoren verwendet werden10,13.

  1. Um die Reaktion durchzuführen, sammeln Sie jeweils 10 fmol von p5E, pME und p3E und 20 fmol des Zielvektors (pDest).
    HINWEIS: Bei der Multisite-LR-Rekombination werden vier verschiedene Plasmidvektoren verwendet: ein 5'-Eintrittsvektor (p5E), ein mittlerer Eintrittsvektor (pME), ein 3'-Eintrittsvektor (p3E) und ein Zielvektor (pDest), um ein einzigartiges transgenes Konstrukt zu erzeugen, das von Tol2-Wiederholungen flankiert wird, die in Zebrafischembryonen injiziert werden können.
    1. Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren in Basenpaaren aus der Plasmidquelle (Tabelle 1, Tol2Kit Wiki Seite14 oder Addgene11; siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Bei neuartigen Vektoren kann die vollständige Plasmidsequenzierung über kommerzielle Sequenzierungsunternehmen die genaue Plasmidgröße in bps liefern.
    2. Bestimmen Sie die Konzentration aller vier Vektoren in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer, wie in Schritt 4.5 beschrieben.
    3. Berechnen Sie unter Verwendung des DNA-Gewichts von 660 g/mol und der Plasmidgröße (in bps) die gesamten Nanogramm (ng) des Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 fmol (Eintrittsvektoren) oder 20 fmol (Zielvektor) zu erreichen.
      figure-protocol-1
      HINWEIS: Das Mosimann-Labor an der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, hat eine frei verfügbare Tabelle erstellt, um die Menge des benötigten Plasmids (in ng) und das Volumen (in μL) der für die LR-Reaktion benötigten Vektoren zu berechnen15.
  2. Um das unten beschriebene Konstrukt sox17:EGFPCAAX zu erzeugen, verwenden Sie die folgenden Vektoren: einen p5E-Vektor, der den Zebrafisch-Sox17-Promotor enthält, der 6.918 bp in Größe16 hat; ein pME-Vektor, der das pränylierte EGFP enthält, das 3.345 bp in Größe10 hat; ein p3E-Vektor, der die späte Poly-A-Signalsequenz SV40 enthält, die 2.838 bp in Größe10 beträgt; und der pDest, der 5.883 bp in Größe10 beträgt.
  3. Berechnen Sie unter Verwendung der in Schritt 5.1.2 ermittelten Plasmidkonzentration und der Menge in Nanogramm (ng) für jeden Vektor (Schritt 5.1.3) die gesamten Mikroliter (μL) jedes Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 fmol (Eintrittsvektoren) oder 20 fmol (Zielvektor) zu erreichen, und teilen Sie diese dann durch zwei, um sie in den 5-μL-Halb-LR-Reaktionen zu verwenden (alle unten aufgeführten Werte sind in Tabelle 2 aufgeführt).
    figure-protocol-2
    1. Um 10 fmol p5E-sox17 zu erzeugen, verwenden Sie 45,66 ng (in einer Konzentration von 140,3 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 4, um 0,65 μl zu erhalten.
    2. Um 10 fmol pME-EGFPCAAX zu erzeugen, verwenden Sie 22,08 ng (in einer Konzentration von 213,5 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 10, um 0,52 μl zu erhalten.
    3. Um 10 fmol p3E-Poly A zu erzeugen, verwenden Sie 15,73 ng (bei einer Konzentration von 276,1 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 20, um 0,57 μl zu erhalten.
    4. Für 20 fmol des Zielvektors werden 77,66 ng pDest (in einer Konzentration von 307,3 ng/μl) verwendet und mit sterilem Wasser um den Faktor 5 verdünnt, um 1,63 μl zu erhalten.
  4. Um eine 5-μl-Halb-LR-Reaktion einzurichten, kombinieren Sie die in Schritt 5.3 bestimmten Volumina von p5E, pME, p3E und pDest in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann steriles Wasser hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 4 μl zu erreichen.
  5. Die LR-Enzymmischung 2x für jeweils 1 Minute kräftig vortexieren, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten, und dann 1 μl zur Reaktion hinzufügen und gründlich mischen.
  6. Inkubieren bei 25 °C über Nacht (16+ h).
  7. Stoppen Sie die LR-Reaktion durch Zugabe von 0,5 μl Proteinase K (2 μg/μl), inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 °C und kühlen Sie sie dann auf Raumtemperatur ab.
  8. Wandeln Sie 3-4 μl Plasmid in aufgetaute, chemisch kompetente Zellen um, indem Sie das Plasmid hinzufügen und die Zellen 25-30 Minuten auf Eis ruhen lassen.
  9. Während die Zellen auf Eis liegen, erwärmen Sie zwei LB-Ampicillin-Agarplatten auf Raumtemperatur.
  10. Hitzeschock der Zellen in einem 42°C warmen Wasserbad für genau 30 s.
  11. Nach dem Hitzeschock 250 μl antibiotikafreies, reichhaltiges flüssiges Medium in die Zellen geben und unter Schütteln bei 37 °C 1,5 h inkubieren.
  12. Verteilen Sie 300 μl Bakterien auf einer Ampicillinplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
  13. Am nächsten Morgen untersuchen Sie die Kolonien auf das Vorhandensein von zwei Phänotypen, klar und undurchsichtig, wählen Sie die klaren Kolonien (wie in Kwan et al.10 beschrieben) nacheinander aus, impfen Sie die Flüssigkultur und schütteln Sie sie dann über Nacht bei 37 °C.
    HINWEIS: Klare Kolonien enthalten fast immer die richtige LR-Kolonie (>85% der Fälle).
  14. Führen Sie mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Plasmidvorbereitung für jede Flüssigkultur durch und diagnostisch verdauen Sie jedes Plasmid, um die geeignete Größe des transgenen Konstrukts zu bestätigen, was darauf hinweist, dass die LR-Gateway-Reaktion ordnungsgemäß funktioniert hat.
  15. Die korrekten transgenen Konstrukte werden unter Verwendung des in den Schritten 5.4-5.12 beschriebenen bakteriellen Standardtransformationsprotokolls unter Verwendung von 0,5-1 μl des Plasmids erneut transformiert und nur bei 37 °C für 1 h inkubiert.
  16. Streifen Sie die Kolonien erneut und vergewissern Sie sich, dass jede das transgene LR-Konstrukt wie in Schritt 5.14 aufweist.
  17. Bestimmen Sie die Plasmidkonzentration wie in Schritt 4.5 beschrieben (für die Embryoinjektion werden mindestens 150 ng/μl benötigt).

6. Injektion des Transgens in die Embryonen

  1. Tauen Sie eine Einweg-Transposase-mRNA-Probe und ein transgenes Tol2-Konstrukt auf Eis auf und warnen Sie eine Agarose-Injektionsplatte vor Raumtemperatur.
  2. Kombinieren Sie auf Eis: 150 ng Plasmid, 100 ng Transposase-mRNA und 2 % Phenolrot (0,3 μl). Fügen Sie dann RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf 3 μl zu erhöhen.
  3. Übertragen Sie einen Embryo im Zellstadium mit Transferpipetten auf die mit EM gefüllte Injektionsplatte (siehe Schritt 2), die den Agar vollständig bedeckt, und drücken Sie dann vorsichtig etwa 50-75 Embryonen pro Schlitz der Injektionsplatte.
  4. Geben Sie das mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch in das offene Ende einer Kapillarinjektionsnadel, setzen Sie die Kapillarnadel in den Anker der Injektionsanlage ein und schalten Sie die Injektionsbohrmaschine ein.
    HINWEIS:Die Injektionsanlage verwendet komprimiertes Gas, z. B. Luft, um das gewünschte Volumen (wie in Schritt 6.5 beschrieben) des mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisches in den Embryo zu pulsieren, wenn es aktiviert wird.
  5. Senken Sie die Kapillarnadel in die EM der Injektionsplatte und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette, damit nur eine kleine Menge mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch von der Injektionsanlage abgepumpt werden kann.
  6. Injizieren Sie den Embryonen einen kleinen 3-nL-Bolus des mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisches in den Zellkörper des Embryos.
    HINWEIS: Ein Bolus von 3 nL ist ein Volumen aus mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch, bei dem theoretisch sieben Boli gleichmäßig über die Mittellinie des Embryos passen.
  7. Wenn Sie mit der Injektion fertig sind, nehmen Sie sie von der Injektionsplatte, indem Sie sie vorsichtig aus dem Schlitz nehmen und in eine 100-mm-Petrischale mit frischem EM (ca. 40 ml) pipettieren und dann bei 28,5 °C inkubieren, damit sich die Embryonen entwickeln können.

7. Screening von Embryonen auf transgene Insertion

  1. Für die Expression fluoreszierender Proteine wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium aus, in dem das fluoreszierende Transgen exprimiert werden soll, und untersuchen Sie das Vorhandensein von Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzpräparationsmikroskop.
    HINWEIS: Diese Embryonen werden in ihrer Expression mosaikartig sein und eine genomische Insertion des transgenen Konstrukts zeigen.
  2. Screening nach nicht-fluoreszierenden Transgenen durch Screening nach einem fluoreszierenden transgenen Marker (wie in Schritt 7.1 beschrieben), wie z.B. GFP, das durch den kardialen spezifischen Promotor für das Gen cmlc2 oder mCherry, der durch den linsenspezifischen Promotor von αcyrstallin gesteuert wird, die in unterschiedlichen Zielvektoren enthalten sind.
  3. Lassen Sie die Embryonen, die für die transgene Insertion positiv sind, sich vollständig zu den adulten Zebrafischstadien entwickeln.
  4. Sobald potenzielle transgene Fische das Brutalter erreicht haben, werden sie einzeln auf Keimbahnübertragung und Transgenexpressivität untersucht, indem sie mit Wildtyp-Zebrafischen verpaart werden.
  5. Diejenigen erwachsenen Tiere, deren Embryonen sich normal entwickeln und die stärkste und am besten geeignete Transgenexpression liefern, werden als einzigartige transgene Zebrafischlinien für zukünftige Arbeiten und Analysen aufbewahrt.
    HINWEIS: Als alternativen Ansatz für das Screening auf die genomische Insertion transgener Konstrukte sollten PCR-Primer entwickelt werden, die nur das transgene Konstrukt und keine Wildtyp-DNA amplifizieren.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die transgenen Konstrukte zu generieren, verwendeten wir das Tol2-Transgenese-System. Drei Eintrittsvektoren, darunter p5E, das die Genpromotor/Enhancer-Elemente enthält, pME, das das Gen enthält, das von den Promotor/Enhancer-Elementen exprimiert werden soll, und p3E, das mindestens den polyA-Schwanz enthält, wurden verwendet, um das transgene Konstrukt über Multisite-Gateway-LR-Klonierung zu generieren. Der Zielvektor pDest liefert die Tol2-Wiederholungen für die genomische Insertion des transgenen Konstruk...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafische eignen sich hervorragend, um die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf Entwicklungs- und Krankheitszustände zu untersuchen 7,8. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von durchscheinenden, extern befruchteten, genetisch beherrschbaren Embryonen, was die Live-Bildgebung mehrerer transgenmarkierter Gewebe und Zelltypen gleichzeitig in mehreren Umweltkontexten ermöglicht19,20. Diese Stärken...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 an C.B.L. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Addgene Tol2 Toolboxhttps://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
LuftDirekt von der Universität zur Verfügung gestellt
AmpicillinFisher ScientificBP1760
AnalysenwaageVWR10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID KapillareFHC30-30-0
CalciumchloridVWR97062-590
ChloramphenicolBioVision2486
EDTAFisher ScientificBP118-500
Fluoreszierendes PräpariermikroskopOlympusSZX16
KanamycinFisher ScientificBP906
Konfokales Laserscanning-MikroskopOlympusFluoview FV1000
Lawson Lab Donor Plasmid Prephttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LBAgar FisherScientific BP9724
LB BouillonFisher ScientificBP1426
Low-EEO/Mehrzweck/Molekularbiologie AgaroseFisher ScientificBP160-500
LR Clonase II Plus EnzymFisher Scientific12538200
Magnesiumsulfat (Heptahydrat)Fisher ScientificM63-500
Mikro-PipettenhalterAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungMIMPH-M-PIP
Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 mL VWR10025-724
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL VWR10025-716
MikromanipulatorAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungMM33
Mikropipettenspitzen 10 μ L Fisher Scientific13611106
Mikropipettenspitzen 1000 μ L Fisher Scientific13611127
Mikropipettenspitzen 200 μ L Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 TranskriptionskitFisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2 Berechnungsarbeitsblatthttps://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop SpektralphotometerNanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
Petrischalen 100 mm Fisher ScientificFB012924
Phenolrotes NatriumsalzSigma AldrichP4758-5G
Pipetman L p1000L MikropipetteGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MikropipetteGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MikropipetteGilsonFA10001M
KaliumchloridFisher ScientificP217-500
Kaliumphosphat (zweibasisch)VWRBDH9266-500G
DruckinjektorAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
NatriumbicarbonatVWRBDH9280-500G
NatriumchloridFisher ScientificS271-500
Natriumphosphat (zweibasisch)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 µ m Vakuum-Filtersystem MilliporeSCGPU11RE
Tol2 Wiki-Seitehttp://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top 10 der chemisch kompetenten E. coliFisher ScientificC404010
Vertikaler Pipettierer AbzieherDavid Kopf Instruments720
Zebrafisch-MikrospritzgussformAdaptive Science Toolsi34

Referenzen

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